Summary
Hier presenteren we een protocol voor de verrijking van endogene fosfoproteïnefosfatasen en hun interagerende eiwitten uit cellen en weefsels en hun identificatie en kwantificering door op massaspectrometrie gebaseerde proteomica.
Abstract
De meeste cellulaire processen worden gereguleerd door dynamische eiwitfosforylering. Meer dan driekwart van de eiwitten is gefosforyleerd en fosfoproteïnefosfatasen (PPP's) coördineren meer dan 90% van alle cellulaire serine / threonine-defosforylering. Deregulering van eiwitfosforylering is betrokken bij de pathofysiologie van verschillende ziekten, waaronder kanker en neurodegeneratie. Ondanks hun wijdverspreide activiteit zijn de moleculaire mechanismen die PPP's beheersen en die gecontroleerd door PPP's slecht gekarakteriseerd. Hier wordt een proteomische benadering beschreven die fosfataseremmerparels en massaspectrometrie (PIB-MS) wordt genoemd om PPP's, hun posttranslationele modificaties en hun interactoren in slechts 12 uur te identificeren en te kwantificeren met behulp van een cellijn of weefsel. PIB-MS maakt gebruik van een niet-selectieve PPP-remmer, microcystine-LR (MCLR), geïmmobiliseerd op sepharose-kralen om endogene PPP's en hun bijbehorende eiwitten te vangen en te verrijken (het PPPome genoemd). Deze methode vereist geen exogene expressie van gelabelde versies van PPP's of het gebruik van specifieke antilichamen. PIB-MS biedt een innovatieve manier om de evolutionair geconserveerde PPP's te bestuderen en ons huidige begrip van defosforyleringssignalering uit te breiden.
Introduction
Eiwitfosforylering regelt de meeste cellulaire processen, inclusief maar niet beperkt tot de reactie op DNA-schade, groeifactorsignalering en de passage door mitose 1,2,3. In zoogdiercellen worden de meeste eiwitten op een bepaald moment gefosforyleerd op een of meer serine-, threonine- of tyrosineresiduen, waarbij fosfostropenen en fosfoothreonines ongeveer 98% van alle fosforyleringsplaatsen uitmaken 2,3. Hoewel kinasen uitgebreid zijn bestudeerd in cellulaire signalering, is de rol van PPP's in de regulatie van dynamische cellulaire processen nog steeds in opkomst.
Fosforyleringsdynamiek wordt gecontroleerd door het dynamische samenspel tussen kinasen en fosfatasen. In zoogdiercellen zijn er meer dan 400 eiwitkinasen die serine / threoninefosforylering katalyseren. Meer dan 90% van deze sites wordt gedefosforyleerd door fosfoproteïnefosfatasen (PPP's), een kleine familie van enzymen die bestaat uit PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT en PPZ 2,3. PP1 en PP2A zijn verantwoordelijk voor de meerderheid van fosfosforrine en fosfotheonine defosforylering in een cel 2,3,4. Het opmerkelijke verschil in aantal tussen kinasen en fosfatasen en het gebrek aan specificiteit van PPP katalytische subeenheden in vitro leidden tot de overtuiging dat kinasen de belangrijkste determinant zijn van fosforylering 2,3. Meerdere studies hebben echter aangetoond dat fosfatasen substraatspecificiteit vaststellen door de vorming van multimere holo-enzymen 5,6,7,8,9. PP1 is bijvoorbeeld een heterodimeer dat bestaat uit een katalytische subeenheid en op een gegeven moment een van de meer dan 150 regulerende subeenheden 6,7,8. Omgekeerd is PP2A een heterotrimeer dat wordt gevormd uit een steiger (A), een regulerende (B) en een katalytische (C) subeenheid 2,3,9. Er zijn vier verschillende families van PP2A regulerende subeenheden (B55, B56, PR72 en striatine), elk met meerdere genen, splicevarianten en lokalisatiepatronen 2,3,9. Het multimere karakter van PPP's vult de leemte in het aantal kinasen en PPP-katalytische subeenheden. Het creëert echter analytische uitdagingen voor het bestuderen van PPP-signalering. Om PPP-signalering uitgebreid te analyseren, is het van cruciaal belang om de verschillende holo-enzymen in een cel of weefsel te onderzoeken. Er is grote vooruitgang geboekt bij het bestuderen van het menselijke kinoom door het gebruik van kinaseremmerparels, multiplexremmerparels of kinobeads genoemd, een chemische proteomische strategie waarbij kinaseremmers worden geïmmobiliseerd op kralen en massaspectrometrie wordt gebruikt om verrijkte kinasen en hun interactoren te identificeren 10,11,12,13.
We hebben een vergelijkbare aanpak vastgesteld om PPP-biologie te bestuderen. Deze techniek omvat affiniteitsvangst van PPP-katalytische subeenheden met behulp van kralen met een geïmmobiliseerde, niet-selectieve PPP-remmer genaamd microcystine-LR (MCLR) genaamd fosfataseremmerparels (PIBs)14,15. In tegenstelling tot andere methoden die de endogene tagging of expressie van exogene PPP-subeenheden vereisen die de eiwitactiviteit of lokalisatie kunnen veranderen, maakt PIB-MS de verrijking mogelijk van endogene PPP-katalytische subeenheden, hun bijbehorende regulerende en steigerende subeenheden en interagerende eiwitten (het PPPome genoemd) uit cellen en weefsels op een bepaald tijdstip of onder specifieke behandelingsomstandigheden. MCLR remt PP1, PP2A, PP4-6, PPT en PPZ bij nanomolaire concentraties, waardoor PIB's zeer effectief zijn in het verrijken voor de PPPome16. Deze methode kan worden geschaald voor gebruik op elk uitgangsmateriaal, van cellen tot klinische monsters. Hier beschrijven we in detail het gebruik van PIB's en massaspectrometrie (PIB-MS) om het endogene PPPome en de modificatietoestanden efficiënt vast te leggen, te identificeren en te kwantificeren.
Figuur 1: Visuele samenvatting van het PIB-MS protocol. In een PIB-MS-experiment kunnen monsters worden verkregen in verschillende vormen, van cellen tot tumoren. Het monster wordt verzameld, gelyseerd en gehomogeniseerd voorafgaand aan PPP-verrijking. Ter verrijking voor PPP's wordt het lysaat geïncubeerd met PIB's met of zonder PPP-remmer, zoals MCLR. De PIB's worden vervolgens gewassen en PPP's worden geëlueerd in denatureringsomstandigheden. De monsters worden voorbereid voor massaspectrometrie-analyse door de verwijdering van detergentia door sp3-eiwitverrijking, tryptische vertering en ontzouting. Monsters kunnen dan optioneel TMT-gelabeld worden voorafgaand aan massaspectrometrie analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
PIB-MS omvat lysis en klaring van cellen of weefsels, incubatie van het lysaat met PIBs, elutie en analyse van het eluaat via western blotting of op massaspectrometrie gebaseerde benaderingen (figuur 1). De toevoeging van vrije MCLR kan worden gebruikt als een controle om specifieke PIB-bindmiddelen te onderscheiden van niet-specifieke interactoren. Voor de meeste toepassingen kan een labelvrije aanpak worden gebruikt om eiwitten in eluaten direct te identificeren. In gevallen waarin een grotere precisie in kwantificering of de identificatie van soorten met een lage abundantie nodig is, kan verdere verwerking met tandem mass-tag (TMT) -etikettering worden gebruikt om de dekking te vergroten en de input te verminderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De generatie van PIBs wordt gedaan zoals beschreven door Moorhead et al., waarbij 1 mg microcystine en ongeveer 6 ml sepharose worden gekoppeld om PIBs te genereren met een bindingscapaciteit van maximaal 5 mg / ml17.
1. Monstervoorbereiding
OPMERKING: Een typische starthoeveelheid voor PIB-MS is 1 mg totaal eiwit per aandoening. Voor dit experiment werden ongeveer 2,5 x 106 HeLa-cellen gebruikt om 1 mg eiwit te extraheren. Deze berekening moet worden uitgevoerd voor elke cellijn of weefsel dat in een experiment wordt gebruikt18. Als het monster beperkt is en 1 mg niet kan worden verkregen, kan de hoeveelheid input worden verminderd met een klein verlies van PPP-subeenheiddetectie. Als alternatief kan TMT-etikettering worden gebruikt om het mengen van alle omstandigheden in één monster mogelijk te maken, waardoor de gevoeligheid van detectie wordt verhoogd, zoals weergegeven in stap 9.
- Verzamel weefselmonsters of celpellets. Verzamel voor celpellets cellen door centrifugering bij 277 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT), verwijder media en was de cellen met 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Celpellets kunnen gedurende enkele maanden bij -80 °C worden bewaard.
- Bereid lysisbuffer (500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5% Triton X-100 (vol/vol), 5 mM beta-glycerofosforzuur dinatriumzout pentahydraat, 1:500 (vol/vol) proteaseremmer cocktail III) en houd op ijs. Maak genoeg om alle monsters te lyseren en te wassen. Als u begint met 1 mg eiwit per aandoening, maak dan ongeveer 3 ml buffer per monster voor lysis en wasbeurten.
OPMERKING: De lysisbuffer die in deze stap wordt opgemerkt, is een milde reinigingsoplossing, die mogelijk niet voldoende is om onoplosbare membraan- of cytoskelet-geassocieerde eiwitten op te lossen. Andere detergentia kunnen worden onderzocht om de oplosbaarheid te verbeteren. Een reeks NaCl- en Triton-X-100-concentraties werd getest en de bovenstaande concentraties bleken optimaal te zijn voor lage achtergrond- en hoge fosfatase-subeenheidbinding. - Voeg gekoelde lysisbuffer toe aan de monsters. Gebruik voor lysis van 1 mg eiwit 1 ml buffer. Als het monster bevroren is, voegt u de lysisbuffer toe en laat u het monster ontdooien op ijs in de buffer.
- Voor cellen, homogeniseer de monsters via sonificatie, houd de cellen op ijs tussen pulsen. Soniceer de monsters met 15% amplitude met drie pulsen van 15 s. Dit kan variëren afhankelijk van de gebruikte sonicator (zie Materiaaltabel).
- Homogeniseer de monsters eerst met een Dounce-weefselslijper om het weefsel vloeibaar te maken voordat het vloeibaar wordt gemaakt voordat het wordt gesoniseerd zoals beschreven in stap 1.3.1.
- Verduidelijk het gehomogeniseerde monster van onoplosbaar puin door centrifugeren bij 21.130 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Breng vervolgens, zonder de gevormde pellets of lipiden te verstoren die zich aan de zijkant van de buizen hebben verzameld, de lysaten over naar nieuwe buizen. Verwijder indien gewenst 100 μL van het voorverrijkingsmonster van het geklaarde lysaat en bewaar bij -20 °C. Zorg ervoor dat je de lysaten op ijs houdt.
- Bepaal het totale eiwitgehalte in elk monster door een eiwitkwantificeringstest uit te voeren, zoals een bicinchonininezuurtest (BCA), op een kleine aliquot van elk monster, volgens de instructies van de fabrikant. Zorg ervoor dat de lysaten op ijs worden bewaard tijdens de BCA-test.
- Breng na het uitvoeren van de BCA-test een equivalente hoeveelheid eiwit over naar nieuwe buizen en verdun met lysisbuffer om ervoor te zorgen dat elke buis dezelfde eiwitconcentratie heeft (bijv. 1 mg / ml). Als het experiment een PPP-remmercontrole vereist, bereidt u twee aliquots van elk monster met hetzelfde eiwitgehalte en gaat u verder met stap 1.7. Als PPP-remmercontroles niet nodig zijn, gaat u verder met stap 2. Zorg ervoor dat monsters op ijs worden bewaard.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat gelijke eiwitconcentraties per aandoening worden gebruikt in een PIB-MS-analyse. PPP-remmercontroles worden gebruikt om specifieke bindmiddelen voor PIB's te onderscheiden van de niet-specifieke achtergrond. - Behandel voor de PPP-remmercontrole één monster met vrije MCLR (1 μM) en het andere met een gelijk volume DMSO als controle. Vortex de monsters voorzichtig en incubeer ze op ijs gedurende 15 minuten.
OPMERKING: MCLR-behandeling van de lysaten blokkeert de binding van PPP-katalytische subeenheden, maar niet eiwitten die niet-specifiek binden aan PIB's in de monsters. Wees voorzichtig bij het hanteren van MCLR omdat het giftig is. Raadpleeg de voorzorgsmaatregelen voor het hanteren in de materiaaltabel.
2. Voorbereiding van PIB's
- Bepaal de hoeveelheid PIB's die nodig zijn voor het experiment. Voor 1 mg eiwit kan 1-3 μg PPP's en interagerende eiwitten worden verkregen; gebruik ten minste 10 μL vaste PIBs-hars per monster om kraalverlies te minimaliseren. De bindingscapaciteit van PIBs is 3-5 mg/ml14,17.
- Breng de juiste hoeveelheid PIBs over in een buis van 1,5 ml en was ze 3x met 0,5 ml lysisbuffer door zachtjes te vortexen en vervolgens te centrifugeren op 376 x g gedurende 30 s bij RT tussen de wasbeurten door. Vermijd het pipetteren van de kralen bij het verwijderen van de lysisbuffer tussen wasbeurten.
- Maak een 50% PIB/bufferoplossing (vol/vol) door een geschikte hoeveelheid lysisbuffer toe te voegen aan de gewassen PIB's. Pipetteer voorzichtig op en neer en draai de pipetpunt in de slurry om de PIB's te resuspenderen.
- Breng 20 μL van de slurry over naar een nieuwe buis van 1,5 ml die al 0,5 ml lysisbuffer bevat. De lysisbuffer in de buis helpt bij het verdrijven van de kralen uit de pipetpunt. Doe dit totdat er voldoende buizen zijn met een gelijke hoeveelheid PIBs voor elk monster.
- Draai de buizen op 376 x g gedurende 30 s bij RT. Zorg ervoor dat alle buizen een gelijke hoeveelheid kraalhars bevatten. Gooi elk supernatant weg en laat alleen vaste hars en maximaal 50 μL lysisbuffer in elke buis achter.
3. Incubatie van PIB's met lysaten
- Breng de lysaten over van stap 1.6. of stap 1.7. naar de naar behoren geëtiketteerde buis met PIBs uit stap 2. Draai het lysaat op 8 rpm met de PIBs gedurende 1 uur bij 4 °C.
4. Wassen van PIBs
- Centrifugeer de PIBs bij 376 x g gedurende 30 s bij 4 °C om de kralen op te vangen. Verwijder en gooi het supernatant weg en bewaar een aliquot van 100 μL voor analyse na de verrijking, indien gewenst.
- Was de PIBs 3x door 0,5 ml lysisbuffer aan de kralen toe te voegen, de buizen om te keren (vortexing niet aanbevolen), de kralen te verzamelen door centrifugeren bij 376 x g gedurende 30 s bij 4 °C en de lysisbuffer uit de bezonken kralen te verwijderen, voorzichtig om de kraalpellet niet te verstoren.
5. Oplossing van PPP's uit de PIB's
- Verwijder na de laatste wasbeurt zoveel mogelijk van de lysisbuffer zonder een van de PIB's te pipetteren. Maak een elutiebuffer met 2% SDS (vol/vol) en eluuteer de PPP's uit de PIB's door voldoende volume elutiebuffer toe te voegen dat 4x-5x het volume PIBs is. Als bijvoorbeeld 10 μL PIBs worden gebruikt, gebruik dan 50 μL el el elutiebuffer. Incubeer de PIB's met de elutiebuffer bij 65 °C gedurende 1 uur om de PPP's uit de PIB's te elueren.
- Verzamel na elutie het eluaat door de buizen gedurende 30 s op RT op 376 x g te centrifugeren en het eluaat in een aparte buis te pipetteren, waarbij u voorzichtig bent om geen PIB's over te brengen. Gebruik het eluaat voor western blot-analyse of voor massaspectrometrie-analyses. Eluaten kunnen tot enkele maanden bij -20 °C worden bewaard.
- Om de PIB's te regenereren voor verder gebruik, incubeer de kralen in 2% SDS (vol / vol), roterend bij 8 rpm bij RT gedurende 1 uur. Was ze 3x-5x in 25 mM Tris-HCl (pH 7,5) met rotatie gedurende 30 minuten per wasbeurt. Bewaar pibs na alle wasbeurten in 25 mM Tris-HCl (pH 7,5) opslagbuffer met natriumazide (0,05% wt/vol).
- Analyseer de eluaten door western blotting of massaspectrometrie. De massaspectrometrie-analyse van PIB-eluaten wordt hieronder beschreven.
6. Verwijdering van detergentia
OPMERKING: Verschillende benaderingen kunnen worden gebruikt om wasmiddel uit eluaatmonsters te verwijderen voor MS-analyse. We ontdekten dat single-pot, solid-phase-enhanced sample-preparation (SP3), beschreven door Hughes et al., goed werkt19.
- Voeg 0,5 μL SP3-kralen toe aan 50 μL eluaat uit stap 5.2 hierboven. Gebruik SP3-kralen in een verhouding van 10:1 (μg:μg) of ten minste 0,5 μg/μL (stamoplossing is 50 μg/μL). Draai de kralen voorzichtig vortex en eluate.
- Voeg één elutievolume van 100% ethanol toe aan het kraal-eluaatmengsel (gebruik bijvoorbeeld 50 μL eluaat 50 μL 100% ethanol). Incubeer de monsters gedurende 5 minuten in een thermomixer die is ingesteld om te schudden bij 1000 tpm bij 24 °C.
- Om alle kralen te verzamelen, plaats je ze in een magnetisch buizenrek. Zodra de kralen zich hebben verzameld, gooi je het supernatant weg en was je de kralen met 0,5 ml 80% ethanol (vol / vol) 3x. Voor het wassen, resuspenseer de kralen door vortexing, verzamel de kralen door ze in het magnetische buisrek te plaatsen en gooi het supernatant tussen wasbeurten weg.
- Was de kralen nog één keer met 0,5 ml 100% acetonitril (ACN) om alle sporen van ethanol te verwijderen en zoveel mogelijk ACN te verwijderen.
7. Vertering van eiwitten
- Maak een 1:100 verdunning van trypsine (eindconcentratie van 0,004 μg/μL) in 166 mM HEPES (pH 8,5) en voeg 30 μL van deze trypsineoplossing toe aan elke buis met de kralen, resuspenderend door vortexing.
- Incubeer het SP3-trypsine kraalmengsel in de thermomixer bij 1000 tpm bij 37 °C gedurende 5 uur of een nacht bij 30 °C. Plaats de buizen in het magnetische rek om de kralen te verzamelen en verwijder de digesten naar nieuwe buizen.
- Doof de reactie voor labelvrije analyse door 20% trifluorazijnzuur (TFA) (vol/vol) toe te voegen aan een eindconcentratie van 0,2% TFA (vol/vol). Controleer of de pH van elk monster tussen 2-3 ligt met een pH-papier. Zo niet, voeg dan kleine extra aliquots van 20% TFA toe totdat dit is bereikt. De monsters moeten op passende wijze worden aangezuurd voordat zij worden ontzout. Ga verder met stap 8.
- Voor TMT-etikettering van de monsters, niet verzuren en doorgaan met stap 9.
8. Ontzouten van de digest
- Bereid een fasetip voor elk monster door een 200 μL MS-oplosmiddelcompatibele tip te verpakken met C18-hars zoals beschreven door Rappsilber et al.20. Gebruik een naald met een stomp uiteinde om op twee schijven van C18-materiaal te drukken, zodat de schijven in de naald blijven. Breng de schijven over in de MS-oplosmiddelcompatibele punt met behulp van een dunne draadzuiger om de schijven uit de naald te verwijderen.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om MS-oplosmiddelcompatibele tips vanaf dit punt in het protocol te gebruiken, omdat andere pipetpunten chemicaliën in de monsters kunnen uitlogen die via massaspectrometrie kunnen worden gedetecteerd. - Breng elke fasepunt in evenwicht met 30 μL 100% MeOH, vervolgens met 30 μL 60% MeOH (vol/vol), gevolgd door 30 μL van 0,1% TFA (vol/vol). Duw elke oplossing door de punt van het stadium met een spuit. Bevestig een pipetpunt aan het uiteinde van een spuit met een transparante film om het contact tussen de spuit en de podiumpunt indien nodig te vergroten. Zorg ervoor dat het C18-materiaal in de podiumpunt nooit droog wordt.
- Voeg aangezuurde peptide digest uit stap 7.3 toe aan de gelabelde punt van de fase en duw door de punt van het stadium met een spuit, opnieuw voorzichtig om de punt niet volledig te laten drogen.
- Was elk monster 2x met 30 μL van 0,1% TFA (vol/vol). Eluteer de peptiden van elke punt van het stadium door 30 μL 60% MeOH (vol / vol) toe te voegen aan elke punt van het stadium en alles uit de punt met spuitdruk in een nieuwe, gelabelde buis te verdrijven. Dit is de enige stap waarbij het C18-materiaal volledig wordt gedroogd.
- Droog elk monster door vacuümcentrifugatie. Gedroogde peptiden kunnen enkele maanden bij -20°C worden bewaard. De monsters zijn nu klaar voor labelvrije massaspectrometrie-analyse. Gebruik slechts de helft van het monster voor analyse op de massaspectrometer en de andere helft voor herinjectie indien nodig. Zorg voor het gebruik van een geschikte massaspectrometermethode voor analyse.
9. TMT-etikettering
OPMERKING: Tandem-mass tag labeling wordt gebruikt om monsters te multiplexen voor kwantitatieve analyse. Een injectieflacon van 0,8 mg TMT-reagens is voldoende voor etikettering tot 0,8 mg eiwit21. In een PIB pulldown experiment dat begint met 1 mg eiwit, worden 1-3 μg fosfoproteïne subeenheden verkregen. Het onderstaande protocol is optimaal voor maximaal 10 μg eiwit.
- Reconstitueer één injectieflacon van 0,8 mg TMT-reagens in 80 μL watervrije ACN.
- Label elk monster uit stap 7.4 met een ander TMT-label voor maximaal 18 kanalen. Zorg ervoor dat u noteert welk TMT-label aan elk monster is toegevoegd. Voeg 2 μL van het TMT-reagens en 2 μL ACN toe aan de peptidevergisting, vortex voorzichtig om te mengen, centrifugeer op 376 x g gedurende 30 s bij RT om het monster te verzamelen en incubeer bij RT gedurende 1 uur om het monster te labelen.
- Om de TMT-etiketteringsefficiëntie te testen, maakt u een etiketcontrolemonster door 1 μL van elke etiketteringsreactie te combineren in een buis van 0,5 ml met 9 μL water van LC-MS-kwaliteit en 1 μL van 10% hydroxylamine (vol / vol) om de reactie te doven. Plaats de resterende niet-uitgebluste gelabelde monsters in een vriezer van -80 °C. Monsters kunnen enkele dagen worden bewaard terwijl de etiketteringsefficiëntie wordt geëvalueerd.
- Verzuur het TMT-labelcontrolemonster door 30 μL van 0,1% TFA (vol/vol) toe te voegen. Controleer of de pH tussen 2-3 ligt. Zo niet, voeg dan 20% TFA (vol/vol) toe totdat deze pH is bereikt. Ontzout het etiketcontrolemonster via het kantelen van het podium, zoals beschreven in stap 8.1.-8.5.
- Analyseer het TMT-labelcontrolemonster op de massaspectrometer om de efficiëntie van de etikettering te evalueren. Filter de zoekresultaten tot een 1% false discovery rate (FDR) op peptideniveau en bepaal de labeling efficiëntie21,22.
- Volledig TMT-gelabelde peptiden hebben TMT-reagens op de N-terminus en bij alle lysines. Kwantificeer de IONEN-intensiteiten van de TMT-verslaggever en vergelijk hun totale som over alle kanalen. Het monster is voldoende gelabeld wanneer >95% van alle peptiden zijn gelabeld en de TMT-reporter-ionensomintensiteiten vergelijkbaar zijn
OPMERKING: Naast onvolledige etikettering kunnen verschillen in opgetelde TMT-reporterionintensiteiten het gevolg zijn van onnauwkeurig pipetteren van het 1 μL-testmonster. Het kan ook een echte biologische waarneming weerspiegelen, in welk geval alle replicaties hetzelfde gedrag moeten vertonen. - Verwijder de niet-uitgebluste monsters uit -80 °C opslag en ontdooi ze. Als ze niet volledig zijn geëtiketteerd, voeg dan 1 μL van het juiste TMT-reagens toe aan het monster zoals hierboven vermeld, incubeer gedurende 1 uur en herhaal de TMT-labelcontrole. Als de monsters volledig zijn gelabeld, gaat u verder met stap 9.8.
- Voeg, wanneer volledig gelabeld, 2 μL 10% hydroxylamine (vol / vol) toe aan de TMT-reacties om de etikettering te doven. Incubeer de monsters bij RT gedurende 15 minuten. Eenmaal geblust, kunnen de monsters enkele maanden bij -80 °C worden bewaard.
- Combineer alle uitgedoofde TMT-kanalen en voeg 2 μL 20% TFA (vol/vol) toe om de reactie te verzuren. Controleer de pH van de gecombineerde reactie en zorg ervoor dat deze tussen pH 2-3 ligt. Zo niet, voeg dan kleine aliquots van 20% TFA toe totdat de gewenste pH is bereikt. Dit is van cruciaal belang voor een goede ontzouting.
- Verwijder ACN door vacuümcentrifugatie gedurende 30 minuten en ontzout het monster zoals hieronder beschreven.
10. Ontzouting van het gecombineerde MONSTER met TMT-label
- Gebruik een SPE C18-ontziltingsplaat met de juiste eiwitcapaciteit (2 mg sorptiemiddel is meestal voldoende voor deze toepassing) om het gecombineerde TMT-reagens te ontzouten. Breng de put in evenwicht met 200 μL van 60% MeOH (vol/vol) en 200 μL van 10% MeOH/0,1% TFA (vol/vol).
- Laad de aangezuurde TMT-gelabelde peptiden uit stap 9.10. op de ontzoutingsplaat. Was de monsterputten 2x met 200 μL van 10% MeOH/0,1% TFA (vol/vol).
- Eluteer de peptiden met 100 μL van 60% MeOH (vol/vol). Droog de monsters door vacuümcentrifugatie. Het gedroogde, TMT-gelabelde monster kan enkele maanden bij -80 °C worden bewaard.
- Voor massaspectrometrieanalyse van het TMT-gelabelde monster injecteert u de helft van het monster en slaat u de andere helft op als herinjectie vereist is.
OPMERKING: Injectiehoeveelheden op de massaspectrometrie variëren afhankelijk van de specifieke kolom, instrumentopstelling en monstertype.
11. Data-analyse
OPMERKING: Methoden voor gegevensfiltering en -analyse variëren en vallen buiten het toepassingsgebied van dit protocol, maar de volgende opmerkingen over analyse zijn opgenomen om richtlijnen te bieden die specifiek zijn voor het type gegevens dat uit dit protocol voortvloeit.
- Zoek ruwe massaspectrometriegegevens tegen een soortspecifieke proteoomdatabase op basis van de oorsprong van de gebruikte monstercellen of -weefsel. Hier werd Comet gebruikt als zoekalgoritme23.
- Filter de zoekresultaten met een FDR van 1% door de zoekalgoritmespecifieke parameters aan te passen22. Voor labelvrije kwantificering gebruikt u MS1-piekgebiedmetingen om de gegevens te kwantificeren. Gebruik voor TMT-gelabelde monsters MSn-afgeleide reporterionintensiteiten voor kwantificering. Analyseer voor statistische significantie de monsters in biologische triplicaten.
- Om PPP-subeenheden en hun interactoren te identificeren , moet u ervoor zorgen dat drievoudige biologische monsters van MCLR-geremde en DMSO-behandelde monsters worden vergeleken. Om het PPPome onder verschillende omstandigheden of bij medicamenteuze behandeling te vergelijken, moet u ervoor zorgen dat biologische triplicaten van elke aandoening of medicamenteuze behandeling werden gegenereerd.
- Filter de gegevens zodat alleen eiwitten met een totaal aantal peptiden >1 in ten minste twee van de drie met DMSO-controle behandelde monsters aanwezig zijn. MCLR-competitie concurreert niet altijd met alle katalytische subeenheidbinding. Ook kunnen sommige PPP-katalytische subeenheden niet-specifiek aan de sepharosehars kleven. Om rekening te houden met beide mogelijkheden bij het filteren van eiwitten die niet-specifiek aan de hars binden, verwijdert u eiwitten met een totaal aantal peptiden in de met MCLR behandelde toestand die hoger is dan die voor een PPP-katalytische subeenheid.
- Sluit veelvoorkomende verontreinigingen, zoals keratine, collageen, ribosomale eiwitten van 40S en 60S en heterogene nucleaire ribonucleoproteïnen die geen PPP-subeenheden zijn, uit van de analyse14.
- Importeer gefilterde gegevens in Perseus door te klikken op Generic Matrix Upload in de sectie Load24,25. Log2 transformeert de gegevens door naar Basic > Transform te gaan, de gegevens te selecteren en de transformatiefunctie op te geven, in dit geval log2(x).
- Reken ontbrekende waarden uit een normale verdeling toe door naar Imputatie > Ontbrekende waarden vervangen door normale verdeling te gaan, de gegevens te selecteren en de breedte (standaard 0,3) en de neerwaartse verschuiving (standaard 1,8) voor de berekening op te geven. Voer kwantielnormalisatie uit door naar Normalisatie > Kwantielnormalisatie te gaan.
- Bereken log2-verhoudingen en de P-waarden van de T-test van de student voor de respectieve voorwaarden. Annoteer eerst de gegevens door naar Annot. Rijen > categorische annotatierijen te gaan. Voer de T-test uit door naar Tests > Tests met twee steekproeven te gaan en de groepen te selecteren die u wilt vergelijken, de uit te voeren test en de methode voor correctie voor het testen van meerdere hypothesen zoals gebruikt voor afkapping.
OPMERKING: Voor de novo identificatie wordt een eiwit beschouwd als een PPP-interagerend eiwit als de abundantie ervan statistisch significant is in de mclr-behandelde versus DMSO-conditie, met een log2-voudige verandering groter dan de minimale vouwverandering van een specifiek gebonden bekende PPP-subeenheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2: Identificatie van specifieke PIBs-bindmiddelen. (A) Een verscheidenheid aan weefseltypen of cellen kan worden geanalyseerd via PIB-MS. HeLa-cellen in biologisch triplicaat werden behandeld met DMSO of de PPP-remmer MCLR, geïncubeerd met PIB's, en geanalyseerd via LC-MS / MS. (B) Vulkaanplot van PIB-MS-analyse in DMSO en MCLR-behandelde HeLa-cellysaten, met specifieke PIB-bindmiddelen weergegeven in rood. PPP katalytische subeenheden worden gelabeld en weergegeven in blauw. Nieuwe kandidaat PPP-subeenheden of interagerende eiwitten worden in het zwart weergegeven. Niet-specifieke bindmiddelen worden grijs weergegeven. C) Spreidingsplot van log2-gebied van twee biologische replicaten van HeLa-cellysaten behandeld met DMSO om de reproduceerbaarheid van de verrijking aan te tonen. Specifieke bindmiddelen voor PIB's worden in het rood weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Netwerkanalyse van alle PPP-subeenheden en PPP-interagerende eiwitten geïdentificeerd in HeLa-cellen. Deze eiwitten bleken specifieke PIB-interactoren te zijn in de HeLa PIB pulldown met en zonder MCLR. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om de prestaties van de PIB's aan te tonen, voerden we een PIB-pulldown-experiment uit in HeLa-cellen om PPP's en hun interactoren te identificeren (figuur 2A). HeLa-cellen werden gekweekt in biologisch drievoud en gelyseerd. Elk triplicaatlysaat werd in tweeën gesplitst, waarbij de helft gedurende 15 minuten met MCLR werd behandeld om de binding van PPP-katalytische subeenheden of DMSO te voorkomen voordat PIB-verrijking werd uitgevoerd. Na PIB-verrijking werd een labelvrije vergelijking uitgevoerd van de abundantie van eiwitten gekwantificeerd in de met DMSO behandelde en met MCLR behandelde monsters om specifieke van niet-specifieke interactoren te onderscheiden (figuur 2B). In de analyse detecteerden we alle MCLR-gevoelige PPP-katalytische subeenheden PP1ca, PP1cb, PP1cc, PP2Aca, PP2Acb, PP4c, PP5c en PP6c. In de met DMSO behandelde monsters waren de abundanties (log2-gebieden van eiwitkwantificering) sterk gecorreleerd, wat wijst op reproduceerbaarheid (figuur 2C), maar na behandeling met MCLR was de PPP-katalytische subeenheid of PPP-interagerende eiwitrijkdom in PIB-pulldowns sterk verminderd (figuur 2B). In deze analyse identificeerden we 92 PPP-subeenheden en specifieke PPP-interactoren (zie aanvullende tabel 1), wat vergelijkbaar is met een eerdere PIB-MS-analyse in HeLa-cellen14 (figuur 3).
Aanvullende tabel 1: MS-gegevens van representatieve PIB-MS-analyse. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PIB-MS is een chemische proteomics-benadering die wordt gebruikt om het PPPome kwantitatief te profileren uit verschillende monsterbronnen in één analyse. Er is veel werk verricht met behulp van kinaseremmerkralen om het kinoom te bestuderen en hoe het verandert in kanker en andere ziektetoestanden 10,11,12,13. Toch blijft de studie van de PPPome achter. We verwachten dat deze aanpak in staat is om deze leemte op te vullen en licht te werpen op de regulatie van cellulaire defosforylering. Hier laten we zien dat we met behulp van PIB's katalytische en niet-katalytische componenten van PP1, PP2A, PP4, PP5 en PP6 kunnen verrijken. We zijn ook in staat om nieuwe kandidaat PPP-interactoren te identificeren in een verscheidenheid aan cellijnen, weefseltypen en organismen.
Er zijn verschillende kritieke stappen in het PIB-MS-protocol die niet over het hoofd mogen worden gezien. Deze omvatten de integratie van passende controles en replicaties, de invoer van gelijke hoeveelheden eiwit in alle monsters, het handhaven van niet-denaturerende omstandigheden tijdens de monstervoorbereiding, de incubatie van het monster met PIB's en het wassen van de PIB's. Met betrekking tot controles en replicaties is het belangrijk dat de helft van elk monster wordt behandeld met een PPP-remmer als het doel is om nieuwe PPP-subeenheden en interactoren te identificeren. Dit is nodig om onderscheid te maken tussen specifieke en niet-specifieke PIB-interactoren. Als u wilt identificeren hoe bekende PPP-subeenheid of PPP-interactorexpressie verandert in cel- of weefseltypen en celcyclusfasen, of op verschillende medicamenteuze behandelingen, is het van cruciaal belang om een lijst met bekende PPP-subeenheden en interactoren samen te stellen voor vergelijking. Bovendien worden deze experimenten meestal uitgevoerd in biologisch drievoud om statistische betrouwbaarheid te garanderen. Gelijke eiwitinvoer per monster is essentieel voor de reproduceerbaarheid van gegevens in monsters; het zorgt er ook voor dat verschillen in PPP-subeenheid of interactor abundantie niet alleen te wijten zijn aan verschillen in eiwitinput. Een eiwittest zoals een BCA moet worden gebruikt om de eiwitconcentratie in elk monster te bepalen. Ten slotte zijn niet-denaturerende omstandigheden bij monstervoorbereiding, PIB-verrijking en PIB-wassen van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de eiwitten in hun oorspronkelijke staat blijven. Hierdoor blijven PPP-subeenheidinteracties behouden.
PIB-MS is een krachtig hulpmiddel voor het ondervragen van de PPPome, maar het heeft verschillende beperkingen. PIB's kunnen verrijken voor de katalytische en niet-katalytische componenten van PP1, PP2A, PP4, PP5 en PP6, maar niet PP2B of PP7, omdat MCLR deze fosfatasen niet remt bij nanomolaire concentraties. Het is belangrijk op te merken dat deze tool geschikt is voor het gemak van identificatie en kwantificering van endogene, MCLR-gevoelige PPP holo-enzymen, zoals die vermeld. PIB-MS kan geen PPP-holo-enzymen detecteren die worden geremd door endogene PPP-remmers die de actieve PPP-site blokkeren, zoals α4 en SET14. Deze techniek vereist geen exogene expressie van gelabelde PPP-subeenheden of het gebruik van PPP-specifieke antilichamen. Net als andere affiniteitsverrijkingsstrategieën met behulp van op sepharose gebaseerde matrices, is PIB-MS gevoelig voor de binding van niet-specifieke eiwitten. De toevoeging van vrije MCLR als negatieve controle maakt het echter mogelijk om specifieke van niet-specifieke interactoren te onderscheiden, waardoor de identificatie van nieuwe PPP-subeenheden en interagerende eiwitten mogelijk wordt. Bovendien kunnen niet-specifieke interactoren worden verminderd door extra wasbeurten en het zorgvuldig gebruik van de juiste hoeveelheid PIB's.
We hebben PIB-MS gebruikt om de PPP-expressiepatronen van verschillende kankercellijnen te vergelijken, waaronder borstkanker en glioblastoom14. We ontdekten dat deze kankertypen unieke PPP-expressiepatronen hebben die wijzen op hun oorsprong14. PPP's behoren tot de meest geconserveerde enzymen 2,3. We konden aantonen dat PIB-MS effectief is in het analyseren van het PPPome in gist- en muizenweefsels14. PIB-MS kan ook worden gebruikt om verschillen in PPP-expressiepatronen onder verschillende omstandigheden te identificeren, zoals interfase versus mitotische monsters15. Zo biedt PIB-MS inzicht in fosfoproteïnefosfatasenetwerken en breidt het ons begrip van PPP-regulatie uit over meerdere cellijnen en ziektetoestanden, evenals over medicamenteuze behandelingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen en geen belangenconflicten.
Acknowledgments
A.N.K. erkent de steun van NIH R33 CA225458 en R35 GM119455. Wij danken de laboratoria van Kettenbach en Gerber voor hun nuttige discussie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (ACN) | Honeywell | AH015-4 | CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood. |
| Anhydrous Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood. |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | model no. 5424 | |
| Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate | Acros Organics | 410991000 | |
| Centrifuge | Eppendorf | model no. 5810 R 15 amp version | |
| Distilled water | |||
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Dounce tissue grinder | Fisherbrand Pellet Pestles | 12-141-363 | |
| Empore solid phase extraction disk, C18 | CDS Analytical | 76333-132 | |
| Eppendorf tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis. |
| Eppendorf tubes, 2 mL | Eppendorf | 22363352 | CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis. |
| Extraction plate manifold | Waters | WAT097944 | |
| Falcon tubes, 50 mL | VWR | 21008 | |
| Generic blunt end needle and plunger | |||
| Generic magnetic separation rack | |||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen chloride (HCl) | VWR Chemicals BDH | BDH3028 | CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood. |
| Hydroxylamine solution 50% (wt/vol) | Sigma-Aldrich | 467804 | |
| Incubator, 65 °C | VWR | model no. 1380FM | |
| Koptec Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | V1001 | |
| Methanol for HPLC (MeOH) | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood. |
| Microcystin LR (MCLR) | Cayman Chemical | 10007188 | CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact. |
| PBS, 1× without calcium and magnesium, pH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | |
| pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers | Fisher Scientific | M1095310001 | |
| PIBs | For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007. | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pipette tips, 10 μL | Eppendorf | 22491504 | CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis. |
| Pipette tips, 1000 μL | Eppendorf | 22491555 | CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis. |
| Pipette tips, 200 μL | Eppendorf | 22491539 | CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis. |
| plastic syringe, 10 mL | BD | 309604 | |
| Protease inhibitor cocktail III | Research Products International | P50700-1 | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Refrigerated benchtop centrifuge | Eppendorf | model no. 5424 R | |
| Rotator (Labquake Shaker Rotisserie) | Thermo Scientific | 13-687-12Q | 8 rpm rotation |
| Sample collection plate, 96- well, 1 mL | Waters | WAT058957 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP1311-1 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V511C | |
| Sodium azide | EMD Chemicals | SX0299-1 | CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals. |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S27110 | |
| Sonicator (Branson digital sonifier) | model no. SFX 250 | ||
| SPE C18 desalting plate | Waters | 186001828BA | |
| SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads) | Cytiva | 6.51521E+13 | |
| Thermomixer | Eppendorf | model no. 5350 | |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 × 0.8 mg per tag | ThermoFisher | A37725 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Honeywell | T6508-25ML | CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood. |
| Tris Base | Research Products International | T60040 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Vacuum centrifuge and vapor trap | Thermo Scientific | model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105 | |
| Vortexer (Vortex-Genie 2) | Scientific Industries | ||
| Water LC-MS | Honeywell | LC365-4 |
References
- Nilsson, J.
- Brautigan, D. L. Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling. The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).
- Brautigan, D. L., Shenolikar, S. Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates. Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).
- Janssens, V., Goris, J. Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling. Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).
- Virshup, D. M., Shenolikar, S. From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover. Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).
- Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. The extended PP1 toolkit: designed to create specificity. Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).
- Qian, J., Winkler, C., Bollen, M.
- Heroes, E., et al. The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity. The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).
- Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer. Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).
- Bantscheff, M., et al. Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors. Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).
- Klaeger, S., et al. Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors. ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).
- Duncan, J. S., et al. Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer. Cell. 149 (2), 307-321 (2012).
- Cooper, M. J., et al. Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia. PLoS ONE. 8 (6), 66755 (2013).
- Lyons, S. P., et al. A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans. Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).
- Nasa, I., et al. Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry. Science Signaling. 13 (648), (2020).
- Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse. Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).
- Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose. Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).
- Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).
- Hughes, C. S., Moggridge, S., Müller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Zecha, J., et al. TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach. Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool. Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins. Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).
