분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립
Summary
이 프로토콜은 유니 지질 및 다중 지질 소포, 지원지질 이중층 및 일시 중단 된 지질 이중 층을 모방 하는 세포의 형성을 설명 합니다. 이러한 체외 모델은 다양한 지질 유형을 통합하도록 조정할 수 있으며 다양한 분자 및 거대 분자 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
모델 세포막은 초기 약물 발견에서 독성 연구에 이르기까지 응용 프로그램과 유용한 선별 도구입니다. 세포막은 세포 외 환경에서 내부 세포 구성 요소를 분리하는 모든 세포 유형에 대한 중요한 보호 장벽입니다. 이 막은 다양한 단백질 과 콜레스테롤과 더불어 외부 소수성 머리 단 및 내부 소수성 꼬리 단을 포함하는 지질 이중층의 주로 구성됩니다. 지질 자체의 조성 및 구조는 제약, 생물학적 독소 및 환경 독성물질을 포함할 수 있는 세포와 세포 미세 환경 간의 상호 작용을 포함하여 생물학적 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 이 연구에서는 지질 이중층을 모방한 단지질 및 다중 지질 지원 및 일시 중단 된 세포를 제조하는 방법이 설명되어 있습니다. 이전에는 지질 지질 인산화(PC) 지질 이중층뿐만 아니라 다중 지질 태반 열대 성 에서 영감을 얻은 지질 이중층이 분자 상호 작용을 이해하는 데 사용하기 위해 개발되었습니다. 여기서 두 가지 유형의 이중 레이어 모델을 달성하기 위한 방법이 표시됩니다. 다중 지질 양층을 모방하는 세포의 경우, 원하는 지질 조성물은 먼저 액체 크로마토그래피 질량 분광법(LC-MS)에 선행된 1차 세포 또는 세포주로부터지질 추출을 통해 결정된다. 이 조성물을 사용하여, 지질 소포는 박막 수분 공급 및 압출 방법을 사용하여 제조되고 그들의 유체 역학 직경 및 제타 전위가 특징입니다. 지원되고 중단된 지질 양층은 각각 소멸 모니터링(QCM-D)을 이용한 석영 결정 마이크로밸런스를 이용하여 다공성 멤브레인에 형성될 수 있다. 대표적인 결과는 체외 세포막 지질 이중층 모델의 재현성과 다재다능함을 강조한다. 제시된 방법은 세포막을 가진 각종 분자 및 거대 분자의 투과, 흡착 및 embedment와 같은 상호 작용 기계장치의 신속하고 촉진적인 평가를 도울 수 있고, 약물 후보의 검열 및 잠재적인 세포 독성의 예측을 돕는.
Introduction
주로 인지질, 콜레스테롤 및 단백질로 구성된 세포막은 모든 살아있는 세포1의중요한 구성 요소입니다. 지질 양용성에 의해 구동되는 조직으로, 세포막은 보호 장벽으로 작동하고 세포가 주변 환경과 상호 작용하는 방법을조절2. 몇몇 세포 과정은 막1,2의지질 및 단백질 조성에 의존한다. 예를 들어, 세포막 상호 작용은 효과적인 약물 전달에 중요하다3. 제약, 생물학적 제제, 나노 물질, 생물학적 독소 및 환경 독성물질은 세포막의 무결성에 영향을 미치므로 세포 기능4에영향을 미칠 수 있다. 세포막의 지질 조성에 기초하여 멤브레인 모델을 모방하는 체외 세포 의 건설은 세포에 대한 이러한 물질의 잠재적 영향에 대한 연구를 크게 향상시키는 촉진 도구를 제공 할 가능성이 있다.
모델 지질 이중층은 지질 소포, 지원되는 지질 이중층 및 일시 중단된 지질 이중층을 포함한다. 지원되는 지질 이중층은 지질 소포가 지원되는 기판물질5,6,7,8,9에서파열되는 생명 공학 응용 분야에서 일반적으로 사용되는 인지질 세포막의 모델이다. 이중층 형성을 모니터링하는 데 사용되는 일반적인 기술 중 하나는 폐기 모니터링(QCM-D)을 사용하는 석영 결정 마이크로밸런스로, 이 경우, 시투8,10,11, 12,13,14의 벌크 액상 특성과 비교하여 소포의 흡착을 검사합니다. . 이전에는, QCM-D는 유동 조건하에서, 일단 포스파디들콜린 (PC) 지질 소포의 중요한 소포 커버리지가 표면에 달성되면, 그들은 자발적으로 강성 지질 이중층으로 파열한다는 것을 입증하기 위하여 이용되었습니다15. 이전 연구는 또한 다양한 지질조성물(16)을이용한 지원지질 이중층 형성, 지질 단백질17,18,19의편입, 폴리머쿠션(20)을활용하여 세포막 기능의 다양한 측면을 모방할 수 있는 지지지질 이중층을 산출하는 것을 조사하였다.
지질 이중층은 인지질, 콜레스테롤 및 글리콜리피드성분(21)을변경하여 미토콘드리온, 적혈구 및 간 세포막을 포함한 장기 수준으로 세포 에서 다양한 생물학적 장벽을 모방하는 데 사용되어 왔다. 이러한 더 복잡한 다중 지질 소포는 지질 조성물에 따라 소포 파열을 달성하기 위한 추가적인 방법이 필요할 수 있다. 예를 들어, 이전 연구는 C형 간염 바이러스의 비구조적 단백질(5A)으로부터 유래된 α-헬릭탈(AH) 펩티드를 활용하여 흡착지질소포(22,23)를불안정하게 함으로써 이중층 형성을 유도한다. 이 AH 펩티드를 이용하여, 태반 세포를 모방한 지지지질 이중층은 이전에형성되었다 24. 생체 의학 응용을 위한 지원지질 이중층의 큰 잠재력은 분자 및 나노입자 수송25,26,환경 독성 상호 작용 27, 단백질 조립 및 기능17,18,19,펩티드 배열 및 삽입28,29,약물 스크리닝 30 및 미세 유체 플랫폼31에걸친 조사와 함께 입증되었다.
일시 중단된 지질 이중층은 다공성 소수성인서트(32,33,34,35)에걸쳐 지질 이중층이 일시 중단되는 병렬 인공 막 투과성 분석(PAMPA)을 통해 약제학적 스크리닝 연구에 사용되어 왔다. PAMPA 지질 모델은 혈액-뇌, 부칼, 장 및 경피인터페이스(36)를포함한 다양한 생물학적 인터페이스를 위해 개발되었다. 지원되는 지질 이중층 과 PAMPA 기술을 결합함으로써, 원하는 조직 또는 세포 유형의 지질 성분 내에서 화합물의 흡착, 투과성 및 포함을 철저히 연구할 수 있다.
이 프로토콜은 여러 분자 상호 작용을 조사하기 위해 체외 세포막 지질 이중층 모델의 제조 및 적용을 설명합니다. 유니지질과 다중 지질 지원 및 일시 중단 된 지질 이중 레이어의 준비는 상세합니다. 지원되는 지질 이중층을 형성하기 위해, 지질 소포는 먼저 박막 수분화 및 압출 방법을 사용하여 개발되었으며, 그 다음에 물리화학적 특성화가 뒤따릅니다. PAMPA에서 사용하기 위해 중단된 지질 막의 QCM-D 모니터링 및 제조를 사용하여 지원되는 지질 이중층의 형성에 대해 논의된다. 마지막으로, 멤브레인을 모방하는 더 복잡한 세포 의 발달을 위한 다중 지질 소포를 검사합니다. 두 가지 유형의 제조 된 지질 막을 사용하여이 프로토콜은이 도구를 사용하여 분자 상호 작용을 연구하는 방법을 보여줍니다. 전반적으로,이 기술은 높은 재현성과 다재 다능성을 가진 지질 이중층을 모방 세포를 생성합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 지질 소포의 형성을 허용, 지원 지질 이중 층, 및 일시 중단 지질 이중 층. 여기서는 이러한 각 구조를 형성하기 위한 중요한 단계가 제공됩니다. 지질 소포를 형성할 때,지질(39)의전이 온도 이상으로 돌출하는 것이 중요하다. 전이 온도 이하의 경우, 지질은 주문된 젤 상39에물리적으로 존재한다. 이 주문된 단계에서 탄화수소 지질 꼬리는 완전히 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 자료는 그랜트 제1942418 하여 국립과학재단이 지원하는 작품과 1644760 C.M.B.H.에 수여된 국립과학재단 대학원 연구 펠로우십을 기반으로 합니다. 이 자료에 표현된 의견, 사실 인정 및 결론 또는 권고사항은 저자의 의견이며 반드시 국립 과학 재단의 견해를 반영하지는 않습니다. 저자는 지질 소포 특성화 데이터 수집에 대한 박사 노엘 베라 – 곤잘레스 에게 감사드립니다. 저자는 그의 제타저 사용에 대한 교수 로버트 허트 (브라운 대학)에게 감사드립니다. 저자는 브라운 대학 질량 분광 시설, 특히, 박사 툰 리 셴 지질 구성정량에 대한 도움을 주셔서 감사합니다.
Materials
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC, 16:0-18:1 PC) | Avanti Polar Lipids | 850457 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS) | Avanti Polar Lipids | 840034 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE) | Avanti Polar Lipids | 850757 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS) | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (Δ9-Cis) PC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (Δ9-Cis) PE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt)) | Avanti Polar Lipids | 890703 | |
| 3 mL Luer-Loc syringes | BD | 309657 | |
| 40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner | Duran Wheaton Kimble | W224605 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| Alconox | Fisher Scientific | 50-821-781 | |
| Ammonium formate | Millipore Sigma | LSAC70221 | |
| C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire | Waters | 186002551 | |
| Chloroform | Millipore Sigma | LSAC288306 | |
| Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK | Sarstedt | 67.758.001 | |
| Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) | Millipore Sigma | 36735 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | LSAC472301 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Filter supports, 10 mm | Avanti Polar Lipids | 610014 | Size for mini extruder |
| Folded capillary zeta cell | Malvern Panalytical | DTS1070 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764-4L | |
| Kimwipes | Kimberly Clark | 34256 | |
| L-α-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI) | Avanti Polar Lipids | 840044 | |
| L-α-phosphitidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| LiposoFast ® LF-50 | Avestin, Inc. | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 – 4L | |
| Mini-extruder set with holder/heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45 µm, clear, sterile | Millipore Sigma | MAIPS4510 | for PAMPA studies |
| Nitrogen gas, ultrapure | TechAir | NI T5.0 | |
| Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um | Whatman | 800309 | Size for mini extruder |
| Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um | Whatman | 110605 | Size for large extruder |
| Parafilm | Bemis | PM999 | |
| Phosphate buffer saline (PBS), 10x | Genesee Scienfitic | 25-507X | Dilute to 1x |
| Qsoft 401 software | Biolin Scientific | ||
| Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer | Biolin Scientific | ||
| Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL | Duran Wheaton Kimble | 986561 | |
| Silicon Dioxide, thin QSensors | Biolin Scientific | QSX 303 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Millipore Sigma | LSACS5886 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Solvent Safe pipette tips | Sigma-Aldrich | S8064 | |
| Sphingomyelin (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids | 860061 | |
| Trizma base | Millipore Sigma | LSACT1503 | |
| Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid | Caisson Labs | TRL01-6X100ML | |
| Whatman drain disc, 25 mm | Whatman | 230600 | Size for large extruder |
| Zetasizer ZS90 | Malvern Panalytical | ||
| Zetasizer 7.01 software | Malvern Panalytical |
Riferimenti
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