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Bioingegneria

Montagem de Modelos de Bicamadas lipídicas apoiadas e suspensas para o estudo de interações moleculares

Published: August 03, 2021
doi:
10.3791/62599
, ,
1Department of Chemical Engineering,Worcester Polytechnic Institute, 2Center for Biomedical Engineering, School of Engineering,Brown University

Summary

Este protocolo descreve a formação de células imitando vesículas uni-lipídicas e multi-lipídicas, bicamadas lipídicas suportadas e bicamadas lipídicas suspensas. Estes modelos in vitro podem ser adaptados para incorporar uma variedade de tipos lipídes e podem ser usados para investigar várias interações de moléculas e macromoléculas.

Abstract

As membranas celulares modelo são uma ferramenta de triagem útil com aplicações que vão desde a descoberta precoce de drogas até estudos de toxicidade. A membrana celular é uma barreira protetora crucial para todos os tipos de células, separando os componentes celulares internos do ambiente extracelular. Essas membranas são compostas em grande parte por uma bicamada lipídica, que contém grupos de cabeças hidrofílicas externas e grupos de cauda hidrofóbica interna, juntamente com várias proteínas e colesterol. A composição e estrutura dos próprios lipídios desempenham um papel crucial na regulação da função biológica, incluindo interações entre as células e o microambiente celular, que podem conter fármacos, toxinas biológicas e tóxicos ambientais. Neste estudo, são descritos métodos para formular células uni-lipídicas e multi-lipídicas que imitam bicamadas lipídicas. Anteriormente, bicamadas lipídicas de fosfartilina uni-lipídica (PC), bem como bicamadas lipídicas multi-lipídicas inspiradas em trophoblast foram desenvolvidas para uso na compreensão de interações moleculares. Aqui, serão apresentados métodos para alcançar os dois tipos de modelos bicamadas. Para as bicamadas multi-lipídicas, a composição lipídica desejada é determinada pela primeira vez através da extração lipídica de células primárias ou linhas celulares seguidas por espectrometria de massa cromatografia líquida (LC-MS). Usando esta composição, as vesículas lipídicas são fabricadas usando um método de hidratação e extrusão de películas finas e seu diâmetro hidrodinâmico e potencial zeta são caracterizados. Bicamadas lipídicas suportadas e suspensas podem então ser formadas usando microequilíptico de cristal de quartzo com monitoramento de dissipação (QCM-D) e em uma membrana porosa para uso em um ensaio paralelo de permeabilidade da membrana artificial (PAMPA), respectivamente. Os resultados representativos destacam a reprodutibilidade e versatilidade dos modelos de bicamadas lipídicas de membrana celular in vitro. Os métodos apresentados podem auxiliar na avaliação rápida e fácil dos mecanismos de interação, como permeação, adsorção e incorporação, de várias moléculas e macromoléculas com uma membrana celular, auxiliando na triagem de candidatos a medicamentos e na previsão de potencial toxicidade celular.

Introduction

A membrana celular, composta principalmente de fosfolipídios, colesterol e proteínas, é um componente crucial de todas as células vivas1. Com organização impulsionada pela anfífilia lipídica, a membrana celular funciona como uma barreira protetora e regula como a célula interage com seu ambiente circundante2. Diversos processos celulares dependem da composição lipídica e proteica da membrana1,2. Por exemplo, as interações de membrana celular são importantes para uma entrega eficaz de medicamentos3. Medicamentos, biológicos, nanomateriais, toxinas biológicas e tóxicos ambientais podem impactar a integridade de uma membrana celular, afetando assim a função celular4. A construção de modelos de membrana de imitação de células in vitro baseadas na composição lipídica das membranas celulares tem o potencial de fornecer ferramentas fáceis para aprimorar muito o estudo do impacto potencial desses materiais nas células.

Bicamadas lipídicas modelo incluem vesículas lipídicas, bicamadas lipídicas suportadas e bicamadas lipídicas suspensas. Bicamadas lipídicas suportadas são um modelo da membrana celular fosfolipídica comumente usada em aplicações biotecnológicas onde vesículas lipídicas são rompidas em um material substrato suportado5,6,7,8,9. Uma técnica comum usada para monitorar a formação de bicamadas é o microequilípmo de cristal de quartzo com monitoramento de dissipação (QCM-D), que examina a adsorção de vesículas em comparação com as propriedades líquidas a granel no situ8,10,11,12,13,14 . Anteriormente, o QCM-D tem sido usado para demonstrar que, em condições de fluxo, uma vez que uma cobertura vesícula crítica de vesículas lipídicas fosfattidylcholina (PC) é alcançada na superfície, elas se rompem espontaneamente em bicamadas lipídicas rígidas15. Trabalhos anteriores também investigaram a formação de vitonas com diferentes composições lipídicas16, incorporação de proteínas lipídicas17,18,19, e utilizando almofadas de polímero20,produzindo bicamadas lipídicas suportadas capazes de imitar vários aspectos da função da membrana celular.

Bicamadas lipídicas têm sido usadas para imitar várias barreiras biológicas, do subcelular aos níveis de órgãos, incluindo mitocôndria, glóbulos vermelhos e membranas de células hepáticas alterando os componentes fosfolipídicos, colesterol e glicóptiides21. Essas vesículas multi-lipídicas mais complexas podem exigir métodos adicionais para alcançar a ruptura vesícula, dependendo da composição lipídica. Por exemplo, estudos anteriores utilizaram um peptídeo α-helicoidal (AH) derivado da proteína não estrutural 5A do vírus da hepatite C para induzir a formação de bicamadas desestabilizando as vesículas lipídicas adsorvidas22,23. Usando este peptídeo AH, bicamadas lipídicas apoiadas imitando células placentárias foram previamente formadas24. O grande potencial de bicamadas lipídicas suportadas para aplicações biomédicas tem sido demonstrado com investigações abrangendo o transporte molecular e nanopartícula25,26, interações toxicantes ambientais27,montagem e função de proteínas17,18,19,arranjo de peptídeos e inserção28,29,triagem de medicamentos30e plataformas microfluidas31.

Bicamadas lipídicas suspensas têm sido usadas para estudos de triagem farmacêutica através de um ensaio paralelo de permeabilidade de membrana artificial (PAMPA) onde uma bicamada lipídica é suspensa através de uma inserção hidrofóbica porosa32,33,34,35. Modelos lipídicos PAMPA foram desenvolvidos para diferentes interfaces biológicas, incluindo as interfaces hemato-cerebral, bucal, intestinal e transdérmica36. Combinando as técnicas de bicamadas lipídicas suportadas e técnicas PAMPA, a adsorção, a permeabilidade e a incorporação de compostos dentro de componentes lipíduos de um tecido ou tipo celular desejado podem ser exaustivamente estudados.

Este protocolo descreve a fabricação e aplicação de modelos de bicamadas lipídicas de membrana celular in vitro para investigar várias interações moleculares. A preparação de bicamadas lipídicas e multi-lipídicas e multi-lipídicas é detalhada. Para formar uma bicamada lipídica suportada, as vesículas lipídicas são desenvolvidas pela primeira vez usando métodos de hidratação e extrusão de filmes finos seguidos pela caracterização físico-química. Discute-se a formação de um bicamado lipídeco suportado usando monitoramento e fabricação de membranas lipídicas suspensas para uso no PAMPA. Finalmente, vesículas multi-lipídicas para o desenvolvimento de membranas de imitação celular mais complexas são examinadas. Usando ambos os tipos de membranas lipídicas fabricadas, este protocolo demonstra como esta ferramenta pode ser usada para estudar interações moleculares. No geral, essa técnica constrói células imitando bicamadas lipídicas com alta reprodutibilidade e versatilidade.

Protocol

1. Desenvolvimento de vesículas uni-lipídicas Método de hidratação de filme fino Preparação e armazenamento de soluções de estoque lipídudoNOTA: Todas as etapas que utilizam clorofórmio precisam ser realizadas em uma capa de fumaça química. O clorofórmio deve ser sempre pipetado usando pontas de pipeta de fibra de carbono com proteção. As soluções que contenham clorofórmio devem ser sempre armazenadas em frascos de vidro. Prepare uma solução de caldo lipídico de 10 mg/m…

Representative Results

Este protocolo detalha os métodos de formação de bicamadas lipídicas suportadas e suspensas(Figura 1). O primeiro passo para formar um bicamado lipídigo apoiado é desenvolver vesículas lipídicas. A mini extrusora permite que pequenos volumes de vesículas lipídicas sejam preparados (1 mL ou menos), enquanto a grande extrusora permite que 5-50 mL de vesículas lipídicas sejam preparados em um lote. Distribuições de tamanho de vesículas uni-lipídicas formadas pelo mini ou grande …

Discussion

Este protocolo permite a formação de vesículas lipídicas, bicamadas lipídicas suportadas e bicamadas lipídicas suspensas. Aqui, são apresentados passos críticos para formar cada uma dessas estruturas. Ao formar vesículas lipídicas, é importante extrusão acima da temperatura de transição do lipídio39. Quando abaixo da temperatura de transição, o lipídio está fisicamente presente em sua fase de gelordenado 39. Nesta fase ordenada, as caudas lipídicas de hi…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este material é baseado em trabalho apoiado pela Fundação Nacional de Ciência sob o Grant No. 1942418 concedido à A.S., e uma Bolsa de Pesquisa de Pós-Graduação da Fundação Nacional de Ciência concedida à C.M.B.H., sob o grant no. 1644760. Quaisquer opiniões, achados e conclusões ou recomendações expressas neste material são dos autores e não refletem necessariamente as opiniões da Fundação Nacional de Ciência. Os autores agradecem ao Dr. Noel Vera-González pela aquisição de dados de caracterização de vesículas lipídicas. Os autores agradecem ao professor Robert Hurt (Brown University) pelo uso de seu Zetasizer. Os autores agradecem ao Brown University Mass Spectrometria Facility, em particular, Dr. Tun-Li Shen pela assistência com a composição lipídica quantificada.

Materials

1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine  (POPC, 16:0-18:1 PC) Avanti Polar Lipids 850457
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS) Avanti Polar Lipids 840034
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE) Avanti Polar Lipids 850757
1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS) Avanti Polar Lipids 840035
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (Δ9-Cis) PC) Avanti Polar Lipids 850375
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (Δ9-Cis) PE) Avanti Polar Lipids 850725
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt)) Avanti Polar Lipids 890703
3 mL Luer-Loc syringes BD 309657
40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner Duran Wheaton Kimble W224605
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004
Alconox Fisher Scientific 50-821-781
Ammonium formate Millipore Sigma LSAC70221
C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire Waters  186002551
Chloroform Millipore Sigma LSAC288306
Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK Sarstedt 67.758.001
Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) Millipore Sigma 36735
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Millipore Sigma LSAC472301
Ethanol Pharmco 111000200
Filter supports, 10 mm Avanti Polar Lipids 610014 Size for mini extruder
Folded capillary zeta cell Malvern Panalytical DTS1070
Isopropanol Sigma-Aldrich 190764-4L
Kimwipes Kimberly Clark 34256
L-α-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI) Avanti Polar Lipids 840044
L-α-phosphitidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids 840051
LiposoFast ® LF-50 Avestin, Inc.
Methanol Sigma-Aldrich 179337 – 4L
Mini-extruder set with holder/heating block Avanti Polar Lipids 610000
MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45 µm, clear, sterile Millipore Sigma MAIPS4510 for PAMPA studies
Nitrogen gas, ultrapure TechAir NI T5.0
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um Whatman 800309 Size for mini extruder
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um Whatman 110605 Size for large extruder
Parafilm Bemis PM999
Phosphate buffer saline (PBS), 10x Genesee Scienfitic 25-507X Dilute to 1x
Qsoft 401 software Biolin Scientific
Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer Biolin Scientific
Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL Duran Wheaton Kimble 986561
Silicon Dioxide, thin QSensors Biolin Scientific QSX 303
Sodium chloride (NaCl) Millipore Sigma LSACS5886
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-100
Solvent Safe pipette tips Sigma-Aldrich S8064
Sphingomyelin (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids 860061
Trizma base Millipore Sigma LSACT1503
Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid Caisson Labs TRL01-6X100ML
Whatman drain disc, 25 mm Whatman 230600 Size for large extruder
Zetasizer ZS90 Malvern Panalytical
Zetasizer 7.01 software Malvern Panalytical
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Riferimenti

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Bailey-Hytholt, C. M., LaMastro, V., Shukla, A. Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions. J. Vis. Exp. (174), e62599, doi:10.3791/62599 (2021).
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