Caenorhabditis elegans kullanılarak EGFR ve RAS inhibitörlerinin tanımlanması
Summary
Genetik olarak çekilebilir nematod Caenorhabditis elegans, ilaç keşfi için basit ve ucuz bir model olarak kullanılabilir. Burada, RAS ve EGFR proteinlerinin aşağı akış sinyalini engelleyen antikanser terapötiklerini tanımlamak için bir protokol açıklanmıştır.
Abstract
Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ve aşağı akış efektörü RAS’ın plazma membran lokalizasyonundaki değişiklikler kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklara karışmıştır. Serbest yaşayan nematod C. elegans, vulvanın gelişimi için merkezi olan evrimsel ve işlevsel olarak korunmuş bir EGFR-RAS-ERK MAP sinyal kaskadına sahiptir. RAS homolog LET-60 ve EGFR homolog LET-23’te fonksiyon mutasyonlarının kazanılması, bu solucanların ventral vücut duvarı boyunca görünür işlevsiz ektopik psödoovulva üretimine neden olur. Daha önce, bu solucanlardaki multivulval (Muv) fenotipinin küçük kimyasal moleküller tarafından inhibe edildiği gösterilmiştir. Burada, EGFR ve RAS proteinlerinin faaliyetlerini kaldıran inhibitörleri tanımlamak için solucanı sıvı bazlı bir testte kullanma protokolünü açıklıyoruz. Bu tahlilleri kullanarak, K-RAS’ın dolaylı bir inhibitörü olan R-fendiline’in let-60(n1046) ve let-23(sa62) mutant solucanlarında ifade edilen Muv fenotipini baskıladığını gösteriyoruz. Test basit, ucuz, kurulum için zaman alıcı değildir ve antikanser terapötiklerin keşfi için bir başlangıç platformu olarak kullanılabilir.
Introduction
Organizmalar içindeki gelişimsel olayları düzenleyen hücresel yollar tüm metazoanlar arasında oldukça korunmuştır. Bu yollardan biri EGFR-RAS-ERK mitojen aktive protein kinaz (MAPK) hücre çoğalması, farklılaşma, göç ve sağkalım1,2yöneten kritik bir yol olan çağlayan sinyaldir. Bu sinyal yollarındaki kusurlar patolojik veya kanser gibi hastalık durumlarına yol açabilir. Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR), oral skuamöz hücreli karsinomların % 50’si de dahil olmak üzere insan tümörlerinde yüksek oranda eksprese edildiğini ve malign tümörlerin gelişimine katkıda bulunduğunu göstermiştir3,4,5. Üç RAS izoformu H-, K ve N-RAS’daki mutasyonlar birden fazla insan kanserinde kötü huylu dönüşümün başlıca iticileridir. Bu üç RAS izoformu arasında, K-RAS’daki onkojenik mutasyonlar en yaygın6,7,8 ‘dir. EGFR ve RAS’ın çalışması için plazma membranını (PM) lokalize etmeleri gerekir. Bu moleküllerin PM’ye lokalizasyonunu önlemek, bu sinyal yolu9,10’unbiyolojik aktivitesini tamamen yok edebilir. Bu nedenle, bu proteinlerin PM’ye lokalizasyonunun inhibisyonu, aşağı akış sinyalini ve ortaya çıkan olumsuz sonuçları engellemek için terapötik bir stratejidir. Yüksek içerikli bir tarama tahlilleri kullanılarak, L tipi kalsiyum kanal bloker olan fendiline, K-RAS aktivitesinin inhibitörü olarak tanımlanmıştır11. K-RAS’ın PM’nin iç broşürüne nanokütlesi, fendilin varlığında önemli ölçüde azalır. Ayrıca, K-RAS plazma zarından endoplazmik retikülüse (ER), Golgi aparatına, endozomlara ve sitozollere yeniden dağıtılır. Daha da önemlisi, onkojenik mutant K-RAS’ı ifade eden pankreas, kolon, akciğer ve endometriyal kanser hücre hatlarının çoğalması, fendiline11ile aşağı akış sinyalinin inhibisyonu ile engellenir. Bu veriler, fendiline’in RAS proteininin PM’ye yanlış lokalizasyonuna neden olan belirli bir K-RAS antikanser terapötik olarak işlev gösterdiğini göstermektedir.
Nematod Caenorhabditis elegans gelişim bağlamında kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Solucandaki gelişimi yöneten sinyal yollarının çoğu evrimsel ve işlevsel olarak korunmuş. Örneğin, RAS’ın EGFR aracılı aktivasyonu ve erk MAPK sinyal basamaklamanın daha sonra etkinleştirilmesi solucan12‘de korunur. Basamak aşağıdaki proteinlerle temsil edilir: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 RAS için homolog, LET-23 ise EGFR için homologdur. Solucanda, bu yol vulva gelişimini düzenler13. Vulva, solucanın ventral vücut duvarında döllenmiş yumurtaların döşenmesini sağlayan epitel bir diyaframdır. Solucandaki vulva oluşumu, vulval öncül hücrelerin (VPC) EGFR-RAS-MAPK sinyal basamaklanmasının aktivasyonuna maruz kalmasına bağlıdır. Normal gelişim sırasında, proksimal VPC’ler, fonksiyonel birvulva12’ye yol açan 1° ve 2 ° hücre kaderlerine farklılaşmak için gonadal çapa hücrelerinden güçlü sinyaller alır. Distal VPC’ler hipodermal senkryuma kaynaşan ve tükenmiş sinyaller nedeniyle vulva oluşturmayan 3° hücre kaderlerine farklılık sağlar. Sinyalizasyonun yokluğunda, tüm VPC’ler 3 ° hücre kaderlerine farklılaşarak vulva oluşumuna neden olur. Bununla birlikte, konsitülatif sinyalleme, tüm VPC’lerin 1° ve 2° hücre kaderlerini üstlenme indüksiyonu nedeniyle bir veya daha fazla işlevsel olmayan vulva oluşumuna yol açar.
Bu yolu temsil eden proteinleri kodlayan genlerin birçoğu için kusurlu veya aşırı vulval indüksiyona neden olan mutasyonlar tanımlanmıştır. Kusurlu vulval indüksiyon vulvasız (Vul) bir fenotiple sonuçlanırken, aşırı vulval indüksiyon ventral vücut duvarı boyunca çok sayıda işlevsiz ektopik psödoovulvanın gelişmesiyle temsil edilen multivulva (Muv) fenotip ile sonuçlanır. Let-60(n1046) suşu tarafından ifade edilen Muv fenotipi RAS’daki fonksiyon mutasyonunun kazanıcılığından kaynaklanırken, let-23(sa62) suşunda EGFR14,15‘te aktive edici bir mutasyondan kaynaklanmaktadır. Bu mutant suşlarındaki güçlü Muv fenotipinin, let-60(n1046) solucanlarının MEK-1 inhibitörü U0126 16 ,17ile tedavisinde gösterildiği gibi farmakolojik müdahalelerle pertüre olduğu gösterilmiştir. İlginçtir ki, sphingomyelin metabolizmasını etkileyen R-fendilin ve inhibitörlerin solucandaki Muv fenotipini baskıladığını gösterdik18. Bu inhibitörlerin RAS seviyesinde let-60 sinyalini engellediğini göstermek için lin-1 boş suşukullanılmıştır 17. Lin-1, vulva19’ungelişiminde bir baskılayıcı olarak işlev gösteren Ets benzeri bir inhibitör transkripsiyon faktörüdür. Let-60(n1046) solucanlarında Muv fenotipinin güçlü bir şekilde geri çevrilmesi ve lin-1 null solucanlar üzerinde hiçbir etkisi olmaması, bu inhibisyonların RAS düzeyinde gerçekleştiğini göstermektedir.
Bu protokolde, RAS ve EGFR proteinlerinin inhibitörlerini tanımlamak için C. elegans’ın bir model olarak kullanıldığını gösteriyoruz. Sıvı bazlı bir tahlil kullanarak, C. elegans’ın let-60(n1046) ve let-23(sa62) mutant suşlarındaki Muv fenotiplerini bastırarak R-fendilin inhibitör etkilerini gösteriyoruz. Bu test, antikanser terapötikler için ilaç keşfinin ilk aşamasında C. elegans’ın bir araç olarak kullanılmasını doğrulamaz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Solucanı kullanarak tarif ettiğimiz tahliller, EGFR ve RAS fonksiyonunun inhibitörlerini tanımlamak için basit ve ucuzdur. C. elegans ilaç keşfi için çekici bir modeldir, çünkü kısa yaşam döngüsü (20 ° C’de 3 gün) ve çok sayıda larva üretme yeteneği nedeniyle laboratuvarda büyümek kolaydır. Daha da önemlisi, EGFR-RAS-ERK MAPK yolu, EGFR ve RAS inhibitörlerinin etkilerini analiz etmek için genetik olarak çekişli bir sistem sağlayan memeliler ile evrimsel ve işlevsel olarak korunur…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Swathi Arur’a (MD Anderson Kanser Merkezi) let-60(n1046)sağladığı için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. David Reiner’a (Houston’daki Texas A&M Sağlık Bilimleri Merkezi Biyobilimler ve Teknoloji Enstitüsü) lin-1 suşu için teşekkür ederiz. Son olarak, Dr. Danielle Garsin’e ve laboratuvarına (Teksas Üniversitesi, McGovern Tıp Fakültesi) bazı reaktifleri sağladıkları için teşekkür ederiz. Bazı solucan suşları, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlanmıştır. Bu Araştırma, Teksas Kanser Önleme ve Araştırma Enstitüsü (CPRIT) tarafından JF Hancock’a RP200047 hibesi ile desteklendi.
Materials
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Millipore Sigma | A9539-50G | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium pPhosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| R-Fendiline | Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade) | ||
| Sodium Azide | Millipore Sigma | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | Bleach | ||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| (−)-Tetramisole Hydrochloride | Millipore Sigma | L9756 | |
| UO126 (MEK inhibitor) | Millipore Sigma | 19-147 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| 12- Well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 50-197-4804 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| E. coli OP50 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| MT2124 | let-60(n1046) IV. | CGC | |
| MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
| PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |
Riferimenti
- Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
- Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway. Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).
- Grandis, J. R., Tweardy, D. J. Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer. Ricerca sul cancro. 53 (15), 3579-3584 (1993).
- Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review. International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).
- Stransky, N., et al. The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma. Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).
- Bos, J. L. ras oncogenes in human cancer: a review. Ricerca sul cancro. 49 (17), 4682-4689 (1989).
- Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).
- Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Ricerca sul cancro. 72 (10), 2457-2467 (2012).
- Hancock, J. F. Ras proteins: different signals from different locations. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).
- Hancock, J. F., Parton, R. G. Ras plasma membrane signalling platforms. Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).
- van der Hoeven, D., et al. Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).
- Moghal, N., Sternberg, P. W. The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans. Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).
- Sundaram, M. V. RTK/Ras/MAPK signaling. WormBook. , 1-19 (2006).
- Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetica. 110 (1), 17-72 (1985).
- Katz, W. S., et al. A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog. Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).
- Hara, M., Han, M. Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).
- Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo. Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).
- van der Hoeven, D., et al. Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function. Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).
- Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway. Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
- Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes. Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).
- Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans. Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).
