Identificação de Inibidores EGFR e RAS utilizando elegans caenorhabditis
Summary
O nematode geneticamente tratável Caenorhabditis elegans pode ser usado como um modelo simples e barato para a descoberta de drogas. Descrito aqui é um protocolo para identificar terapêutica anticancerígenas que inibem a sinalização a jusante das proteínas RAS e EGFR.
Abstract
As alterações na localização da membrana plasmática do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e seu efeito a jusante RAS foram implicadas em várias doenças, incluindo o câncer. O nematode de vida livre C. elegans possui uma cascata de sinal map EGFR-RAS-ERK evolutiva e funcionalmente conservada que é central para o desenvolvimento da vulva. O ganho de mutações de função no homólogo RAS LET-60 e EGFR homólogo LET-23 induzem a geração de pseudovulva ectópica não-funcional visível ao longo da parede do corpo ventral desses vermes. Anteriormente, o fenótipo multivulval (Muv) nesses vermes tem se mostrado inibido por pequenas moléculas químicas. Aqui descrevemos um protocolo para o uso do worm em um ensaio à base de líquido para identificar inibidores que abolim as atividades das proteínas EGFR e RAS. Usando este ensaio, mostramos R-fendiline, um inibidor indireto de K-RAS, suprime o fenótipo Muv expresso nos vermes mutantes let-60(n1046) e let-23(sa62). O ensaio é simples, barato, não é demorado para a configuração, e pode ser usado como uma plataforma inicial para a descoberta de terapêutica anticancerígena.
Introduction
As vias celulares que regulam eventos de desenvolvimento dentro dos organismos são altamente conservadas entre todos os metazoanos. Um desses caminhos é a cascata de sinalização de proteína ativada por mitogênio EGFR-RAS-ERK (MAPK), que é um caminho crítico que rege a proliferação celular, diferenciação, migração e sobrevivência1,2. Defeitos nessa via de sinalização podem levar a estados patológicos ou de doenças, como o câncer. O receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) mostrou-se altamente expresso em tumores humanos, incluindo 50% dos carcinomas escamosos escamosos orais, e contribui para o desenvolvimento de tumores malignos3,4,5. Considerando que as mutações nos três ISoformes RAS H-, K-e N-RAS são os principais impulsionadores da transformação maligna em múltiplos cânceres humanos. Entre esses três isoformes RAS, as mutações oncogênicas em K-RAS são as mais prevalentes6,7,8. Para que o EGFR e o RAS funcionem, eles devem se localizar na membrana plasmática (PM). Prevenir a localização dessas moléculas para a PM pode revogar completamente a atividade biológica desta via de sinal9,10. Daí a inibição da localização dessas proteínas para a PM é uma estratégia terapêutica para bloquear a sinalização a jusante e os desfechos adversos resultantes. Usando um ensaio de triagem de alto teor, fendiline, um bloqueador de canal de cálcio tipo L, foi identificado como um inibidor da atividade K-RAS11. A nanoglomeragem de K-RAS ao folheto interno da PM é significativamente reduzida na presença de fendilina. Além disso, o K-RAS é redistribuído da membrana plasmática para o ânticulo endoplasmático (ER), aparelho golgi, endosários e citosol. Mais importante, a proliferação de linhas de células cancerígenas pancreáticas, cólons, pulmonares e endometrial expressando o mutante oncogênico K-RAS é bloqueada pela inibição da sinalização a jusante pela fendiline11. Esses dados sugerem funções de fendilina como um terapêutico anticâncer K-RAS específico que causa a má localização da proteína RAS ao PM.
O nematode Caenorhabditis elegans tem sido extensivamente estudado no contexto do desenvolvimento. Muitas das vias de sinal que governam o desenvolvimento do verme são evolutivas e funcionalmente conservadas. Por exemplo, a ativação mediada pelo EGFR do RAS e a ativação subsequente da cascata de sinal ERK MAPK são conservadas no worm12. A cascata é representada pelas seguintes proteínas: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. Let-60 é homólogo do RAS, enquanto o LET-23 é homólogo do EGFR. No verme, essa via regula o desenvolvimento da vulva13. A vulva é uma abertura epitelial na parede do corpo ventral do verme que permite que ovos fertilizados sejam colocados. A formação da vulva no verme depende da exposição das células precursoras vulval (VPC) a um gradiente de ativação da cascata de sinal EGFR-RAS-MAPK. Durante o desenvolvimento normal, os VPCs proximais recebem fortes sinais das células de ancoragem gonadal para se diferenciar em destinos de células 1° e 2° que dão origem a uma vulvafuncional 12. Considerando que os VPCs distal se diferenciam em destinos de células 3° que se fundem ao siníntécio hipodérmico e não formam vulva devido à sinalização esgotada. Na ausência de sinalização, todas as VPCs se diferenciam em destinos celulares 3° resultando na formação de nenhuma vulva. No entanto, a sinalização constitutiva leva à formação de uma ou mais vulva não funcionais devido à indução de todos os VPCs para assumir destinos celulares de 1° e 2°.
Mutações que causam indução vulval defeituosa ou excessiva foram identificadas para muitos dos genes que codificam proteínas que representam esse caminho. A indução vulval defeituosa resulta em um fenótipo vulvaless (Vul), enquanto a indução excessiva de vulval resulta em um fenótipo multivulva (Muv) que é representado pelo desenvolvimento de numerosos pseudovulvaos ectópicos não funcionais em toda a parede do corpo ventral. O fenótipo Muv expresso pela cepa let-60(n1046) é devido a um ganho de mutação de função no RAS, enquanto na cepa let-23(sa62) é devido a uma mutação ativadora no EGFR14,15. O forte fenótipo Muv nestas cepas mutantes tem se mostrado perturbado por intervenções farmacológicas como demonstrado pelo tratamento de vermes let-60(n1046) com o inibidor MEK-1 U012616,17. Curiosamente, mostramos que r-fendilina e inibidores que afetam o metabolismo de sphingomyelin suprimem o fenótipo Muv no verme18. Para demonstrar esses inibidores bloqueiam a sinalização let-60 ao nível do RAS, utilizou-se a cepa nula lin-1 17. Lin-1 é um fator de transcrição inibitória semelhante ao Ets que funciona como um repressor no desenvolvimento da vulva19. Forte reversão do fenótipo Muv em worms let-60(n1046) e nenhum efeito sobre vermes nulos lin-1 sugerem que essas inibições ocorrem ao nível de RAS.
Neste protocolo, demonstramos o uso de C. elegans como modelo para identificar inibidores de proteínas RAS e EGFR. Usando um ensaio à base de líquido, demonstramos os efeitos inibitórios da R-fendiline suprimindo os fenótipos Muv nas cepas mutantes let-60(n1046) e let-23(sa62) de C. elegans. Este ensaio valida o uso de C. elegans como uma ferramenta na fase inicial de descoberta de medicamentos para terapêutica anticancerígena.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os ensaios que descrevemos usando o worm são simples e baratos para identificar inibidores da função EGFR e RAS. C. elegans é um modelo atraente para a descoberta de drogas porque é fácil crescer em laboratório devido ao ciclo de vida curto (3 dias a 20 °C) e à capacidade de gerar um grande número de larvas. Mais importante, a via MAPK EGFR-RAS-ERK é evolutiva e funcionalmente conservada com mamíferos fornecendo um sistema geneticamente tratável para analisar os efeitos dos inibidores EGFR e RAS. Al…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Swathi Arur (MD Anderson Cancer Center) por fornecer o let-60(n1046). Agradecemos também ao Dr. David Reiner (Texas A&M Health Science Center Institute of Biosciences & Technology em Houston) pela cepa lin-1. Por fim, agradecemos à Dra. Algumas cepas de vermes foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Esta pesquisa foi apoiada pelo Instituto de Prevenção e Pesquisa do Câncer do Texas (CPRIT) conceder RP200047 à JF Hancock.
Materials
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Millipore Sigma | A9539-50G | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium pPhosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| R-Fendiline | Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade) | ||
| Sodium Azide | Millipore Sigma | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | Bleach | ||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| (−)-Tetramisole Hydrochloride | Millipore Sigma | L9756 | |
| UO126 (MEK inhibitor) | Millipore Sigma | 19-147 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| 12- Well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 50-197-4804 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| E. coli OP50 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| MT2124 | let-60(n1046) IV. | CGC | |
| MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
| PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |
Riferimenti
- Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
- Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway. Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).
- Grandis, J. R., Tweardy, D. J. Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer. Ricerca sul cancro. 53 (15), 3579-3584 (1993).
- Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review. International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).
- Stransky, N., et al. The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma. Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).
- Bos, J. L. ras oncogenes in human cancer: a review. Ricerca sul cancro. 49 (17), 4682-4689 (1989).
- Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).
- Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Ricerca sul cancro. 72 (10), 2457-2467 (2012).
- Hancock, J. F. Ras proteins: different signals from different locations. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).
- Hancock, J. F., Parton, R. G. Ras plasma membrane signalling platforms. Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).
- van der Hoeven, D., et al. Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).
- Moghal, N., Sternberg, P. W. The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans. Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).
- Sundaram, M. V. RTK/Ras/MAPK signaling. WormBook. , 1-19 (2006).
- Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetica. 110 (1), 17-72 (1985).
- Katz, W. S., et al. A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog. Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).
- Hara, M., Han, M. Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).
- Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo. Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).
- van der Hoeven, D., et al. Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function. Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).
- Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway. Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
- Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes. Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).
- Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans. Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).
