Assemblierung von zellimitierenden unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Bildung von Zell-imitierenden Uni-Lipid- und Multi-Lipid-Vesikeln, unterstützten Lipiddoppelschichten und suspendierten Lipiddoppelschichten. Diese In-vitro-Modelle können angepasst werden, um eine Vielzahl von Lipidtypen zu integrieren und können verwendet werden, um verschiedene Molekül- und Makromolekül-Interaktionen zu untersuchen.
Abstract
Modellzellmembranen sind ein nützliches Screening-Tool mit Anwendungen, die von der frühen Wirkstoffentdeckung bis hin zu Toxizitätsstudien reichen. Die Zellmembran ist eine entscheidende Schutzbarriere für alle Zelltypen, die die internen zellularen Komponenten von der extrazellulären Umgebung trennt. Diese Membranen bestehen größtenteils aus einer Lipiddoppelschicht, die äußere hydrophile Kopfgruppen und innere hydrophobe Schwanzgruppen sowie verschiedene Proteine und Cholesterin enthält. Die Zusammensetzung und Struktur der Lipide selbst spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der biologischen Funktion, einschließlich der Wechselwirkungen zwischen Zellen und der zellulären Mikroumgebung, die Arzneimittel, biologische Toxine und Umweltgifte enthalten kann. In dieser Studie werden Methoden zur Formulierung von Ein-Lipid- und Multi-Lipid-gestützten und suspendierten Zell-imitierenden Lipiddoppelschichten beschrieben. Zuvor wurden Ein-Lipid-Phosphatidylcholin (PC)-Lipiddoppelschichten sowie Multi-Lipid-Plazenta-Trophoblast-inspirierte Lipiddoppelschichten für das Verständnis molekularer Wechselwirkungen entwickelt. Hier werden Methoden zur Erreichung beider Arten von Doppelschichtmodellen vorgestellt. Für zellnachahmende Multilipid-Doppelschichten wird die gewünschte Lipidzusammensetzung zunächst durch Lipidextraktion aus Primärzellen oder Zelllinien bestimmt, gefolgt von der Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS). Unter Verwendung dieser Zusammensetzung werden Lipidvesikel unter Verwendung eines Dünnschichthydratations- und Extrusionsverfahrens hergestellt und ihr hydrodynamischer Durchmesser und ihr Zetapotential charakterisiert. Gestützte und suspendierte Lipiddoppelschichten können dann unter Verwendung einer Quarzkristallmikrowage mit Dissipationsüberwachung (QCM-D) und auf einer porösen Membran zur Verwendung in einem parallelen künstlichen Membranpermeabilitätsassay (PAMPA) gebildet werden. Die repräsentativen Ergebnisse unterstreichen die Reproduzierbarkeit und Vielseitigkeit von In-vitro-Zellmembran-Lipid-Doppelschichtmodellen. Die vorgestellten Methoden können bei der schnellen, einfachen Bewertung der Interaktionsmechanismen wie Permeation, Adsorption und Einbettung verschiedener Moleküle und Makromoleküle mit einer Zellmembran helfen, beim Screening von Arzneimittelkandidaten und der Vorhersage potenzieller zellulärer Toxizität helfen.
Introduction
Die Zellmembran, die hauptsächlich aus Phospholipiden, Cholesterin und Proteinen besteht, ist ein entscheidender Bestandteil aller lebenden Zellen1. Mit einer durch Lipidamphiphilie getriebenen Organisation fungiert die Zellmembran als Schutzbarriere und reguliert, wie die Zelle mit ihrer Umgebung interagiert2. Mehrere zelluläre Prozesse sind abhängig von der Lipid- und Proteinzusammensetzung derMembran 1,2. Zum Beispiel sind Zellmembraninteraktionen wichtig für eine effektive Arzneimittelabgabe3. Pharmazeutika, Biologika, Nanomaterialien, biologische Toxine und Umweltgifte können die Integrität einer Zellmembran beeinflussen und dadurch die Zellfunktion beeinträchtigen4. Die Konstruktion von In-vitro-Zell-imitierenden Membranmodellen, die auf der Lipidzusammensetzung von Zellmembranen basieren, hat das Potenzial, einfache Werkzeuge bereitzustellen, um die Untersuchung der möglichen Auswirkungen dieser Materialien auf Zellen erheblich zu verbessern.
Modell-Lipiddoppelschichten umfassen Lipidvesikel, unterstützte Lipiddoppelschichten und suspendierte Lipiddoppelschichten. Unterstützte Lipiddoppelschichten sind ein Modell der Phospholipidzellmembran, die üblicherweise in biotechnologischen Anwendungen verwendet wird, bei denen Lipidvesikel auf einem trägern Substratmaterial5,6,7,8,9 gerissenwerden. Eine gängige Technik zur Überwachung der Doppelschichtbildung ist die Quarzkristallmikrowaage mit Dissipationsüberwachung (QCM-D), die die Adsorption von Vesikeln im Vergleich zu den Flüssigeneigenschaften in situuntersucht 8,10,11,12,13,14 . Zuvor wurde QCM-D verwendet, um zu zeigen, dass unter Strömungsbedingungen, sobald eine kritische Vesikelabdeckung von Phosphatidylcholin (PC) Lipidvesikeln auf der Oberfläche erreicht ist, sie spontan in starre Lipiddoppelschichten15aufbrechen. Frühere Arbeiten haben auch die unterstützte Lipiddoppelschichtbildung mit unterschiedlichen Lipidzusammensetzungen16,den Einbau von Lipidproteinen17,18,19und die Verwendung von Polymerkissen20untersucht, wodurch unterstützte Lipiddoppelschichten entstehen, die verschiedene Aspekte der Zellmembranfunktion nachahmen können.
Lipiddoppelschichten wurden verwendet, um verschiedene biologische Barrieren von subzellulären bis hin zu Organebenen nachzuahmen, einschließlich Mitochondrium, roten Blutkörperchen und Leberzellmembranen, indem die Phospholipid-, Cholesterin- und Glykolipidkomponenten verändert wurden21. Diese komplexeren Multilipidvesikel können je nach Lipidzusammensetzung zusätzliche Methoden erfordern, um eine Vesikelruptur zu erreichen. Zum Beispiel haben frühere Studien ein α-helikales (AH) Peptid verwendet, das vom nichtstrukturellen Protein 5A des Hepatitis-C-Virus abgeleitet ist, um die Doppelschichtbildung durch Destabilisierung der adsorbierten Lipidvesikel zu induzieren22,23. Unter Verwendung dieses AH-Peptids wurden zuvor unterstützte Lipiddoppelschichten gebildet, die Plazentazellen nachahmen24. Das große Potenzial unterstützter Lipiddoppelschichten für biomedizinische Anwendungen wurde mit Untersuchungen gezeigt, die den molekularen und Nanopartikeltransport25,26, umwelttoxische Wechselwirkungen27, Proteinaufbau und -funktion17,18,19, Peptidanordnung und -insertion28,29, Arzneimittelscreening30und mikrofluidische Plattformen31umfassen.
Suspendierte Lipiddoppelschichten wurden für pharmazeutische Screening-Studien über einen parallelen künstlichen Membranpermeabilitätstest (PAMPA) verwendet, bei dem eine Lipiddoppelschicht über einen porösen hydrophoben Einsatz32,33,34,35suspendiert ist. PAMPA-Lipidmodelle wurden für verschiedene biologische Grenzflächen entwickelt, einschließlich der Blut-Hirn-, bukkalen, intestinalen und transdermalen Grenzflächen36. Durch die Kombination sowohl der unterstützten Lipiddoppelschicht als auch der PAMPA-Techniken können Adsorption, Permeabilität und Einbettung von Verbindungen in Lipidkomponenten eines gewünschten Gewebes oder Zelltyps gründlich untersucht werden.
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und Anwendung von In-vitro-Zellmembran-Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung verschiedener molekularer Wechselwirkungen. Die Herstellung von sowohl Uni-Lipid- als auch Multi-Lipid-gestützten und suspendierten Lipiddoppelschichten wird detailliert beschrieben. Um eine unterstützte Lipiddoppelschicht zu bilden, werden Lipidvesikel zunächst unter Verwendung von Dünnschichthydratations- und Extrusionsmethoden entwickelt, gefolgt von einer physikalisch-chemischen Charakterisierung. Die Bildung einer unterstützten Lipiddoppelschicht unter Verwendung von QCM-D-Überwachung und Herstellung von suspendierten Lipidmembranen für den Einsatz in PAMPA wird diskutiert. Schließlich werden Multilipidvesikel für die Entwicklung komplexerer zellimitierender Membranen untersucht. Unter Verwendung beider Arten von hergestellten Lipidmembranen zeigt dieses Protokoll, wie dieses Werkzeug zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen verwendet werden kann. Insgesamt konstruiert diese Technik zellnachahmende Lipiddoppelschichten mit hoher Reproduzierbarkeit und Vielseitigkeit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll ermöglicht die Bildung von Lipidvesikeln, unterstützten Lipiddoppelschichten und suspendierten Lipiddoppelschichten. Hier werden kritische Schritte vorgestellt, um jede dieser Strukturen zu bilden. Bei der Bildung von Lipidvesikeln ist es wichtig, oberhalb der Sprungtemperatur des Lipids39zu extrudieren. Wenn unterhalb der Übergangstemperatur das Lipid physisch in seiner geordneten Gelphase39vorhanden ist. In dieser geordneten Phase sind die Kohlenwasser…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Material basiert auf Arbeiten, die von der National Science Foundation im Rahmen von Grant No. 1942418 an AS und einem Graduate Research Fellowship der National Science Foundation an C.M.B.H. unter Grant No. 1644760 unterstützt werden. Alle Meinungen, Ergebnisse und Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Material zum Ausdruck gebracht werden, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der National Science Foundation wider. Die Autoren danken Dr. Noel Vera-González für die Datenerfassung zur Charakterisierung von Lipidvesikeln. Die Autoren danken Professor Robert (Brown University) für den Einsatz seines Zetasizers. Die Autoren danken der Brown University Mass Spectrometry Facility, insbesondere Dr. Tun-Li Shen für die Unterstützung bei der Quantifizierung der Lipidzusammensetzung.
Materials
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC, 16:0-18:1 PC) | Avanti Polar Lipids | 850457 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS) | Avanti Polar Lipids | 840034 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE) | Avanti Polar Lipids | 850757 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS) | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (Δ9-Cis) PC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (Δ9-Cis) PE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt)) | Avanti Polar Lipids | 890703 | |
| 3 mL Luer-Loc syringes | BD | 309657 | |
| 40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner | Duran Wheaton Kimble | W224605 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| Alconox | Fisher Scientific | 50-821-781 | |
| Ammonium formate | Millipore Sigma | LSAC70221 | |
| C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire | Waters | 186002551 | |
| Chloroform | Millipore Sigma | LSAC288306 | |
| Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK | Sarstedt | 67.758.001 | |
| Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) | Millipore Sigma | 36735 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | LSAC472301 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Filter supports, 10 mm | Avanti Polar Lipids | 610014 | Size for mini extruder |
| Folded capillary zeta cell | Malvern Panalytical | DTS1070 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764-4L | |
| Kimwipes | Kimberly Clark | 34256 | |
| L-α-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI) | Avanti Polar Lipids | 840044 | |
| L-α-phosphitidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| LiposoFast ® LF-50 | Avestin, Inc. | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 – 4L | |
| Mini-extruder set with holder/heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45 µm, clear, sterile | Millipore Sigma | MAIPS4510 | for PAMPA studies |
| Nitrogen gas, ultrapure | TechAir | NI T5.0 | |
| Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um | Whatman | 800309 | Size for mini extruder |
| Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um | Whatman | 110605 | Size for large extruder |
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| Phosphate buffer saline (PBS), 10x | Genesee Scienfitic | 25-507X | Dilute to 1x |
| Qsoft 401 software | Biolin Scientific | ||
| Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer | Biolin Scientific | ||
| Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL | Duran Wheaton Kimble | 986561 | |
| Silicon Dioxide, thin QSensors | Biolin Scientific | QSX 303 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Millipore Sigma | LSACS5886 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Solvent Safe pipette tips | Sigma-Aldrich | S8064 | |
| Sphingomyelin (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 860061 | |
| Trizma base | Millipore Sigma | LSACT1503 | |
| Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid | Caisson Labs | TRL01-6X100ML | |
| Whatman drain disc, 25 mm | Whatman | 230600 | Size for large extruder |
| Zetasizer ZS90 | Malvern Panalytical | ||
| Zetasizer 7.01 software | Malvern Panalytical |
Riferimenti
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