Identifizierung von EGFR- und RAS-Inhibitoren mittels Caenorhabditis elegans
Summary
Der genetisch traktierbare Fadenwurm Caenorhabditis elegans kann als einfaches und kostengünstiges Modell für die Wirkstoffforschung verwendet werden. Hier wird ein Protokoll zur Identifizierung von Krebsmedikamenten beschrieben, die die nachgeschaltete Signalübertragung von RAS- und EGFR-Proteinen hemmen.
Abstract
Die Veränderungen in der Plasmamembranlokalisierung des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) und seines nachgeschalteten Effektors RAS wurden mit mehreren Krankheiten einschließlich Krebs in Verbindung gebracht. Der freilebende Fadenwurm C. elegans besitzt eine evolutionäre und funktionell konservierte EGFR-RAS-ERK MAP-Signalkaskade, die für die Entwicklung der Vulva zentral ist. Der Gewinn von Funktionsmutationen im RAS-Homolog LET-60 und EGFR-Homolog LET-23 induziert die Erzeugung von sichtbaren nicht-funktionellen ektopischen Pseudovulva entlang der ventralen Körperwand dieser Würmer. Bisher wurde gezeigt, dass der multivulvale (Muv) Phänotyp in diesen Würmern durch kleine chemische Moleküle gehemmt wird. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Verwendung des Wurms in einem flüssigkeitsbasierten Assay, um Inhibitoren zu identifizieren, die die Aktivitäten von EGFR- und RAS-Proteinen aufheben. Mit diesem Assay zeigen wir, dass R-Fendalin, ein indirekter Inhibitor von K-RAS, den Muv-Phänotyp unterdrückt, der in den mutierten Würmern let-60(n1046) und let-23(sa62) exprimiert wird. Der Assay ist einfach, kostengünstig, nicht zeitaufwendig einzurichten und kann als erste Plattform für die Entdeckung von Krebstherapeutika verwendet werden.
Introduction
Die zellulären Wege, die Entwicklungsereignisse innerhalb von Organismen regulieren, sind bei allen Metazoen hoch konserviert. Ein solcher Signalweg ist die EGFR-RAS-ERK-Signalkaskade (MITOGEN Activated Protein Kinase( MAPK), die ein kritischer Signalweg ist, der die Zellproliferation, Differenzierung, Migration und das Überleben steuert1,2. Defekte in diesem Signalweg können zu pathologischen oder Krankheitszuständen wie Krebs führen. Der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) hat sich in menschlichen Tumoren, einschließlich 50% der oralen Plattenepithelkarzinome, als hoch exprimiert erwiesen und trägt zur Entwicklung bösartiger Tumoren bei3,4,5. Während Mutationen in den drei RAS-Isoformen H-, K- und N-RAS wichtige Treiber für die maligne Transformation bei mehreren menschlichen Krebsarten sind. Unter diesen drei RAS-Isoformen sind onkogene Mutationen in K-RAS am häufigsten6,7,8. Damit EGFR und RAS funktionieren, müssen sie auf der Plasmamembran (PM) lokalisiert werden. Die Verhinderung der Lokalisierung dieser Moleküle zum PM kann die biologische Aktivität dieses Signalwegs vollständig aufheben9,10. Daher ist die Hemmung der Lokalisation dieser Proteine zum PM eine therapeutische Strategie, um die nachgelagerte Signalübertragung und die daraus resultierenden unerwünschten Ergebnisse zu blockieren. Mit einem High-Content-Screening-Assay wurde Fendilin, ein L-Typ-Kalziumkanalblocker, als Inhibitor der K-RAS-Aktivität11identifiziert. Die Nanoclusterung von K-RAS auf das innere Blättchen des PM wird in Gegenwart von Fendilin signifikant reduziert. Darüber hinaus wird K-RAS von der Plasmamembran auf das endoplasmatische Retikulum (ER), den Golgi-Apparat, die Endosomen und das Zytosol umverteilt. Noch wichtiger ist, dass die Proliferation von Bauchspeicheldrüsen-, Dickdarm-, Lungen- und Endometriumkarzinomzelllinien, die onkogene mutierte K-RAS exprimieren, durch die Hemmung der nachgeschalteten Signalübertragung durch Fendilin11blockiert wird. Diese Daten deuten darauf hin, dass Fendilin als spezifisches K-RAS-Antikrebstherapeutikum fungiert, das die Fehllokalisierung des RAS-Proteins auf das PM verursacht.
Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans wurde im Kontext der Entwicklung umfassend untersucht. Viele der Signalwege, die die Entwicklung im Wurm steuern, sind evolutionär und funktionell konserviert. Beispielsweise bleibt die EGFR-vermittelte Aktivierung von RAS und die anschließende Aktivierung der ERK-MAPK-Signalkaskade im Wurm12erhalten. Die Kaskade wird durch folgende Proteine dargestellt: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 ist homolog zu RAS, während LET-23 homolog zu EGFR ist. Im Wurm reguliert dieser Weg die Entwicklung der Vulva13. Die Vulva ist eine epitheliale Öffnung an der ventralen Körperwand des Wurms, die es ermöglicht, befruchtete Eier zu legen. Die Bildung der Vulva im Wurm ist abhängig von der Exposition der Vulvavorläuferzellen (VPC) gegenüber einem Aktivierungsgradienten der EGFR-RAS-MAPK-Signalkaskade. Während der normalen Entwicklung erhalten die proximalen VPCs starke Signale von den Gonadenankerzellen, um sich in 1° und 2° Zellschicksale zu differenzieren, die zu einer funktionellen Vulvaführen 12. Während sich distale VPCs in 3° Zellschicksale differenzieren, die mit dem hypodermalen Synzytium verschmelzen und aufgrund erschöpfter Signalübertragung keine Vulva bilden. In Ermangelung einer Signalübertragung differenzieren sich alle VPCs in 3° Zellschicksale, was zur Bildung keiner Vulva führt. Die konstitutive Signalgebung führt jedoch zur Bildung einer oder mehrerer nichtfunktionaler Vulva aufgrund der Induktion aller VPCs, 1° und 2° Zellschicksale anzunehmen.
Mutationen, die eine fehlerhafte oder übermäßige Vulvainduktion verursachen, wurden für viele der Gene identifiziert, die für Proteine kodieren, die diesen Weg repräsentieren. Eine defekte Vulvainduktion führt zu einem vulvalosen (Vul) Phänotyp, während eine übermäßige Vulvainduktion zu einem Multivulva (Muv) Phänotyp führt, der durch die Entwicklung zahlreicher nichtfunktioneller ektopischer Pseudovulvae in der gesamten ventralen Körperwand dargestellt wird. Der Muv-Phänotyp, der durch den let-60(n1046)-Stamm exprimiert wird, ist auf einen Gewinn der Funktionsmutation in RAS zurückzuführen, während er im let-23(sa62)-Stamm auf eine aktivierende Mutation in EGFR14,15zurückzuführen ist. Es wurde gezeigt, dass der starke Muv-Phänotyp in diesen mutierten Stämmen durch pharmakologische Eingriffe gestörtwird,wie die Behandlung von let-60(n1046)-Würmern mit dem MEK-1-Inhibitor U012616,17gezeigt hat. Interessanterweise haben wir gezeigt, dass R-Fendilin und Inhibitoren, die den Sphingomyelin-Stoffwechsel beeinflussen, den Muv-Phänotyp im Wurm unterdrücken18. Um zu demonstrieren, dass diese Inhibitoren die Let-60-Signalisierung auf RAS-Ebene blockieren, wurde der Lin-1-Nullstamm verwendet 17. Lin-1 ist ein Ets-like inhibitorischer Transkriptionsfaktor, der als Repressor bei der Entwicklung der Vulva19 fungiert. Eine starke Reversion des Muv-Phänotyps bei let-60(n1046)-Würmern und keine Wirkung auf Lin-1-Nullwürmer deuten darauf hin, dass diese Hemmungen auf der Ebene von RAS auftreten.
In diesem Protokoll demonstrieren wir die Verwendung von C. elegans als Modell zur Identifizierung von Inhibitoren von RAS- und EGFR-Proteinen. Mit einem flüssigkeitsbasierten Assay demonstrieren wir die hemmende Wirkung von R-Fendilin, indem wir die Muv-Phänotypen in den let-60(n1046) und let-23(sa62) mutanten Stämmen von C. elegansunterdrücken. Dieser Assay validiert die Verwendung von C. elegans als Werkzeug in der Anfangsphase der Wirkstoffforschung für Krebstherapeutika.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Assays, die wir mit dem Wurm beschreiben, sind einfach und kostengünstig, um Inhibitoren der EGFR- und RAS-Funktion zu identifizieren. C. elegans ist ein attraktives Modell für die Wirkstoffforschung, da es aufgrund des kurzen Lebenszyklus (3 Tage bei 20 °C) und der Fähigkeit, eine große Anzahl von Larven zu erzeugen, leicht im Labor zu züchten ist. Noch wichtiger ist, dass der EGFR-RAS-ERK-MAPK-Signalweg evolutionär und funktionell konserviert wird, wobei Säugetiere ein genetisch handhabbares System…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Swathi Arur (MD Anderson Cancer Center) für die Bereitstellung der let-60 (n1046). Wir danken auch Dr. David Reiner (Texas A & M Health Science Center Institute of Biosciences & Technology in Houston) für den Lin-1-Stamm. Schließlich danken wir Dr. Danielle Garsin und ihrem Labor (The University of Texas, McGovern Medical School) für die Bereitstellung einiger der Reagenzien. Einige Wurmstämme wurden vom CGC zur Verfügung gestellt, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird. Diese Forschung wurde durch das Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) Stipendium RP200047 an JF Hancock unterstützt.
Materials
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Millipore Sigma | A9539-50G | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium pPhosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| R-Fendiline | Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade) | ||
| Sodium Azide | Millipore Sigma | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | Bleach | ||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| (−)-Tetramisole Hydrochloride | Millipore Sigma | L9756 | |
| UO126 (MEK inhibitor) | Millipore Sigma | 19-147 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| 12- Well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 50-197-4804 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| E. coli OP50 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| MT2124 | let-60(n1046) IV. | CGC | |
| MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
| PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |
Riferimenti
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