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Bioingegneria

分子相互作用研究のための細胞模倣支援及び懸濁脂質二重層モデルの組み立て

Published: August 03, 2021
doi:
10.3791/62599
, ,
1Department of Chemical Engineering,Worcester Polytechnic Institute, 2Center for Biomedical Engineering, School of Engineering,Brown University

Summary

このプロトコルは、ユニ脂質および多脂質小胞、支持脂質二重層、および懸濁された脂質二重層を模倣する細胞の形成を記述する。これらの in vitro モデルは、様々な脂質タイプを組み込むために適応することができ、様々な分子および高分子相互作用を調査するために使用することができる。

Abstract

モデル細胞膜は、創薬初期から毒性研究に至るまでの用途を備えた有用なスクリーニングツールです。細胞膜は、細胞外環境から細胞内成分を分離し、すべての細胞タイプのための重要な保護障壁です。これらの膜は、様々なタンパク質およびコレステロールと共に、外側の親水性ヘッド基および内側の疎水性尾基を含む脂質二重層から構成される大部分を占める。脂質の組成と構造は、細胞と細胞微小環境との相互作用を含む生物学的機能を調節する上で重要な役割を果たします。本研究では、脂質二重層を模倣するユニ脂質およびマルチ脂質を支持し、懸濁細胞を処方する方法について説明する。以前は、分子相互作用を理解するために、ユニ脂質ホスファチジルコリン(PC)脂質二重層ならびに多脂質胎盤性栄養芽細胞に触発された脂質二重層が開発されました。ここでは、両層モデルの両方を達成するための方法を提示する。細胞模倣多重層の場合、所望の脂質組成物は、まず、一次細胞または細胞株からの脂質抽出を介して決定され、続いて液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)が続く。この組成物を用いて、脂質小胞は薄膜水和および押出方法を用いて作製され、それらの流体力学的直径およびゼータ電位が特徴付けられる。サポートされ、懸濁された脂質二重層は、次に、散逸モニタリング(QCM-D)と並列人工膜透過性アッセイ(PAMPA)で使用するための多孔質膜上の水晶マイクロバランスを使用して形成することができる。代表結果は 、体外 細胞膜脂質二重層モデルの再現性と汎用性を強調しています。提示された方法は、細胞膜を有する様々な分子および高分子の浸透、吸着、埋め込みなどの相互作用メカニズムの迅速かつ容易な評価を助け、薬物候補のスクリーニングおよび潜在的な細胞毒性の予測に役立つ。

Introduction

細胞膜は、主にリン脂質、コレステロール、およびタンパク質から構成され、全ての生細胞1の重要な構成要素である。脂質両親媒性によって駆動される組織では、細胞膜は保護障壁として機能し、細胞がその周囲の環境とどのように相互作用するかを調節する2。いくつかの細胞プロセスは、膜1、2の脂質およびタンパク質組成に依存する。例えば、細胞膜相互作用は、効果的な薬物送達3にとって重要である。医薬品、生物学的製剤、ナノ材料、生物学的毒素、および環境毒性物質は、細胞膜の完全性に影響を与え、細胞機能4に影響を及ぼす可能性がある。細胞膜の脂質組成に基づくインビトロ細胞模倣膜モデルの構築は、細胞に対するこれらの材料の潜在的な影響の研究を大幅に強化するファシリティツールを提供する可能性を秘めています。

モデル脂質二重層は、脂質小胞、支持脂質二重層、および懸濁された脂質二重層を含む。サポートされる脂質二重層は、サポートされる基板材料5、6、7、8、9で脂質小胞が破裂するバイオテクノロジー用途で一般的に使用されるリン脂質細胞膜のモデルである。二重層形成を監視するために使用される一般的な技術の1つは、水晶結晶マイクロバランスと散逸モニタリング(QCM-D)であり、それは、その場8、10、11、12、13、14のバルク液体特性と比較して小胞の吸着を調べる.以前、QCM-Dは、フロー条件下で、一度ホスファチジルコリン(PC)脂質小胞の臨界小胞被覆が表面上で達成されることを実証するために使用されてきたが、それらは、硬質脂質二重層15に自発的に破裂する。また、脂質組成16の様々な脂質を用いた支持脂質二重層形成、脂質タンパク質17、18、19の組込み、およびポリマークッション20を利用して、細胞膜機能の様々な局面を模倣し得る支持脂質二重層を得たことも調べてきた。

脂質二重層は、リン脂質、コレステロール、および糖脂質成分21を改変することにより、ミトコンドリア、赤血球、および肝臓細胞膜を含む細胞下から器官レベルまで様々な生物学的障壁を模倣するために使用されてきた。これらのより複雑な多脂質小胞は、脂質組成に応じて、小胞破裂を達成するための追加の方法を必要とするかもしれない。例えば、以前の研究では、C型肝炎ウイルスの非構造タンパク質5Aに由来するαヘリカル(AH)ペプチドを利用して、吸着した脂質小胞22,23を不安定化させることによって二層形成を誘導している。このAHペプチドを用いて、胎盤細胞を模倣した支持脂質二重層が以前に形成された24.生体医学用途に対するサポート脂質二重層の大きな可能性は、分子およびナノ粒子輸送25、26、環境毒性相互作用27、タンパク質組立および機能17、18、19、ペプチド配置および挿入28、29、薬物スクリーニング30、およびマイクロ流体プラットフォーム31に及ぶ調査で実証されている。

懸濁された脂質二重層は、多孔質疎水性インサート32、33、34、35に脂質二重層が懸濁される平行人工膜透過性アッセイ(PAMPA)を介して医薬スクリーニング試験に使用されている。PAMPA脂質モデルは、血液脳、頬、腸、経皮インターフェース36を含む異なる生物学的インターフェースのために開発された。支持脂質二重層とPAMPAの技術を組み合わせることにより、所望の組織または細胞型の脂質成分内に化合物の吸着、透過性、および埋め込みが徹底的に検討できる。

このプロトコルは、いくつかの分子相互作用を調査するために 、体外 細胞膜脂質二重層モデルの製造と適用について説明する。ユニ脂質とマルチ脂質の両方の調製は、二重層を支持し、懸濁した脂質をサポートし、詳細である。脂質小胞は、脂質二重層を形成するために、まず薄膜水和法および押出法を用いて開発され、その後に物理化学的特徴付けが行われます。PAMPAで使用するための懸濁型脂質膜のQCM-Dモニタリングおよび製造を用いた支持脂質二重層の形成が議論される。最後に、より複雑な細胞模倣膜の発達のための多脂質小胞を調べる。このプロトコルは、両方のタイプの作製脂質膜を使用して、このツールを使用して分子相互作用を研究する方法を示しています。全体的に、この技術は、高い再現性と汎用性を有する脂質二重層を模倣する細胞を構築する。

Protocol

1. ユニリピッドベシクルの開発 薄膜ハイドレーション法 脂質ストック溶液の調製と保存注:クロロホルムを使用するすべてのステップは、化学ヒュームフードで行う必要があります。クロロホルムは、常に溶媒安全な炭素繊維ピペットチップを使用して配管する必要があります。クロロホルムを含む溶液は、常にガラスバイアルに保存する必要があります。 適切な量の…

Representative Results

このプロトコルは、サポートされている脂質二重層を形成するための方法を詳述する(図1)。サポートされる脂質二重層を形成するための最初のステップは、脂質小胞を開発することです。小型押出機は少量の脂質小胞を調製することを可能にする(1mL以下)、大きい押出機は1つのバッチで調製される脂質小胞の5-50 mLを可能にする。ミニまたは大型押出機のいずれかによっ…

Discussion

このプロトコルは、脂質小胞、支持脂質二重層、および懸濁された脂質二重層の形成を可能にする。ここでは、これらの構造を形成するための重要なステップを示します。脂質小胞を形成する場合、脂質39の転移温度を超えて押し出することが重要である。転移温度を下回ると、脂質は、その秩序ゲル相39に物理的に存在する。この順序付けられた段階では…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この資料は、A.S.に授与されたグラント・ノー・1942418の下で国立科学財団が支援する仕事と、グラント・No.1644760の下でC.M.B.H.に授与された国立科学財団大学院研究フェローシップに基づいています。この資料で表明された意見、調査結果、結論または勧告は著者のものであり、必ずしも国立科学財団の見解を反映しているわけではありません。著者らは、ノエル・ベラ・ゴンサレス博士の脂質ベシクル特徴付けデータ取得に感謝する。著者らは、彼のゼータサイザーの使用のためにロバート・ハート教授(ブラウン大学)に感謝します。著者らは、ブラウン大学質量分析施設、特にTun-Liシェン博士に脂質組成の定量化に関する支援を受け付けたことに感謝している。

Materials

1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine  (POPC, 16:0-18:1 PC) Avanti Polar Lipids 850457
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS) Avanti Polar Lipids 840034
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE) Avanti Polar Lipids 850757
1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS) Avanti Polar Lipids 840035
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (Δ9-Cis) PC) Avanti Polar Lipids 850375
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (Δ9-Cis) PE) Avanti Polar Lipids 850725
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt)) Avanti Polar Lipids 890703
3 mL Luer-Loc syringes BD 309657
40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner Duran Wheaton Kimble W224605
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004
Alconox Fisher Scientific 50-821-781
Ammonium formate Millipore Sigma LSAC70221
C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire Waters  186002551
Chloroform Millipore Sigma LSAC288306
Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK Sarstedt 67.758.001
Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) Millipore Sigma 36735
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Millipore Sigma LSAC472301
Ethanol Pharmco 111000200
Filter supports, 10 mm Avanti Polar Lipids 610014 Size for mini extruder
Folded capillary zeta cell Malvern Panalytical DTS1070
Isopropanol Sigma-Aldrich 190764-4L
Kimwipes Kimberly Clark 34256
L-α-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI) Avanti Polar Lipids 840044
L-α-phosphitidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids 840051
LiposoFast ® LF-50 Avestin, Inc.
Methanol Sigma-Aldrich 179337 – 4L
Mini-extruder set with holder/heating block Avanti Polar Lipids 610000
MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45 µm, clear, sterile Millipore Sigma MAIPS4510 for PAMPA studies
Nitrogen gas, ultrapure TechAir NI T5.0
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um Whatman 800309 Size for mini extruder
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um Whatman 110605 Size for large extruder
Parafilm Bemis PM999
Phosphate buffer saline (PBS), 10x Genesee Scienfitic 25-507X Dilute to 1x
Qsoft 401 software Biolin Scientific
Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer Biolin Scientific
Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL Duran Wheaton Kimble 986561
Silicon Dioxide, thin QSensors Biolin Scientific QSX 303
Sodium chloride (NaCl) Millipore Sigma LSACS5886
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-100
Solvent Safe pipette tips Sigma-Aldrich S8064
Sphingomyelin (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids 860061
Trizma base Millipore Sigma LSACT1503
Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid Caisson Labs TRL01-6X100ML
Whatman drain disc, 25 mm Whatman 230600 Size for large extruder
Zetasizer ZS90 Malvern Panalytical
Zetasizer 7.01 software Malvern Panalytical
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Riferimenti

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Bailey-Hytholt, C. M., LaMastro, V., Shukla, A. Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions. J. Vis. Exp. (174), e62599, doi:10.3791/62599 (2021).
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