Assemblage de modèles de bicouches lipidiques supportées et suspendues imitant des cellules pour l’étude des interactions moléculaires
Summary
Ce protocole décrit la formation de cellules imitant les vésicules unilipidiques et multilipidiques, les bicouches lipidiques soutenues et les bicouches lipidiques en suspension. Ces modèles in vitro peuvent être adaptés pour incorporer une variété de types de lipides et peuvent être utilisés pour étudier diverses interactions entre molécules et macromolécules.
Abstract
Les membranes cellulaires modèles sont un outil de dépistage utile avec des applications allant de la découverte précoce de médicaments aux études de toxicité. La membrane cellulaire est une barrière protectrice cruciale pour tous les types de cellules, séparant les composants cellulaires internes de l’environnement extracellulaire. Ces membranes sont composées en grande partie d’une bicouche lipidique, qui contient des groupes de tête hydrophile externe et des groupes de queue hydrophobes internes, ainsi que diverses protéines et cholestérol. La composition et la structure des lipides eux-mêmes jouent un rôle crucial dans la régulation de la fonction biologique, y compris les interactions entre les cellules et le microenvironnement cellulaire, qui peut contenir des produits pharmaceutiques, des toxines biologiques et des toxiques environnementaux. Dans cette étude, des méthodes pour formuler des bicouches unilipidiques et multilipidiques soutenues et en suspension imitant les cellules lipidiques sont décrites. Auparavant, des bicouches lipidiques unilipidiques phosphatidylcholine (PC) ainsi que des bicouches lipidiques multilipidiques inspirées du trophoblaste placentaire ont été développées pour être utilisées dans la compréhension des interactions moléculaires. Ici, les méthodes pour réaliser les deux types de modèles bicouches seront présentées. Pour les cellules imitant les bicouches multilipidiques, la composition lipidique souhaitée est d’abord déterminée par extraction lipidique à partir de cellules primaires ou de lignées cellulaires, suivie d’une chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS). En utilisant cette composition, les vésicules lipidiques sont fabriquées à l’aide d’une méthode d’hydratation et d’extrusion en couche mince et leur diamètre hydrodynamique et leur potentiel zêta sont caractérisés. Les bicouches lipidiques supportées et en suspension peuvent ensuite être formées à l’aide d’une microbalance à cristaux de quartz avec surveillance de la dissipation (QCM-D) et sur une membrane poreuse pour une utilisation dans un test de perméabilité à membrane artificielle parallèle (PAMPA), respectivement. Les résultats représentatifs mettent en évidence la reproductibilité et la polyvalence des modèles de bicouches lipidiques de membrane cellulaire in vitro. Les méthodes présentées peuvent aider à évaluer rapidement et facilement les mécanismes d’interaction, tels que la perméation, l’adsorption et l’incorporation, de diverses molécules et macromolécules avec une membrane cellulaire, aidant ainsi au dépistage des candidats médicaments et à la prédiction de la toxicité cellulaire potentielle.
Introduction
La membrane cellulaire, composée principalement de phospholipides, de cholestérol et de protéines, est un composant crucial de toutes les cellules vivantes1. Avec une organisation guidée par l’amphiphilie lipidique, la membrane cellulaire fonctionne comme une barrière protectrice et régule la façon dont la cellule interagit avec son environnementenvironnant 2. Plusieurs processus cellulaires dépendent de la composition lipidique et protéique de la membrane1,2. Par exemple, les interactions de la membrane cellulaire sont importantes pour une administration efficace des médicaments3. Les produits pharmaceutiques, les produits biologiques, les nanomatériaux, les toxines biologiques et les toxiques environnementaux peuvent avoir un impact sur l’intégrité d’une membrane cellulaire, affectant ainsi la fonction cellulaire4. La construction de modèles membranaires imitant les cellules in vitro basés sur la composition lipidique des membranes cellulaires a le potentiel de fournir des outils faciles pour améliorer considérablement l’étude de l’impact potentiel de ces matériaux sur les cellules.
Les bicouches lipidiques modèles comprennent les vésicules lipidiques, les bicouches lipidiques supportées et les bicouches lipidiques en suspension. Les bicouches lipidiques supportées sont un modèle de la membrane cellulaire phospholipide couramment utilisée dans les applications biotechnologiques où les vésicules lipidiques sont rompues sur un matériau de substratsupporté5,6,7,8,9. Une technique couramment utilisée pour surveiller la formation de bicouches est la microbalance de cristaux de quartz avec surveillance de la dissipation (QCM-D), qui examine l’adsorption des vésicules par rapport aux propriétés liquides en vrac in situ8,10,11,12,13,14 . Auparavant, QCM-D a été utilisé pour démontrer que dans des conditions d’écoulement, une fois qu’une couverture vésiculaire critique des vésicules lipidiques phosphatidylcholine (PC) est obtenue à la surface, elles se rompent spontanément en bicouches lipidiques rigides15. Des travaux antérieurs ont également étudié la formation de bicouches lipidiques soutenues avec des compositions lipidiques variables16,l’incorporation de protéines lipidiques17,18,19et l’utilisation de coussins polymères20,produisant des bicouches lipidiques supportées capables d’imiter divers aspects de la fonction de la membrane cellulaire.
Les bicouches lipidiques ont été utilisées pour imiter diverses barrières biologiques allant des niveaux subcellulaires aux niveaux d’organes, y compris la mitochondrie, les globules rouges et les membranes des cellules hépatiques en modifiant les composants phospholipides, cholestérol et glycolipides21. Ces vésicules multilipidiques plus complexes peuvent nécessiter des méthodes supplémentaires pour obtenir une rupture de vésicule, en fonction de la composition lipidique. Par exemple, des études antérieures ont utilisé un peptide α-hélicoïdal (AH) dérivé de la protéine non structurelle 5A du virus de l’hépatite C pour induire la formation de bicouches en déstabilisant les vésicules lipidiques adsorbées22,23. En utilisant ce peptide AH, des bicouches lipidiques supportées imitant les cellules placentaires ont déjà été formées24. Le grand potentiel des bicouches lipidiques supportées pour des applications biomédicales a été démontré avec des études couvrant le transport moléculaire et de nanoparticules25,26, les interactions toxiquesenvironnementales 27, l’assemblage et la fonction des protéines17,18,19, l’arrangement et l’insertion peptidiques28,29, le dépistage demédicaments 30, et les plates-formes microfluidiques31.
Les bicouches lipidiques en suspension ont été utilisées pour des études de criblage pharmaceutique via un test parallèle de perméabilité de la membrane artificielle (PAMPA) où une bicouche lipidique est suspendue à travers un insert hydrophobe poreux32,33,34,35. Des modèles lipidiques PAMPA ont été développés pour différentes interfaces biologiques, y compris les interfaces sang-cerveau, buccale, intestinale et transdermique36. En combinant à la fois les techniques de bicouche lipidique et de PAMPA, l’adsorption, la perméabilité et l’incorporation de composés dans les composants lipidiques d’un type de tissu ou de cellule souhaité peuvent être étudiés en profondeur.
Ce protocole décrit la fabrication et l’application de modèles de bicouches lipidiques de membrane cellulaire in vitro pour étudier plusieurs interactions moléculaires. La préparation des bicouches unilipidiques et multilipidiques soutenues et en suspension est détaillée. Pour former une bicouche lipidique supportée, les vésicules lipidiques sont d’abord développées en utilisant des méthodes d’hydratation et d’extrusion en couche mince suivies d’une caractérisation physico-chimique. La formation d’une bicouche lipidique supportée à l’aide de la surveillance QCM-D et la fabrication de membranes lipidiques en suspension pour une utilisation dans PAMPA est discutée. Enfin, les vésicules multilipidiques pour le développement de membranes imitant des cellules plus complexes sont examinées. En utilisant les deux types de membranes lipidiques fabriquées, ce protocole démontre comment cet outil peut être utilisé pour étudier les interactions moléculaires. Dans l’ensemble, cette technique construit des bicouches lipidiques imitant les cellules avec une reproductibilité et une polyvalence élevées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole permet la formation de vésicules lipidiques, de bicouches lipidiques soutenues et de bicouches lipidiques en suspension. Ici, des étapes critiques sont présentées pour former chacune de ces structures. Lors de la formation de vésicules lipidiques, il est important d’extruder au-dessus de la température de transition du lipide39. Lorsqu’il est en dessous de la température de transition, le lipide est physiquement présent dans sa phase de gel ordonnée39</s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce matériel est basé sur des travaux soutenus par la National Science Foundation dans le cadre de la subvention n ° 1942418 attribuée à A.S., et une bourse de recherche supérieure de la National Science Foundation décernée à C.M.B.H., sous la subvention n ° 1644760. Toutes les opinions, constatations et conclusions ou recommandations exprimées dans ce document sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les points de vue de la National Science Foundation. Les auteurs remercient le Dr Noel Vera-González pour l’acquisition de données sur la caractérisation des vésicules lipidiques. Les auteurs remercient le professeur Robert Hurt (Brown University) pour l’utilisation de son Zetasizer. Les auteurs remercient le Centre de spectrométrie de masse de l’Université Brown, en particulier le Dr Tun-Li Shen pour son aide à quantifier la composition lipidique.
Materials
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC, 16:0-18:1 PC) | Avanti Polar Lipids | 850457 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS) | Avanti Polar Lipids | 840034 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE) | Avanti Polar Lipids | 850757 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS) | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (Δ9-Cis) PC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (Δ9-Cis) PE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt)) | Avanti Polar Lipids | 890703 | |
| 3 mL Luer-Loc syringes | BD | 309657 | |
| 40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner | Duran Wheaton Kimble | W224605 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| Alconox | Fisher Scientific | 50-821-781 | |
| Ammonium formate | Millipore Sigma | LSAC70221 | |
| C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire | Waters | 186002551 | |
| Chloroform | Millipore Sigma | LSAC288306 | |
| Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK | Sarstedt | 67.758.001 | |
| Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) | Millipore Sigma | 36735 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | LSAC472301 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Filter supports, 10 mm | Avanti Polar Lipids | 610014 | Size for mini extruder |
| Folded capillary zeta cell | Malvern Panalytical | DTS1070 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764-4L | |
| Kimwipes | Kimberly Clark | 34256 | |
| L-α-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI) | Avanti Polar Lipids | 840044 | |
| L-α-phosphitidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| LiposoFast ® LF-50 | Avestin, Inc. | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 – 4L | |
| Mini-extruder set with holder/heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45 µm, clear, sterile | Millipore Sigma | MAIPS4510 | for PAMPA studies |
| Nitrogen gas, ultrapure | TechAir | NI T5.0 | |
| Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um | Whatman | 800309 | Size for mini extruder |
| Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um | Whatman | 110605 | Size for large extruder |
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| Phosphate buffer saline (PBS), 10x | Genesee Scienfitic | 25-507X | Dilute to 1x |
| Qsoft 401 software | Biolin Scientific | ||
| Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer | Biolin Scientific | ||
| Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL | Duran Wheaton Kimble | 986561 | |
| Silicon Dioxide, thin QSensors | Biolin Scientific | QSX 303 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Millipore Sigma | LSACS5886 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Solvent Safe pipette tips | Sigma-Aldrich | S8064 | |
| Sphingomyelin (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 860061 | |
| Trizma base | Millipore Sigma | LSACT1503 | |
| Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid | Caisson Labs | TRL01-6X100ML | |
| Whatman drain disc, 25 mm | Whatman | 230600 | Size for large extruder |
| Zetasizer ZS90 | Malvern Panalytical | ||
| Zetasizer 7.01 software | Malvern Panalytical |
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