Ensamblaje de modelos de bicapa lipídica soportada y suspendida de imitación celular para el estudio de interacciones moleculares
Summary
Este protocolo describe la formación de vesículas unilipídicas y multilipídicas que imitan a las células, bicapas lipídicas soportadas y bicapas lipídicas suspendidas. Estos modelos in vitro se pueden adaptar para incorporar una variedad de tipos de lípidos y se pueden utilizar para investigar diversas interacciones de moléculas y macromoléculas.
Abstract
Las membranas celulares modelo son una herramienta de detección útil con aplicaciones que van desde el descubrimiento temprano de fármacos hasta los estudios de toxicidad. La membrana celular es una barrera protectora crucial para todos los tipos de células, separando los componentes celulares internos del entorno extracelular. Estas membranas están compuestas en gran parte por una bicapa lipídica, que contiene grupos de cabeza hidrófilos externos y grupos de cola hidrófobos internos, junto con varias proteínas y colesterol. La composición y la estructura de los lípidos en sí mismos juegan un papel crucial en la regulación de la función biológica, incluidas las interacciones entre las células y el microambiente celular, que puede contener productos farmacéuticos, toxinas biológicas y tóxicos ambientales. En este estudio, se describen métodos para formular bicapas lipídicas y multilipídicas apoyadas y suspendidas que imitan a las células lipídicas. Anteriormente, se desarrollaron bicapas lipídicas de fosfatidilcolina (PC) unilídicas, así como bicapas lipídicas inspiradas en trofoblastos placentarios multilípidos para su uso en la comprensión de las interacciones moleculares. Aquí, se presentarán los métodos para lograr ambos tipos de modelos bicapa. Para las bicapas multilipídicas que imitan a las células, la composición lipídica deseada se determina primero mediante la extracción de lípidos de células primarias o líneas celulares, seguida de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). Utilizando esta composición, las vesículas lipídicas se fabrican utilizando un método de hidratación y extrusión de película delgada y se caracterizan su diámetro hidrodinámico y potencial zeta. Las bicapas lipídicas soportadas y suspendidas se pueden formar utilizando microbalanza de cristal de cuarzo con monitoreo de disipación (QCM-D) y en una membrana porosa para su uso en un ensayo de permeabilidad de membrana artificial paralela (PAMPA), respectivamente. Los resultados representativos destacan la reproducibilidad y versatilidad de los modelos de bicapa lipídica de membrana celular in vitro. Los métodos presentados pueden ayudar en la evaluación rápida y fácil de los mecanismos de interacción, como la permeación, la adsorción y la incrustación, de varias moléculas y macromoléculas con una membrana celular, ayudando en la detección de candidatos a fármacos y la predicción de la toxicidad celular potencial.
Introduction
La membrana celular, compuesta principalmente de fosfolípidos, colesterol y proteínas, es un componente crucial de todas las células vivas1. Con una organización impulsada por la anfifilia lipídica, la membrana celular funciona como una barrera protectora y regula cómo la célula interactúa con su entorno circundante2. Varios procesos celulares dependen de la composición lipídica y proteica de la membrana1,2. Por ejemplo, las interacciones de la membrana celular son importantes para la administración efectiva de fármacos3. Los productos farmacéuticos, biológicos, nanomateriales, toxinas biológicas y tóxicos ambientales pueden afectar la integridad de una membrana celular, afectando así la función celular4. La construcción de modelos de membrana que imitan células in vitro basados en la composición lipídica de las membranas celulares tiene el potencial de proporcionar herramientas fáciles para mejorar en gran medida el estudio del impacto potencial de estos materiales en las células.
Las bicapas lipídicas modelo incluyen vesículas lipídicas, bicapas lipídicas soportadas y bicapas lipídicas suspendidas. Las bicapas lipídicas soportadas son un modelo de la membrana celular fosfolípida comúnmente utilizada en aplicaciones biotecnológicas donde las vesículas lipídicas se rompen sobre un material de sustrato soportado5,6,7,8,9. Una técnica común utilizada para monitorear la formación de bicapa es la microbalanza de cristal de cuarzo con monitoreo de disipación (QCM-D), que examina la adsorción de vesículas en comparación con las propiedades líquidas a granel in situ8,10,11,12,13,14 . Anteriormente, QCM-D se ha utilizado para demostrar que en condiciones de flujo, una vez que se logra una cobertura crítica de vesículas lipídicas de fosfatidilcolina (PC) en la superficie, se rompen espontáneamente en bicapas lipídicas rígidas15. Trabajos anteriores también han investigado la formación de bicapas lipídicas apoyadas con composiciones lipídicas variables16,la incorporación de proteínas lipídicas17, 18,19y la utilización de cojines de polímeros20,produciendo bicapas lipídicas soportadas capaces de imitar varios aspectos de la función de la membrana celular.
Las bicapas lipídicas se han utilizado para imitar varias barreras biológicas desde los niveles subcelulares hasta los de órganos, incluidas la mitocondria, los glóbulos rojos y las membranas de las células hepáticas, alterando los componentes de fosfolípidos, colesterol y glicolípidos21. Estas vesículas multilipídicas más complejas pueden requerir métodos adicionales para lograr la ruptura de la vesícula, dependiendo de la composición lipídica. Por ejemplo, estudios previos han utilizado un péptido α-helicoidal (AH) derivado de la proteína no estructural 5A del virus de la hepatitis C para inducir la formación de bicapa desestabilizando las vesículas lipídicas adsorbidas22,23. Usando este péptido AH, previamente se han formado bicapas lipídicas soportadas que imitan las célulasplacentarias 24. El gran potencial de las bicapas lipídicas soportadas para aplicaciones biomédicas se ha demostrado con investigaciones que abarcan el transporte molecular y de nanopartículas25,26,interacciones tóxicas ambientales27,ensamblaje y función de proteínas17,18,19,disposición e inserción de péptidos28,29,detección de fármacos30y plataformas microfluídicas31.
Las bicapas lipídicas suspendidas se han utilizado para estudios de cribado farmacéutico a través de un ensayo paralelo de permeabilidad a la membrana artificial (PAMPA) donde se suspende una bicapa lipídica a través de un inserto hidrofóbico poroso32,33,34,35. Se han desarrollado modelos lipídicos de PAMPA para diferentes interfaces biológicas, incluidas las interfaces sangre-cerebro, bucal, intestinal y transdérmica36. Al combinar tanto la bicapa lipídica soportada como las técnicas PAMPA, se puede estudiar a fondo la adsorción, la permeabilidad y la incrustación de compuestos dentro de los componentes lipídicos de un tejido o tipo de célula deseado.
Este protocolo describe la fabricación y aplicación de modelos de bicapa lipídica de membrana celular in vitro para investigar varias interacciones moleculares. Se detalla la preparación de las bicapas lipídicas y suspendidas de lípidos unilipídicas y multilídicas. Para formar una bicapa lipídica soportada, las vesículas lipídicas se desarrollan primero utilizando métodos de hidratación y extrusión de película delgada seguidos de caracterización fisicoquímica. Se discute la formación de una bicapa lipídica soportada utilizando el monitoreo QCM-D y la fabricación de membranas lipídicas suspendidas para su uso en PAMPA. Finalmente, se examinan las vesículas multilipídicas para el desarrollo de membranas que imitan células más complejas. Utilizando ambos tipos de membranas lipídicas fabricadas, este protocolo demuestra cómo esta herramienta se puede utilizar para estudiar las interacciones moleculares. En general, esta técnica construye bicapas lipídicas que imitan a las células con alta reproducibilidad y versatilidad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo permite la formación de vesículas lipídicas, bicapas lipídicas soportadas y bicapas lipídicas suspendidas. Aquí, se presentan pasos críticos para formar cada una de estas estructuras. Al formar vesículas lipídicas, es importante extruir por encima de la temperatura de transición del lípido39. Cuando está por debajo de la temperatura de transición, el lípido está físicamente presente en su fase de gel ordenada39. En esta fase ordenada, las cola…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este material se basa en el trabajo apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias bajo la Subvención No. 1942418 otorgada a A.S., y una Beca de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias otorgada a C.M.B.H., bajo la Subvención No. 1644760. Todas las opiniones, hallazgos y conclusiones o recomendaciones expresadas en este material son las de los autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista de la National Science Foundation. Los autores agradecen al Dr. Noel Vera-González por la adquisición de datos de caracterización de vesículas lipídicas. Los autores agradecen al profesor Robert Hurt (Universidad de Brown) por el uso de su Zetasizer. Los autores agradecen a la Instalación de Espectrometría de Masas de la Universidad de Brown, en particular, al Dr. Tun-Li Shen por su ayuda para cuantificar la composición lipídica.
Materials
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC, 16:0-18:1 PC) | Avanti Polar Lipids | 850457 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS) | Avanti Polar Lipids | 840034 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE) | Avanti Polar Lipids | 850757 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS) | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (Δ9-Cis) PC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (Δ9-Cis) PE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt)) | Avanti Polar Lipids | 890703 | |
| 3 mL Luer-Loc syringes | BD | 309657 | |
| 40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner | Duran Wheaton Kimble | W224605 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| Alconox | Fisher Scientific | 50-821-781 | |
| Ammonium formate | Millipore Sigma | LSAC70221 | |
| C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire | Waters | 186002551 | |
| Chloroform | Millipore Sigma | LSAC288306 | |
| Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK | Sarstedt | 67.758.001 | |
| Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) | Millipore Sigma | 36735 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | LSAC472301 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Filter supports, 10 mm | Avanti Polar Lipids | 610014 | Size for mini extruder |
| Folded capillary zeta cell | Malvern Panalytical | DTS1070 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764-4L | |
| Kimwipes | Kimberly Clark | 34256 | |
| L-α-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI) | Avanti Polar Lipids | 840044 | |
| L-α-phosphitidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| LiposoFast ® LF-50 | Avestin, Inc. | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 – 4L | |
| Mini-extruder set with holder/heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45 µm, clear, sterile | Millipore Sigma | MAIPS4510 | for PAMPA studies |
| Nitrogen gas, ultrapure | TechAir | NI T5.0 | |
| Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um | Whatman | 800309 | Size for mini extruder |
| Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um | Whatman | 110605 | Size for large extruder |
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| Phosphate buffer saline (PBS), 10x | Genesee Scienfitic | 25-507X | Dilute to 1x |
| Qsoft 401 software | Biolin Scientific | ||
| Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer | Biolin Scientific | ||
| Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL | Duran Wheaton Kimble | 986561 | |
| Silicon Dioxide, thin QSensors | Biolin Scientific | QSX 303 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Millipore Sigma | LSACS5886 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Solvent Safe pipette tips | Sigma-Aldrich | S8064 | |
| Sphingomyelin (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 860061 | |
| Trizma base | Millipore Sigma | LSACT1503 | |
| Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid | Caisson Labs | TRL01-6X100ML | |
| Whatman drain disc, 25 mm | Whatman | 230600 | Size for large extruder |
| Zetasizer ZS90 | Malvern Panalytical | ||
| Zetasizer 7.01 software | Malvern Panalytical |
Riferimenti
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