Identifikation af EGFR- og RAS-hæmmere ved hjælp af Caenorhabditis-eliminer
Summary
Den genetisk tractable nematode Caenorhabditis elegans kan bruges som en enkel og billig model for lægemiddelforskning. Beskrevet her er en protokol til at identificere anticancerterapi, der hæmmer downstream-signalering af RAS- og EGFR-proteiner.
Abstract
Ændringerne i plasmamembranlokaliseringen af den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) og dens downstream-effektor RAS har været involveret i flere sygdomme, herunder kræft. Den fritlevende nematode C. elegans besidder en evolutionær og funktionelt bevaret EGFR-RAS-ERK MAP signalkaskade, som er central for udviklingen af vulva. Forstærkning af funktionsmutationer i RAS homolog LET-60 og EGFR homolog LET-23 fremkalder generering af synlig ikke-funktionel ektopisk pseudovulva langs disse ormes ventrale kropsvæg. Tidligere har den multivulval (Muv) fænotype i disse orme vist sig at være hæmmet af små kemiske molekyler. Her beskriver vi en protokol for brug af ormen i en væskebaseret analyse til at identificere hæmmere, der afskaffer aktiviteterne i EGFR- og RAS-proteiner. Ved hjælp af denne analyse viser vi R-fendiline, en indirekte hæmmer af K-RAS, undertrykker Muv-fænotypen udtrykt i let-60(n1046) og let-23(sa62) mutantorme. Analysen er enkel, billig, er ikke tidskrævende at sætte op, og kan bruges som en indledende platform for opdagelsen af anticancer terapi.
Introduction
De cellulære veje, der regulerer udviklingsmæssige begivenheder inden for organismer, er stærkt bevaret blandt alle metazoaner. En sådan vej er EGFR-RAS-ERK mitogen aktiveret protein kinase (MAPK) signalering kaskade, som er en kritisk vej, der styrer cellespredning, differentiering, migration og overlevelse1,2. Defekter i denne signalering vej kan føre til patologiske eller sygdomstilstande såsom kræft. Den epidermale vækstfaktor receptor (EGFR) har vist sig at være stærkt udtrykt i menneskelige tumorer, herunder 50% af oral squamous celle karcinomer, og bidrager til udviklingen af ondartede tumorer3,4,5. Mens mutationer i de tre RAS isoformer H-, K- og N-RAS er vigtige drivkræfter for ondartet transformation i flere humane kræftformer. Blandt disse tre RAS isoformer, onkogene mutationer i K-RAS er mestudbredte 6,7,8. For at EGFR og RAS kan fungere, skal de lokaliseres til plasmamembranen (PM). Forebyggelse af lokalisering af disse molekyler til PM kan helt ophæve den biologiske aktivitet af denne signalvej9,10. Derfor hæmning af lokalisering af disse proteiner til PM er en terapeutisk strategi for at blokere downstream signalering og de deraf følgende negative resultater. Ved hjælp af en screeningsanalyse med højt indhold blev fendiline, en L-type calciumkanalblokker, identificeret som en hæmmer af K-RAS-aktivitet11. Nanohobning af K-RAS til pm’ens indvendige folder reduceres betydeligt i nærværelse af fendiline. Desuden omfordeles K-RAS fra plasmamembranen til det endoplasmiske reticulum (ER), Golgi-apparatur, endosomer og cytosol. Endnu vigtigere er det, at spredningen af bugspytkirtel-, tyktarms-, lunge- og endometriekræftcellelinjer, der udtrykker onkogen mutant K-RAS, blokeres af hæmningen af downstream-signalering ved fendiline11. Disse data tyder fendiline fungerer som en specifik K-RAS anticancer terapeutisk, der forårsager mis-lokalisering af RAS protein til PM.
Nematode Caenorhabditis elegans er blevet grundigt undersøgt i forbindelse med udvikling. Mange af de signalveje, der styrer udviklingen i ormen, er evolutionære og funktionelt bevaret. Egfr medieret aktivering af RAS og den efterfølgende aktivering af ERK MAPK-signalkaskaden bevares f.eks. Kaskaden er repræsenteret af følgende proteiner: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 er homologt for RAS, mens LET-23 er homologt for EGFR. I ormen regulerer denne vej udviklingen af vulva13. Vulva er en epitelåbning på ormens ventrale kropsvæg, der gør det muligt at lægges befrugtede æg. Dannelsen af vulvaen i ormen afhænger af, at vulvalprækursorcellerne (VPC) udsættes for en gradient for aktivering af EGFR-RAS-MAPK-signalkaskaden. Under den normale udvikling modtager de proksimale VPCs stærke signaler fra gonadal ankercellerne for at differentiere sig til 1° og 2° celle skæbner, som giver anledning til en funktionel vulva12. Mens distale VPCs differentierer sig til 3 ° celle skæbner, der smelter sammen til hypodermal syncytium og ikke danner vulva på grund af udtømt signalering. I mangel af signalering differentierer alle VPCs sig til 3° celle skæbner, hvilket resulterer i dannelsen af ingen vulva. Konstituerende signalering fører imidlertid til dannelsen af en eller flere ikke-funktionelle vulva på grund af induktion af alle VPCs til at antage 1 ° og 2 ° celle skæbner.
Mutationer, der forårsager defekt eller overdreven vulval induktion er blevet identificeret for mange af de gener, der koder for proteiner, der repræsenterer denne vej. Defekt vulval induktion resulterer i en vulvaless (Vul) fænotype, mens overdreven vulval induktion resulterer i en multivulva (Muv) fænotype, der er repræsenteret ved udviklingen af talrige nonfunctional ektopiske pseudovulvae hele ventral kropsvæggen. Den Muv fænotype udtrykt ved let-60(n1046) stamme skyldes en gevinst af funktion mutation i RAS, mens der i let-23(sa62) stamme det skyldes en aktiverende mutation i EGFR14,15. Den stærke Muv fænotype i disse mutante stammer har vist sig at være forstyrret af farmakologiske indgreb som påvist ved behandling af let-60(n1046) orme med MEK-1-hæmmer U012616,17. Interessant nok har vi vist, at R-fendiline og hæmmere, der påvirker sphingomyelin metabolisme undertrykke Muv fænotype i ormen18. For at demonstrere disse hæmmere blok let-60 signalering på niveau med RAS, lin-1 null stamme er blevet udnyttet17. Lin-1 er en Ets-lignende hæmmende transskriptionsfaktor, der fungerer som et undertrykker i udviklingen af vulva19. Stærk tilbagevenden af Muv fænotype i lad-60(n1046) orme og ingen effekt på lin-1 null orme tyder på, at disse hæmninger forekommer på niveau med RAS.
I denne protokol demonstrerer vi brugen af C. elegans som model til at identificere hæmmere af RAS- og EGFR-proteiner. Ved hjælp af en væskebaseret analyse demonstrerer vi de hæmmende virkninger af R-fendiline ved at undertrykke Muv-fænotyperne i lad-60(n1046) og let-23(sa62) mutantstammer af C. elegans. Denne analyse validerer brugen af C. elegans som et redskab i den indledende fase af lægemiddelforskning for kræftbehandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
De analyser, vi beskriver ved hjælp af ormen, er enkle og billige til at identificere hæmmere af EGFR- og RAS-funktionen. C. elegans er en attraktiv model for lægemiddelforskning, fordi det er let at vokse i laboratoriet på grund af den korte livscyklus (3 dage ved 20 °C) og evnen til at generere et stort antal larver. Endnu vigtigere er det, at EGFR-RAS-ERK MAPK-vejen evolutionært og funktionelt bevares med pattedyr, der giver et genetisk tractable system til at analysere virkningerne af EGFR- og RAS-hæm…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Swathi Arur (MD Anderson Cancer Center) for at give let-60(n1046). Vi takker også Dr. David Reiner (Texas A &M Health Science Center Institute of Biosciences &technology i Houston) for lin-1 stammen. Endelig takker vi Dr. Danielle Garsin og hendes laboratorium (The University of Texas, McGovern Medical School) for at give nogle af de reagenser. Nogle orm stammer blev leveret af CGC, som er finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Denne forskning blev støttet af Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) tilskud RP200047 til JF Hancock.
Materials
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Millipore Sigma | A9539-50G | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium pPhosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| R-Fendiline | Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade) | ||
| Sodium Azide | Millipore Sigma | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | Bleach | ||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| (−)-Tetramisole Hydrochloride | Millipore Sigma | L9756 | |
| UO126 (MEK inhibitor) | Millipore Sigma | 19-147 | |
| Consumables | |||
| 15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| No. 1.5 18 mm X 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| 12- Well Tissue Culture Plates | Fisher Scientific | 50-197-4804 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| E. coli OP50 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| MT2124 | let-60(n1046) IV. | CGC | |
| MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
| PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |
Riferimenti
- Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
- Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway. Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).
- Grandis, J. R., Tweardy, D. J. Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer. Ricerca sul cancro. 53 (15), 3579-3584 (1993).
- Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review. International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).
- Stransky, N., et al. The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma. Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).
- Bos, J. L. ras oncogenes in human cancer: a review. Ricerca sul cancro. 49 (17), 4682-4689 (1989).
- Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).
- Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Ricerca sul cancro. 72 (10), 2457-2467 (2012).
- Hancock, J. F. Ras proteins: different signals from different locations. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).
- Hancock, J. F., Parton, R. G. Ras plasma membrane signalling platforms. Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).
- van der Hoeven, D., et al. Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).
- Moghal, N., Sternberg, P. W. The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans. Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).
- Sundaram, M. V. RTK/Ras/MAPK signaling. WormBook. , 1-19 (2006).
- Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetica. 110 (1), 17-72 (1985).
- Katz, W. S., et al. A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog. Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).
- Hara, M., Han, M. Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).
- Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo. Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).
- van der Hoeven, D., et al. Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function. Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).
- Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway. Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
- Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes. Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).
- Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans. Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).
