זיהוי מעכבי EGFR ו- RAS באמצעות אלגנים של Caenorhabditis
Summary
אלגנס נמטודה מתיחה גנטית Caenorhabditis יכול לשמש מודל פשוט וזול לגילוי תרופות. מתואר כאן פרוטוקול לזיהוי טיפולי נגדים המעכבים את האיתות במורד הזרם של חלבוני RAS ו- EGFR.
Abstract
השינויים לוקליזציה קרום פלזמה של קולטן גורם גדילה אפידרמלי (EGFR) ואת המחולל במורד הזרם שלה RAS היו מעורבים במספר מחלות כולל סרטן. הנמטודה C. elegans החיים החופשיים מחזיקה מפל אות EGFR-RAS-ERK MAP אבולוציוני ומשומר מבחינה תפקודית, שהוא מרכזי להתפתחות הפות. רווח של מוטציות פונקציה בהומולוגיה RAS LET-60 ו EGFR הומולוג LET-23 לגרום לדור של פסאודובולבה חוץ רחמית לא מתפקדת גלויה לאורך דופן הגוף הגחון של תולעים אלה. בעבר, פנוטיפ multivulval (Muv) בתולעים אלה הוכח להיות מעוכב על ידי מולקולות כימיות קטנות. כאן אנו מתארים פרוטוקול לשימוש בתולעת ב- assay מבוסס נוזל כדי לזהות מעכבים שמבטלים את הפעילות של חלבוני EGFR ו- RAS. באמצעות מטען זה, אנו מראים R-פנדלין, מעכב עקיף של K-RAS, מדכא את פנוטיפ Muv לידי ביטוי let-60(n1046) ו let-23(sa62) תולעים מוטנטיות. הבדיקה היא פשוטה, זולה, אינה גוזלת זמן להתקנה, וניתן להשתמש בה כפלטפורמה ראשונית לגילוי טיפולי נגד נגד.
Introduction
המסלולים התאיים המסדירים אירועים התפתחותיים בתוך אורגניזמים נשמרים מאוד בקרב כל metazoans. מסלול אחד כזה הוא EGFR-RAS-ERK מיטוגן מופעל חלבון קינאז (MAPK) איתות מפל שהוא מסלול קריטי השולט התפשטות תאים, בידול, הגירה והישרדות1,2. פגמים במסלול איתות זה יכולים להוביל מצבים פתולוגיים או מחלות כגון סרטן. קולטן גורם הגדילה האפידרמלי (EGFR) הראה שהוא בא לידי ביטוי רב בגידולים אנושיים, כולל 50% של קרצינומות תאיקשקשאוראליים, ותורם להתפתחות גידולים ממאירים 3,4,5. בעוד מוטציות בשלושת איזופורמים RAS H-, K- ו- N-RAS הם מניעים עיקריים לשינוי ממאיר בסרטן אנושי מרובה. בין אלה שלושה isoforms RAS, מוטציות oncogenic ב K-RAS הם הנפוצים ביותר6,7,8. כדי ש-EGFR ו-RAS יפעלו, הם חייבים להתאים את קרום הפלזמה (PM). מניעת לוקליזציה של מולקולות אלה לראש הממשלה יכולה לעצור לחלוטין את הפעילות הביולוגית של מסלול איתות זה9,10. מכאן עיכוב של לוקליזציה של חלבונים אלה לראש הממשלה היא אסטרטגיה טיפולית כדי לחסום את איתות במורד הזרם ואת התוצאות השליליות וכתוצאה מכך. באמצעות בדיקת סינון בעלת תוכן גבוה, פנדלין, חוסם תעלות סידן מסוג L, זוהה כמעכב של פעילות K-RAS11. ננו-הכללה של K-RAS לעלון הפנימי של ראש הממשלה מצטמצמת באופן משמעותי בנוכחות פנדילין. יתר על כן, K-RAS מופץ מחדש מקרום הפלזמה לרטיקולום אנדופלסמי (ER), מנגנון גולגי, אנדוזומים וציטוסול. חשוב מכך, התפשטות של קווי תאים סרטניים בלבלב, המעי הגס, הריאות וארירית הרחם המבטאות מוטציה אונקוגנית K-RAS נחסמת על ידי עיכוב של איתות במורד הזרם על ידי פנדלין11. נתונים אלה מציעים פנדלין פונקציות כמו טיפול נגד K-RAS ספציפי שגורם לוקליזציה שגויה של חלבון RAS לראש הממשלה.
אלגנס מנמודה Caenorhabditis נחקר בהרחבה בהקשר של התפתחות. רבים מנתולי האות השולטים בהתפתחות התולעת הם אבולוציוניים ושמורבים מבחינה תפקודית. לדוגמה, ההפעלה המתווכת של EGFR של RAS וההפעלה הבאה של מפל האות ERK MAPK נשמרים בתולעת12. המפל מיוצג על ידי החלבונים הבאים: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 הוא הומולוגי ל RAS, בעוד LET-23 הוא הומולוגי EGFR. בתולעת, מסלול זה מסדיר את התפתחות הפות13. הפות הוא צמצם אפיתל על דופן הגוף הגחון של התולעת המאפשרת להניח ביצים מופרות. היווצרות הפות בתולעת תלויה בחשיפה של תאי המבשר הפותיים (VPC) למעבר צבע של הפעלת מפל האות EGFR-RAS-MAPK. במהלך ההתפתחות הרגילה, VPCs הפרוקסימלי לקבל אותות חזקים מתאי עוגן gonadal להבדיל לתוך 1° ו 2° גורל תאים אשר מעוררים פותפונקציונלית 12. בעוד ש-VPCs דיסטליים מבדילים לגורלי תאים של 3° שמתמזגים לסנכרון ההיפודרמלי ואינם יוצרים פות עקב איתות מדולדל. בהיעדר איתות, כל ה-VPCs מבדילים לגורל תאים של 3° וכתוצאה מכך נוצרים פות. עם זאת, איתות מהווה גורם מוביל להיווצרות פות אחת או יותר שאינה פונקציונלית בשל האינדוקציה של כל ה-VPN להניח גורל תא של 1° ו-2°.
מוטציות הגורמות אינדוקציה פות פגומה או מוגזמת זוהו עבור רבים מהגנים המקודדים חלבונים המייצגים מסלול זה. אינדוקציה פות פגומה גורמת פנוטיפ vulvaless (Vul), בעוד אינדוקציה פות מוגזמת תוצאות פנוטיפ multivulva (Muv) המיוצג על ידי התפתחות של פסאודוטובה חוץ רחמית לא מתפקדת רבים לאורך דופן הגוף הגחון. ה פנוטיפ Muv לידי ביטוי על ידי זן let-60(n1046) נובע רווח של מוטציה פונקציה ב RAS, בעוד בזן let-23(sa62) זה נובע מוטציה מפעילה EGFR14,15. פנוטיפ Muv חזק בזנים מוטנטיים אלה הוכח להיות מוטרד על ידי התערבויות פרמקולוגיות כפי שהוכח על ידי הטיפול של let-60(n1046) תולעים עם מעכב MEK-1 U012616,17. מעניין, הראינו כי R-פנדלין ומעכבים המשפיעים על חילוף החומרים של sphingomyelin לדכא את פנוטיפ Muv בתולעת18. כדי להדגים מעכבים אלה לחסום let-60 איתות ברמה של RAS, זן האפס lin-1 כבר מנוצל17. Lin-1 הוא גורם שעתוק מעכב דמוי Ets המתפקד כמדכא בהתפתחות הפות19. חזרה חזקה של פנוטיפ Muv בתולעים let-60(n1046) ואין השפעה על תולעים ריקות lin-1 מציע כי עכבות אלה מתרחשים ברמה של RAS.
בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את השימוש ב- C. elegans כמודל לזיהוי מעכבים של חלבוני RAS ו- EGFR. באמצעות מצודה מבוססת נוזלים, אנו מדגימים את ההשפעות המעכבות של R-fendiline על ידי דיכוי פנוטיפים Muv ב let-60(n1046) ו let-23(sa62) זנים מוטנטיים של C. elegans. הבדיקה הזו מאמתת את השימוש ב- C. elegans ככלי בשלב הראשוני של גילוי תרופות לטיפולים נגד.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההסתה שאנו מתארים באמצעות התולעת היא פשוטה וזולה לזיהוי מעכבים של פונקציית EGFR ו- RAS. C. elegans הוא מודל אטרקטיבי לגילוי סמים כי זה קל לגדול במעבדה בשל מחזור החיים הקצר (3 ימים ב 20 °C (20 °C) ואת היכולת לייצר מספר גדול של זחלים. חשוב מכך, מסלול EGFR-RAS-ERK MAPK נשמר מבחינה אבולוציונית ותפקודית עם יונקים…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר סוואטי ארור (MD אנדרסון מרכז הסרטן) על מתן let-60(n1046). אנו מודים גם לד”ר דיוויד ריינר (המכון למדעי הבריאות בטקסס A&M ביו-מדע וטכנולוגיה ביוסטון) על זן הלין-1. לבסוף, אנו מודים לד”ר דניאל גארסין ולמעבדה שלה (אוניברסיטת טקסס, בית הספר לרפואה מקגוורן) על שסיפקו חלק מהריגנטים. כמה זני תולעת סופקו על ידי CGC, אשר ממומן על ידי משרד NIH של תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). מחקר זה נתמך על ידי המכון למניעת סרטן ומחקר של טקסס (CPRIT) מענק RP200047 JF הנקוק.
Materials
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Millipore Sigma | A9539-50G | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium pPhosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| R-Fendiline | Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade) | ||
| Sodium Azide | Millipore Sigma | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | Bleach | ||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| (−)-Tetramisole Hydrochloride | Millipore Sigma | L9756 | |
| UO126 (MEK inhibitor) | Millipore Sigma | 19-147 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| 12- Well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 50-197-4804 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| E. coli OP50 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| MT2124 | let-60(n1046) IV. | CGC | |
| MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
| PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |
Riferimenti
- Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
- Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway. Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).
- Grandis, J. R., Tweardy, D. J. Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer. Ricerca sul cancro. 53 (15), 3579-3584 (1993).
- Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review. International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).
- Stransky, N., et al. The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma. Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).
- Bos, J. L. ras oncogenes in human cancer: a review. Ricerca sul cancro. 49 (17), 4682-4689 (1989).
- Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).
- Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Ricerca sul cancro. 72 (10), 2457-2467 (2012).
- Hancock, J. F. Ras proteins: different signals from different locations. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).
- Hancock, J. F., Parton, R. G. Ras plasma membrane signalling platforms. Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).
- van der Hoeven, D., et al. Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).
- Moghal, N., Sternberg, P. W. The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans. Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).
- Sundaram, M. V. RTK/Ras/MAPK signaling. WormBook. , 1-19 (2006).
- Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetica. 110 (1), 17-72 (1985).
- Katz, W. S., et al. A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog. Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).
- Hara, M., Han, M. Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).
- Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo. Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).
- van der Hoeven, D., et al. Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function. Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).
- Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway. Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
- Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes. Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).
- Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans. Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).
