Identification des inhibiteurs de l’EGFR et du SRA à l’aide de Caenorhabditis elegans
Summary
Le nématode génétiquement traitable Caenorhabditis elegans peut être utilisé comme modèle simple et peu coûteux pour la découverte de médicaments. Décrit ici est un protocole pour identifier les thérapies anticancéreux qui inhibent la signalisation en aval des protéines RAS et EGFR.
Abstract
Les changements dans la localisation de la membrane plasmique du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) et de son effecteur en aval RAS ont été impliqués dans plusieurs maladies, y compris le cancer. Le nématode libre C. elegans possède une cascade de signaux MAP EGFR-RAS-ERK évolutive et fonctionnellement conservée qui est centrale pour le développement de la vulve. Gain de mutations fonctionnelles dans l’homologue RAS LET-60 et l’homologue EGFR LET-23 induisent la génération de pseudovulva ectopique non fonctionnelle visible le long de la paroi ventrale du corps de ces vers. Auparavant, il a été démontré que le phénotype multivulval (Muv) de ces vers était inhibé par de petites molécules chimiques. Nous décrivons ici un protocole d’utilisation du ver dans un test à base de liquide pour identifier les inhibiteurs qui abolissent les activités des protéines EGFR et RAS. En utilisant ce test, nous montrons que la R-fendiline, un inhibiteur indirect de K-RAS, supprime le phénotype Muv exprimé dans les vers mutants let-60(n1046) et let-23(sa62). Le test est simple, peu coûteux, ne prend pas de temps à mettre en place et peut être utilisé comme plate-forme initiale pour la découverte de thérapies anticancéreux.
Introduction
Les voies cellulaires qui régulent les événements de développement au sein des organismes sont hautement conservées chez tous les métazoaires. L’une de ces voies est la cascade de signalisation de la protéine kinase activée par le mitogène EGFR-RAS-ERK (MAPK) qui est une voie critique qui régit la prolifération, la différenciation, la migration et la survie des cellules1,2. Les défauts de cette voie de signalisation peuvent conduire à des états pathologiques ou pathologiques tels que le cancer. Le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) s’est avéré être fortement exprimé dans les tumeurs humaines, y compris 50% des carcinomes épidermoïdes oraux, et contribue au développement de tumeurs malignes3,4,5. Alors que les mutations dans les trois isoformes RAS H-, K- et N-RAS sont des moteurs majeurs de la transformation maligne dans de multiples cancers humains. Parmi ces trois isoformes RAS, les mutations oncogènes dans K-RAS sont les plus répandues6,7,8. Pour que l’EGFR et le RAS fonctionnent, ils doivent se localiser dans la membrane plasmique (PM). Empêcher la localisation de ces molécules dans le PM peut complètement abroger l’activité biologique de cette voie designalisation 9,10. Par conséquent, l’inhibition de la localisation de ces protéines dans le PM est une stratégie thérapeutique pour bloquer la signalisation en aval et les résultats indésirables qui en résultent. À l’aide d’un test de dépistage à haute teneur, la fendiline, un inhibiteur des canaux calciques de type L, a été identifiée comme un inhibiteur de l’activitéK-RAS 11. Le nanograppement de K-RAS dans la feuille interne du PM est considérablement réduit en présence de fendiline. En outre, K-RAS est redistribué de la membrane plasmique au réticulum endoplasmique (RE), à l’appareil de Golgi, aux endosomes et au cytosol. Plus important encore, la prolifération des lignées cellulaires cancéreuses du pancréas, du côlon, du poumon et de l’endomètre exprimant le mutant oncogène K-RAS est bloquée par l’inhibition de la signalisation en aval par la fendiline11. Ces données suggèrent que la fendiline fonctionne comme un traitement anticancéreux K-RAS spécifique qui provoque la mauvaise localisation de la protéine RAS dans le PM.
Le nématode Caenorhabditis elegans a fait l’objet d’études approfondies dans le contexte du développement. De nombreuses voies de signalisation qui régissent le développement du ver sont évolutives et fonctionnellement conservées. Par exemple, l’activation de RAS médiée par l’EGFR et l’activation ultérieure de la cascade de signaux ERK MAPK sont conservées dans le ver12. La cascade est représentée par les protéines suivantes : LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 est homologue à RAS, tandis que LET-23 est homologue à EGFR. Chez le ver, cette voie régule le développement de la vulve13. La vulve est une ouverture épithéliale sur la paroi ventrale du corps du ver qui permet la ponte d’œufs fécondés. La formation de la vulve dans le ver dépend de l’exposition des cellules précurseurs vulvaires (VPC) à un gradient d’activation de la cascade de signaux EGFR-RAS-MAPK. Au cours du développement normal, les VPC proximaux reçoivent des signaux forts des cellules d’ancrage gonadique pour se différencier en destins cellulaires de 1° et 2° qui donnent lieu à une vulve fonctionnelle12. Alors que les VPC distaux se différencient en destins cellulaires à 3° qui fusionnent avec le syncytium hypodermique et ne forment pas de vulve en raison de l’épuisement de la signalisation. En l’absence de signalisation, tous les VPC se différencient en destins cellulaires à 3°, ce qui entraîne la formation d’aucune vulve. Cependant, la signalisation constitutive conduit à la formation d’une ou plusieurs vulves non fonctionnelles en raison de l’induction de tous les VPC pour supposer des destins cellulaires de 1° et 2°.
Des mutations qui provoquent une induction vulvaire défectueuse ou excessive ont été identifiées pour de nombreux gènes qui codent pour les protéines représentant cette voie. Une induction vulvaire défectueuse entraîne un phénotype sans vulve (Vul), tandis qu’une induction vulvaire excessive entraîne un phénotype multivulve (Muv) qui est représenté par le développement de nombreuses pseudovulvaes ectopiques non fonctionnelles dans toute la paroi ventrale du corps. Le phénotype Muv exprimé par la souche let-60(n1046) est dû à un gain de mutation fonctionnelle dans RAS, tandis que dans la souche let-23(sa62) il est dû à une mutation activatrice dans EGFR14,15. Il a été démontré que le phénotype Muv fort dans ces souches mutantes est perturbé par des interventions pharmacologiques, comme l’a démontré le traitement des vers let-60 (n1046) avec l’inhibiteur MEK-1 U012616,17. Fait intéressant, nous avons montré que la R-fendiline et les inhibiteurs qui affectent le métabolisme de la sphingomyéline suppriment le phénotype Muv dans le ver18. Pour démontrer que ces inhibiteurs bloquent la signalisation let-60 au niveau du RAS, la souche nulle lin-1 a été utilisée17. Lin-1 est un facteur de transcription inhibiteur de type Ets qui fonctionne comme un répresseur dans le développement de la vulve19. Une forte réversion du phénotype Muv chez les vers let-60(n1046) et aucun effet sur les vers nuls lin-1 suggèrent que ces inhibitions se produisent au niveau du RAS.
Dans ce protocole, nous démontrons l’utilisation de C. elegans comme modèle pour identifier les inhibiteurs des protéines RAS et EGFR. À l’aide d’un test à base de liquide, nous démontrons les effets inhibiteurs de la R-fendiline en supprimant les phénotypes Muv dans les souches mutantes let-60(n1046) et let-23(sa62) de C. elegans. Ce test valide l’utilisation de C. elegans comme outil dans la phase initiale de la découverte de médicaments pour les thérapies anticancéreux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les tests que nous décrivons à l’aide du ver sont simples et peu coûteux pour identifier les inhibiteurs de la fonction EGFR et RAS. C. elegans est un modèle attrayant pour la découverte de médicaments car il est facile à cultiver en laboratoire en raison du cycle de vie court (3 jours à 20 ° C) et de la capacité de générer un grand nombre de larves. Plus important encore, la voie EGFR-RAS-ERK MAPK est conservée de manière évolutionnaire et fonctionnelle avec des mammifères fournissant un syst?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Swathi Arur (MD Anderson Cancer Center) d’avoir fourni le let-60(n1046). Nous remercions également le Dr David Reiner (Texas A&M Health Science Center Institute of Biosciences & Technology à Houston) pour la souche lin-1. Enfin, nous remercions la Dre Danielle Garsin et son laboratoire (Université du Texas, McGovern Medical School) d’avoir fourni certains des réactifs. Certaines souches de vers ont été fournies par la CCG, qui est financée par le NiH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Cette recherche a été soutenue par la subvention RP200047 du Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) à JF Hancock.
Materials
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Millipore Sigma | A9539-50G | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium pPhosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| R-Fendiline | Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade) | ||
| Sodium Azide | Millipore Sigma | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | Bleach | ||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| (−)-Tetramisole Hydrochloride | Millipore Sigma | L9756 | |
| UO126 (MEK inhibitor) | Millipore Sigma | 19-147 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| 12- Well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 50-197-4804 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| E. coli OP50 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| MT2124 | let-60(n1046) IV. | CGC | |
| MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
| PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |
Riferimenti
- Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
- Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway. Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).
- Grandis, J. R., Tweardy, D. J. Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer. Ricerca sul cancro. 53 (15), 3579-3584 (1993).
- Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review. International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).
- Stransky, N., et al. The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma. Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).
- Bos, J. L. ras oncogenes in human cancer: a review. Ricerca sul cancro. 49 (17), 4682-4689 (1989).
- Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).
- Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Ricerca sul cancro. 72 (10), 2457-2467 (2012).
- Hancock, J. F. Ras proteins: different signals from different locations. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).
- Hancock, J. F., Parton, R. G. Ras plasma membrane signalling platforms. Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).
- van der Hoeven, D., et al. Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).
- Moghal, N., Sternberg, P. W. The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans. Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).
- Sundaram, M. V. RTK/Ras/MAPK signaling. WormBook. , 1-19 (2006).
- Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetica. 110 (1), 17-72 (1985).
- Katz, W. S., et al. A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog. Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).
- Hara, M., Han, M. Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).
- Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo. Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).
- van der Hoeven, D., et al. Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function. Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).
- Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway. Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
- Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes. Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).
- Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans. Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).
