Summary
تركز هذه الورقة على تفصيل أفضل الممارسات لصنع الوسائط للكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية الحساسة المكتسبة من البيئة. تساعد هذه الطرق في إدارة الثقافات اللاهوائية ويمكن تطبيقها لدعم نمو الكائنات الحية الدقيقة غير المستزرعة المراوغة ، "المادة المظلمة الميكروبية".
Abstract
تعتمد الأبحاث المعتمدة على الثقافة للكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية على الكفاءة المنهجية. يجب أن تخلق هذه الطرق وتحافظ على ظروف نمو مناسبة (على سبيل المثال ، الأس الهيدروجيني ومصادر الكربون) للكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية مع السماح أيضا باستخراج العينات دون المساس بالبيئة الاصطناعية. وتحقيقا لهذه الغاية ، يمكن أن تكون الطرق التي تسترشد ببيئة في الموقع وتحاكيها ذات فائدة كبيرة في استزراع الكائنات الحية الدقيقة من تلك البيئة. هنا ، نحدد طريقة لاهوائية مستنيرة ومحاكاة في الموقع لزراعة الكائنات الحية الدقيقة الأرضية وتحت السطحية ، مع التركيز على جمع العينات اللاهوائية بأقل قدر من الاضطراب. يوضح هذا البروتوكول تفاصيل إنتاج وسط سائل لاهوائي قابل للتخصيص ، والاستحواذ البيئي والنمو في المختبر للكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية. ويغطي البروتوكول أيضا المكونات الحاسمة لمفاعل حيوي لاهوائي يستخدم في المحاكاة البيئية للرواسب والوسائط السائلة اللاهوائية للمزارع المكتسبة بيئيا. لقد قمنا بتضمين بيانات تسلسل الجيل التالي الأولية من ميكروبيوم تمت صيانته على مدار عمر مفاعل حيوي حيث تم تعديل الثقافة النشطة ديناميكيا استجابة لمصدر تجريبي للكربون.
Introduction
معظم الكائنات الحية الدقيقة لا تزال غير مستزرعة. ويدعم ذلك التباين الكبير بين الخلايا التي لوحظت من خلال الفحص المجهري على النقيض من الكائنات الحية الدقيقة القليلة التي تم استزراعها بنجاح باستخدام ألواح أجار. أطلق ستالي وكونوبكا على هذا التفاوت اسم "شذوذ عدد الصفائح العظيم"1. يتم دعم التنوع المقدر غير المحسوب من خلال البيانات الميتاجينومية والميتاترانسكريبتومية التي تظهر العديد من الأجناس الجديدة الموزعة في منحنيات وفرة الرتبة من عدة بيئات مختلفة2. تمت الإشارة إلى الكائنات الحية الدقيقة التي لوحظت (بشكل عام عن طريق التسلسل العشوائي للبندقية لمجتمع ميكروبي) ولكن لم يتم استزراعها باسم "المادة المظلمة الميكروبية"3,4.
في عصر -omics ، يظل استزراع الكائنات الحية الدقيقة أمرا ضروريا لتقييم البيانات الجينومية بشكل كامل والتحقق من وظيفة / النمط الظاهري للجينات الموجودة. لا يزال تسلسل الكائنات الحية الدقيقة المستزرعة هو الطريقة الوحيدة للحصول بثقة على جينومات كاملة حتى تصبح تقنيات مثل metagenomics البندقية والجينومات المجمعة من metagenome من البيئة معصومة بشكل مقبول5. توفر التقييمات الجينومية إلى جانب الكائنات الحية الدقيقة المستزرعة استنتاجات قوية لفهم "المادة المظلمة الميكروبية". يؤدي العديد من أعضاء "المادة المظلمة الميكروبية" وظائف حاسمة تؤثر على تدوير العناصر الغذائية والعناصر الأخرى وإنتاج المنتجات الطبيعية القيمة ، ودعم النظم البيئية ، وأداء الخدمات البيئية. من المنظور الطبي ، فإن حوالي نصف جميع المستحضرات الصيدلانية التي يتم تسويقها حاليا هي منتجات ومشتقات من منتجات من البكتيريا ، ويشتبه في أن تنميط الأنواع غير المستزرعة يكشف عن المضادات الحيوية في المستقبل. للوصول إلى هذه الأغلبية غير المثقفة ، يجب زيادة مجموعة متنوعة من منهجيات الزراعة6. من بين أعضاء "المادة المظلمة الميكروبية" ، لا يتم الإبلاغ عن الكائنات الحية الدقيقة قليلة التغذية اللاهوائية إلى حد كبير ومن المحتمل أن تحمل مسارات كيميائية حيوية ذات قيمة بيئيةوصناعية 7 ، مما يجعلها أهدافا مهمة للزراعة. ومع ذلك ، فإن الكائنات الحية الدقيقة قليلة التغذية اللاهوائية أكثر صعوبة في الاستزراع من نظيراتها الهوائية و copiotrophic بسبب أوقات الحضانة الأطول المطلوبة في كثير من الأحيان ، والظروف الصعبة (على سبيل المثال ، درجات حرارة معينة غير قياسية في المختبر ) ، واستخدام وصفات الوسائط المتخصصة.
التقنيات النامية الحالية لزرع أعضاء "المادة المظلمة الميكروبية" ، بما في ذلك الكائنات الحية الدقيقة قليلة التغذية اللاهوائية الجديدة ، قد حسنت بشكل كبير فهمنا وزادت من تمثيل هذه الكائنات الحية الدقيقة داخل شجرة التطور. يمكن فصل التقنيات الحالية التي تستخدم الوسائط المستنيرة لزراعة الكائنات الحية الدقيقة الجديدة (أي الوسائط المشتقة باستخدام معرفة الكائن الدقيق / الكائنات الحية الدقيقة ذات الأهمية) إلى ثلاث طرق متميزة. تستلزم الطريقة الأولى الإزالة المباشرة لقسم منفصل من البيئة لنقله إلى غرفة نمو في المختبر تحتوي بالفعل على الكائنات الحية الدقيقة ذات الأهمية داخل الغشاء. يعمل القسم المنفصل (على سبيل المثال ، مياه البحر) على تزويد الكائنات الحية الدقيقة ذات الأهمية بالموائل الجيوكيميائية التي تستخدمها في الموقع ، بينما يوقف الغشاء حركة الخلايا عبر (ستبقى الخلايا ذات الأهمية في الداخل ؛ ستبقى الخلايا الدخيلة التي وصلت مع القسم المنفصل بدونها). من خلال تضمين المركبات المتاحة بشكل طبيعي لاستهداف الكائنات الحية الدقيقة في بيئتها الطبيعية ، يمكن استزراع هذه الكائنات الحية الدقيقة8. تستخدم الطريقة الثانية metatranscriptomics أو علم الجينوم لتوضيح القدرات الأيضية ، مما يوفر أدلة على معلمات الاستزراع الضيقة لتصميم وسيط مستهدف. يوفر هذا النهج ملفا فسيولوجيا بيئيا يمكن استخدامه لاستهداف إثراء أنواع معينة من الكائنات الحية الدقيقة خارج البيئة. تلبي أحكام الوسط الجينات المحددة الموجودة والتي يفترض أنها تدعم الكائن (الكائنات) الدقيقة المستهدفة لتقليل تنوع الإثراء،9،10. أحد التحذيرات هو أن المعلومات الجينومية لا تستنتج بشكل مباشر التعبير عن الجينات ، في حين أن المعلومات النسخية تفعل ذلك.
وتشمل الطريقة الثالثة وسائط مستنيرة بيئيا ومحاكاة، تختلف عن الطريقة الأولى، التي لا تحاكي وسائط الإعلام بل تستخدم البيئة مباشرة كمصدر للوسائط. تتطلب هذه الطريقة الثالثة استطلاعا بيئيا للكيمياء الجيولوجية لموقع ميداني يحتوي على كائنات دقيقة ذات أهمية. مع هذه المعرفة ، يتم تحديد المكونات الأولية والمعلمات الفيزيائية لإنتاج وسيط محاكاة مستنير بيئيا. ثم يتلقى الوسط ضخا مباشرا للرواسب أو السائل المحتوي على الكائنات الحية الدقيقة من البيئة إلى الوسط. هذه الطريقة ذات قيمة خاصة في الحالات التي لا يستطيع فيها عالم الأحياء الدقيقة المستزرع الوصول إلى كميات كافية من بيئة المصدر (حسب الحاجة للطريقة الأولى) ولا البيانات الوصفية أو الجينومية المناسبة (حسب الحاجة للطريقة الثانية).
البروتوكول التالي هو مثال على الطريقة الثالثة ؛ يتم إعلامه ويهدف إلى محاكاة البيئات ذات الاهتمام. يتم تقديم ثلاث وصفات إعلامية ساذجة تستهدف ثقافات الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية المختلفة المكتسبة في هذا المجال بالتوازي داخل البروتوكول. الثقافات الثلاث الممثلة هي مزارع مختلطة تنشأ من التربة (فيما يلي ، ثقافة التربة المختلطة) ، ومزارع مختلطة تنشأ من داخل بئر (فيما يلي ، ثقافة مختلطة للبئر) ، وميثانوجين معزول ينشأ من داخل بئر (يشار إليه فيما بعد ، ميثانوجين معزول عن الآبار). يقصد بالهويات المركبة والكميات في وصفات الوسائط المشتركة هنا أن تكون دليلا أوليا. إنهم قادرون ومشجعون على تخصيصها لبيئة القارئ والكائنات الحية الدقيقة ذات الاهتمام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إنتاج وسط سائل لاهوائي قابل للتخصيص
- متوسطة لزجاجات الثقافة (إنتاج 500 مل)
- قم بقياس وإضافة مركبات إلى زجاجة سعة 1 لتر واضبط الرقم الهيدروجيني باستخدام العمود الموجود في الجدول 1 المقابل لثقافة اهتمام القارئ (يتم تسجيل الكميات الواردة في الجدول 1 لإنتاج 1000 مل ، واضبطها وفقا لذلك). امزج المركبات مع التجانس عن طريق تحريك الزجاجة.
- سخني السائل حتى الغليان عن طريق تسخين الزجاجة في الميكروويف لمدة 5-6 دقائق. افتح الميكروويف كثيرا وقم بتدوير السائل برفق باستخدام قفاز مقاوم للحرارة. افتح الميكروويف بسرعة إذا ظل السائل ثابتا بعد الفقاعات ؛ خلاف ذلك ، قد يتوسع السائل بسرعة ويفيض الزجاجة.
- قم بتوصيل ماصة زجاجية معقمة سعة 10 مل بإعداد مشعب غاز N2 (بناء على تصميم Balch et al.11 ، على الرغم من عدم الحاجة إلى عمود نحاسي ساخن لغاز N2 للنقاء ؛ انظر الملف التكميلي 1 لمزيد من المعلومات حول مشعب الغاز). افتح المشعب للتنفيس O2 واترك غاز N2 يتدفق.
- ضع طرف الماصة في السائل واضبط تدفق الغاز بحيث تكون الفقاعات قوية إلى حد ما. اغسل السائل باستخدام N2 حتى تصبح الزجاجة ساخنة جدا بحيث لا يمكن لمسها.
ملاحظة: هذا يعتمد على محتويات الوسائط ولكنه يستغرق عموما ~ 20 دقيقة. - أثناء انتظار أن تبرد الزجاجة ، ضع 10 زجاجات ثقافة معقمة سعة 100 مل ؛ أو في حالة تحضير الوسائط لجمع ثقافة التربة المختلطة ، ضع زجاجتين معقمتين سعة 500 مل.
- بمجرد أن تبرد زجاجة الوسائط عند لمسها ، اسحب طرف الماصة لأعلى في مساحة رأس الزجاجة. أضف 0.125 جم من NaHCO3 و 0.300 جم من Na2S∙9 H2O وانتظر حتى يصبح resazurin عديم اللون.
تنبيه: Na2S∙9 H2O مادة أكالة وسامة ومهيجة. استخدم معدات الحماية الشخصية عند التعامل مع الأدوات المعدنية وشطفها جيدا بعد ملامستها. - أثناء انتظار تغيير لون resazurin ، قم بتوصيل قنيات معدنية بإعداد مشعب الغاز وضع أطراف القنية في زجاجات الثقافة. اضبط تدفق N2 في الزجاجات إلى معدل معتدل ، بحيث لا ينزلق السائل المضاف في الخطوة التالية بسبب تدفق الغاز.
- بمجرد أن يصبح resazurin عديم اللون ، قم بخصم 50 مل من السائل في كل زجاجة مزرعة أو 250 مل من السائل في كل زجاجة 500 مل.
- قم بتغطية كل زجاجة بسدادة مطاطية متطابقة الحجم فورا بعد إزالة القنية. قم بتأمين السدادة بختم من الألومنيوم (لزجاجات الثقافة) أو غطاء لولبي مفتوح من الأعلى GL45 (لزجاجات سعة 500 مل).
- ضع الزجاجات في صندوق قابل للتعقيم واملأ الحاوية بماء الصنبور حتى تتطابق مستويات الماء مع تلك الموجودة في الزجاجات.
ملاحظة: سيضمن ذلك عدم تمزق الزجاجات بسبب الإجهاد الناجم عن فروق درجات الحرارة على الزجاج أثناء التعقيم. - الأوتوكلاف الزجاجات على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- متوسطة للمفاعل الحيوي (إنتاج 8 لتر)
- إعداد كاربوي
- افتح صمام خرطوم الكرة الشائك 1/4 بوصة (6.4 مم). قم بتوصيل أنبوبين سيليكون بطول 6 سم بقطر داخلي (ID) 1/4 بوصة (6.4 مم) وأنبوب سيليكون بقطر خارجي (OD) 1/2 بوصة (12.7 مم) على طرفي الصمام الكروي الشائك للخرطوم.
- قم بتوصيل أحد طرفي التجميع بتركيب محول شوكة خرطوم 5/16 "-1/4" (7.9 مم -6.4 مم). قم بتوصيل الطرف الآخر من التجميع بشوكة خرطوم كاربوي سعة 8 لتر.
- استخدم ربطة عنق مضغوطة لتأمين الاتصال بين شوكة خرطوم carboy والأنبوب ، والاتصال بين تركيب محول شوكة الخرطوم والأنبوب.
- الأوتوكلاف carboy مع التجميع على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- إنتاج متوسط
- أغلق صمام الصمام الكروي الشائك للخرطوم على مجموعة carboy سعة 8 لتر.
- قم بقياس وإضافة مركبات إلى 8 لتر carboy واضبط الرقم الهيدروجيني باستخدام العمود في الجدول 1 المقابل لثقافة اهتمام القارئ (يتم تسجيل الكميات في الجدول 1 لإنتاج 1000 مل ، اضبط وفقا لذلك). أضف شريط تقليب واستخدم صفيحة تسخين للتحريك لخلط المركبات حتى التجانس.
- سخني السائل حتى الغليان باستخدام لوح التسخين مع التحريك. اترك السائل يغلي لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: يعتمد تسخين السائل حتى الغليان على محتويات الوسائط ولكن يمكن أن يستغرق 2-3 ساعات. - قم بتوصيل ماصة زجاجية معقمة سعة 10 مل بإعداد مشعب غاز N2 (بناء على تصميم Balch et al.11 ، على الرغم من عدم الحاجة إلى عمود نحاسي ساخن لغاز N2 للنقاء ؛ انظر الملف التكميلي 1 لمزيد من المعلومات حول مشعب الغاز). افتح المشعب للتنفيس O2 واترك غاز N2 يتدفق.
- أطفئ النار ، ثم ضع طرف الماصة في السائل ، واضبط تدفق الغاز بحيث تكون الفقاعات قوية إلى حد ما ولكنها لا تفيض. اغسل السائل ب N2 لمدة 30 دقيقة.
- اسحب طرف الماصة لأعلى في مساحة رأس carboy. أضف 2.0 جم من NaHCO3 و 4.8 جم من Na2S∙9 H2O ، وانتظر حتى يصبح resazurin عديم اللون.
تنبيه: Na2S∙9 H2O مادة أكالة وسامة ومهيجة. استخدم معدات الحماية الشخصية عند التعامل مع الأدوات المعدنية وشطفها جيدا بعد ملامستها. - بمجرد أن يصبح resazurin عديم اللون ، قم بإزالة الماصة الزجاجية وقم على الفور بتغطية carboy بسدادة # 10. قم بلف سلك فوق السدادة وحول شفة carboy لتأمين السدادة.
- إعداد كاربوي
2. اكتساب الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية البيئية في الموقع
- الحصول على العينات اللاهوائية السطحية (ثقافة التربة المختلطة)
- أحضر زجاجة / زجاجات وسائط زراعة التربة المختلطة المصنوعة على النحو الوارد أعلاه وآلة حفر إلى الحقل.
ملاحظة: يتم استخدام بت التربة المستدق القياسي Giddings 2 5/8 من قبل المؤلفين (جدول المواد). ومع ذلك ، يمكن استخدام أي محفور تربة أو مجرفة يمكنها أخذ عينات إلى العمق المطلوب. - ادفع (محرك الوبر / الحصة) إلى الرواسب حتى يتدفق الجزء العلوي من أسطوانة جمع العينات مع سطح الرواسب.
- قم بلف الكور 90 درجة لتحرير القلب واسحب لأعلى حتى يتم استخراج العينة من البيئة.
- في الرواسب السائبة (مثل ما قد تصادفه عند أخذ عينات من الأراضي الرطبة) ، قم بتغطية قاعدة القلب بيد قفاز النتريل الجديدة أثناء استخراجها لمنع العينة من السقوط أو الانتشار في الماء عند الاستخراج.
- تقريب بسرعة بالعين 6-7 سم من قاعدة القلب. استخدم يدا جديدة بقفاز النتريل لتقطيعها إلى قلب وفصل الجزء السفلي 6-7 سم.
- نقل على الفور الجزء السفلي من جوهر إلى زجاجة الثقافة. إذا كانت التربة / الرواسب كبيرة جدا ، فقم بتشكيلها بسرعة لتناسب الزجاجة بشكل أسهل ، مما يقلل من التعرض للجو الهوائي قدر الإمكان.
- بمجرد نقل العينة ، قم بتغيير موضع السدادة على الفور وثبتها في مكانها بغطاء لولبي.
- حافظ على برودة العينة. برد زجاجة التجميع على حرارة 4 درجات مئوية عند إعادتها إلى المختبر.
- أحضر زجاجة / زجاجات وسائط زراعة التربة المختلطة المصنوعة على النحو الوارد أعلاه وآلة حفر إلى الحقل.
- الحصول على العينات اللاهوائية تحت السطحية (ثقافة الآبار المختلطة)
- ضع زجاجة معقمة سعة 1 لتر بجانب مشعب الغاز. قم بتغطية الزجاجة بسدادة مطاطية. قم بتقطير الإيثانول بنسبة 100٪ على السدادة وأشعل النار فيها باستخدام ولاعة.
- قم بتوصيل إبرة معقمة 23 G بإعداد مشعب الغاز N2 . افتح المشعب لتنفيس O2 والسماح للغاز N2 (أو Ar) بالتدفق بمعدل معتدل.
- بمجرد توقف السدادة عن الاشتعال ، أدخل الإبرة في الزجاجة. أدخل إبرة معقمة ثانية 23 G غير متصلة بمشعب الغاز في الزجاجة. اغسل الزجاجة لمدة 1-2 دقيقة.
- استخراج الإبرة غير المتصلة بمشعب الغاز. اضغط على الزجاجة لمدة 1 دقيقة. استخراج الإبرة المتبقية.
- أحضر الزجاجة المضغوطة وإبرة معقمة 23 جم إلى موقع البئر. سحب السائل من البئر باتباع طرق Merino et al.12.
ملاحظة: اعتمادا على الطريقة والاتصال ومعدل تدفق البئر ، فإن هذا يغير استراتيجية الحصول على عينة من المياه. إذا كان هناك تدفق مستمر للمياه ، فقم بجمع المياه كما هو موضح في الخطوة 2.2.6. ستكون كافية. إذا تم جمع تدفق المياه دفعة أو تدفق منخفض ، فيمكن استخدام طريقة مدخل / مخرج بديلة. في جميع الحالات ، قلل التلوث ، وحاول التأكد من أن العينة التي تم جمعها تمثل البيئة المطلوبة للعينة. هذا بيان معمم على نطاق واسع لأنه كان من تجربة المؤلفين أن كل حدث لجمع العينات من المواقع الحكومية أو الخاصة يجب أن يكون قابلا للتكيف بدرجة كبيرة مع إمكانية الوصول المتاحة. - افتح الزجاجة بسرعة ، وضخ السائل لملء الزجاجة بالكامل ، وأغلق الزجاجة.
- أدخل إبرة 23 G التي تم إحضارها إلى الموقع في السدادة المطاطية للزجاجة لتخفيف الضغط في الزجاجة. استخراج الإبرة.
- حافظ على برودة العينة. برد زجاجة التجميع على حرارة 4 درجات مئوية عند إعادتها إلى المختبر.
3. في المختبر نمو الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية المكتسبة في هذا المجال
- النمو عن طريق زجاجة الثقافة
- ضع زجاجة معقمة من N2 وزجاجات الثقافة وزجاجة التجميع المعدة على النحو الوارد أعلاه. قم بتقطير الإيثانول بنسبة 100٪ على السدادات وأشعل النار فيها باستخدام ولاعة.
- قم بتجميع إبرة 23 جم على حقنة سعة 1 مل. بمجرد توقف السدادات عن الاشتعال ، أدخل الإبرة في زجاجة N2 وارسم ~ 1 مل من N2. استخراج الإبرة.
- اضغط ببطء على المكبس لتحرير N2. بمجرد أن تكون المحقنة فارغة ، أدخل الإبرة في زجاجة التجميع وارسم 0.5 مل من العينة البيئية. استخراج الإبرة.
- أدخل الإبرة في زجاجة الثقافة وحقن العينة. استخراج الإبرة.
- قم بتدوير الزجاجة ووضعها في حاضنة في درجة حرارة ، كما هو موضح في الجدول 1 أو بيئة اهتمام القارئ.
ملاحظة: تتم مراقبة تقدم الاستزراع (إما زجاجة أو مفاعل حيوي) باستخدام مقياس الدم Petroff-Hauser بعمق 0.02 مم. عادة لا تصل إثراءات الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية أو شديدة الحساسية إلى كثافة الخلايا حيث يكون OD600 قابلا للاستخدام ، وطرق الكشف الأخرى غير عملية للمراقبة الروتينية والمتكررة. تعتمد حدود الكشف ومراقبة الجودة والحسابات الإحصائية على نوع غرفة عد الخلايا واحتياجات المستخدم.
- النمو بواسطة المفاعل الحيوي
- تحضير بالون مع حقنة معدلة
- قم بإزالة المكبس من ثلاث محاقن قفل luer سعة 10 مل (واحدة لكل مجموعة نهائية). اقطع الحافة من كل حقنة وقم بتبريد الطرف المقطوع حتى لا تخترق البالونات. نظف جميع الرقائق المحفوظة من المحقنة المعدلة.
- قم بإعداد بالون مضاعف عن طريق وضع بالون داخل آخر.
- مد نهاية البالون المضاعف فوق المحقنة المعدلة سعة 10 مل.
- افصل قليلا نهاية البالون الخارجي عن البالون الداخلي. اضغط على كل الهواء المحبوس بين البالونات.
- أحكم ربط ربطة عنق حول قاعدة البالونات لتثبيت البالونات في المحقنة.
- إعداد سدادة معدلة
- قم بإزالة الغطاسات من عشرة محاقن قفل luer سعة 1 مل (اثنان لكل سدادة يتم تعديلها). قطع شفة من المحاقن.
- حدد سدادتين مطاطيتين مقاس # 10 (ل 8 لتر كاربويز) وثلاثة أحجام للزجاجات ذات الخيط GL45 (لزجاجات الصيد). باستخدام مثقاب 1/4 بوصة (6.4 مم) ، قم بحفر فتحتين من خلال الجزء العلوي من كل سدادة مطاطية واسعة بما يكفي لتناسب المحاقن المعدلة وتضيق بما يكفي لتكون الملاءمة محكمة الإغلاق.
- أدخل المحاقن المعدلة من خلال فتحات السدادة المطاطية.
- نظف السدادة المعدلة وأوتوكلاف على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- تحضير مجموعة المفاعل الحيوي
- تطهير مع 70 ٪ من الإيثانول جميع محبس ، موصلات محول قفل luer الإناث ، وغيرها من مواد المفاعل الحيوي غير القابلة للتعقيم ، والأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة جميع الأنابيب (بعد القطع إلى الطول) ، سدادات ، الصوف الزجاجي ، وغيرها من مواد المفاعل الحيوي القابل للتعقيم.
- ضع مفاعلا حيويا معقما (الشكل 1 والشكل 2) على حامل حلقي وقم بتثبيته بحزام سلسلة. ضع أيضا حماما مائيا ، ومضخة تمعجية ، و carboy سعة 8 لتر يحتوي على وسيط (من خطوة البروتوكول 1.2) ، وزجاجة واحدة سعة 3.5 لتر (زجاجة صيد غير أخذ العينات) ، وزجاجة واحدة سعة 500 مل (زجاجة التقاط العينات).
- إيقاف كاربوي
- ضع بالونا بحقنة معدلة. قم بتوصيل محبس ثلاثي الاتجاهات بطرف قفل المحقنة.
- خذ مجموعة البالون وقم بتوصيل المحبس ثلاثي الاتجاهات بأنبوب خزان N2. أدر المحبس ثلاثي الاتجاهات لإغلاق النهاية المفتوحة للغلاف الجوي.
- افتح خزان الغاز واملأ البالون ب N2. بمجرد الامتلاء ، أدر المحبس ثلاثي الاتجاهات لسد نهاية البالون. أغلق خزان الغاز وافصل أنبوب الخزان عن المحبس ثلاثي الاتجاهات.
- قم بتوصيل ما يلي بالتسلسل: محبس ثلاثي الاتجاهات (للبالون مع المحقنة المعدلة) ، ومحبس ثنائي الاتجاه ، ومقرنة محول قفل luer أنثى ، وطرف قفل luer لإحدى محاقن السدادة المعدلة.
- إلى طرف قفل luer الخاص بالمحقنة الأخرى ، قم بتوصيل محبس ثنائي الاتجاه. أغلق كلا صمامي محبس الإيقاف ثنائي الاتجاه على مجموعة السدادة المعدلة.
- قم بفك السلك الذي يحمل سدادة حجم carboy غير المعدل # 10. استبدل السدادة غير المعدلة بسرعة بمجموعة السدادة المعدلة وقم بلف السلك كما كان من قبل لتأمين مجموعة السدادة المعدلة إلى carboy.
ملاحظة: إذا كانت واثقة ومستعدة ، يمكن استخدام مجموعة السدادة المعدلة لسدادة carboy في الخطوة الأخيرة من التحضير المتوسط (الخطوة 1.2.2.7). - أدر المحبس ثلاثي الاتجاهات لإغلاق النهاية المفتوحة للغلاف الجوي. افتح محبس ثنائي الاتجاه بالتسلسل. يتم الآن توصيل غاز البالون ومساحة رأس 8 لتر كاربوي.
- إيقاف زجاجات الصيد غير أخذ العينات وأخذ العينات
- سدادة زجاجة الصيد غير أخذ العينات سعة 3.5 لتر مع سدادة معدلة بحجم الزجاجات ذات الخيوط GL45 ، مع تطبيق 70٪ من الإيثانول على قاعدة السدادة للمساعدة في تركيبها في الزجاجة. قم بتغطية الزجاجة بغطاء لولبي مفتوح من الأعلى GL45.
- قم بتوصيل ما يلي بالتسلسل: بالون بطرف قفل luer للحقنة المعدلة ، ومحبس ثلاثي الاتجاهات ، ومقرنة محول قفل luer أنثى ، وطرف قفل luer لإحدى محاقن السدادة المعدلة. أدر المحبس ثلاثي الاتجاهات لإغلاق النهاية المفتوحة مباشرة إلى الغلاف الجوي.
- إلى طرف قفل luer الخاص بالمحقنة الأخرى ، قم بتوصيل مقرنة محول قفل luer أنثى.
- كرر الخطوات الثلاث المذكورة أعلاه لزجاجة التقاط العينات سعة 500 مل.
- إعداد الأنابيب
- قم بقياس المسافة بين منافذ سترة الماء للمفاعل الحيوي وانتقادات خرطوم الحمام المائي. قطع طولين من 3/16 "(4.8 مم) معرف ، 3/8" (9.5 مم) أنابيب سيليكون OD لتمتد هذه المسافة.
- قم بتجميع موصلين بخرطوم مستقيم مع أغطية لولبية مفتوحة من الأعلى GL14. قم بتوصيل كل طرف بأحد طرفي قطعتي الأنابيب.
- قم بلف أغطية المسمار على منافذ سترة الماء للمفاعل الحيوي. قم بتوصيل الأطراف الأخرى للأنبوب بأصناص خرطوم حمام الماء بحيث يتدفق الماء من الحمام المائي ، وادخل في الجزء السفلي من سترة الماء المفاعل الحيوي ، واخرج في الجزء العلوي من سترة الماء ، ثم عد إلى الحمام المائي. أربط السحاب حول نهايات الأنبوب لتثبيت الأنبوب بأطراف خرطوم حمام الماء.
- بالنسبة للمضخات المشابهة للمضخة الصغيرة ذات التدفق المتغير منخفض التدفق VWR ، قم بربط مجموعة الأنابيب المشقوقة OD 3/16 بوصة (4.8 مم) المصاحبة عبر المضخة.
- قم بقياس المسافة بين مجموعة أنابيب carboy ومجموعة أنابيب المضخة التمعجية. قطع طول 3/16 "(4.8 مم) معرف ، 3/8" (9.5 مم) أنابيب سيليكون OD لتمتد هذه المسافة.
- قم بتوصيل أحد طرفي الأنبوب بشوكة الخرطوم لمجموعة أنابيب carboy والآخر بشوكة الخرطوم لمجموعة أنابيب المضخة التمعجية ، موجهة بحيث يتدفق الوسيط من carboy وعبر المضخة التمعجية.
- قم بقياس المسافة بين مجموعة أنابيب المضخة التمعجية والمنفذ السفلي للمفاعل الحيوي. قطع طول 3/16 "(4.8 مم) معرف ، 3/8" (9.5 مم) أنابيب سيليكون OD لتمتد هذه المسافة.
- قم بتوصيل أحد طرفي هذا الأنبوب بشوكة خرطوم مجموعة أنابيب المضخة التمعجية وقم بتوصيل الطرف الآخر بعناية بالمنفذ السفلي للمفاعل الحيوي. مع الحرص على عدم تكسير الزجاج ولكن أيضا لتأمين الاتصال ، قم بربط ربطة مضغوطة حول نهاية الأنبوب لتأمين الأنبوب بالمنفذ السفلي للمفاعل الحيوي.
- قم بقياس وقطع ما يقرب من 5 بوصات (127 مم) بطول 3/16 بوصة (4.8 مم) معرف ، 3/8 بوصة (9.5 مم) أنابيب سيليكون OD.
- قم بتوصيل موصل محول قفل luer أنثى بمحبس ثلاثي الاتجاهات. قم بتوصيل أي نهاية من المحبس ثلاثي الاتجاهات بالأنبوب.
- قم بتجميع موصل خرطوم واحد بزاوية مع غطاء لولبي مفتوح من الأعلى GL14. قم بتثبيته على الطرف الآخر من الأنبوب.
- قم بلف الغطاء اللولبي على المنفذ الرأسي العلوي للمفاعل الحيوي. أدر المحبس ثلاثي الاتجاهات لسد النهاية التي تشير إلى المفاعل الحيوي.
- قم بقياس المسافة بين مجموعة المنفذ الرأسي العلوي ومجموعة زجاجة الصيد غير العينية. قطع طول 3/16 "(4.8 مم) معرف ، 3/8" (9.5 مم) أنابيب سيليكون OD لتمتد هذه المسافة. اقطع الشفاه من حقنتين بقفل luer سعة 1 مل وأدخلهما في نهايات الأنبوب.
- قم بتوصيل أحد طرفي مجموعة الأنابيب هذه بمحبس ثلاثي الاتجاهات لمجموعة المنافذ الرأسية العلوية وقم بتوصيل الطرف الآخر بموصل محول قفل luer الأنثوي على مجموعة زجاجة الصيد غير أخذ العينات.
- قم بقياس المسافة بين مجموعة المنفذ الرأسي العلوي ومجموعة زجاجة التقاط العينات. قطع طول 3/16 "(4.8 مم) معرف ، 3/8" (9.5 مم) أنابيب سيليكون OD لتمتد هذه المسافة. اقطع الشفاه من حقنتين بقفل luer سعة 1 مل وأدخلهما في نهايات الأنبوب.
- قم بتوصيل أحد طرفي مجموعة الأنابيب هذه بالمحبس ثلاثي الاتجاهات لمجموعة المنافذ الرأسية العلوية وقم بتوصيل الطرف الآخر بموصل محول قفل luer الأنثوي في مجموعة زجاجة التقاط العينات.
- ملء المفاعل الحيوي
- قم بتغطية أحد منافذ GL18 للمفاعل الحيوي بحاجز مطاطي أبيض. قم بتغطية منفذ GL18 الآخر ومنافذ GL14 المكشوفة الرأسية المتبقية مع حاجز سيليكون بحجم GL18 / GL14 يواجه PTFE (PTFE يواجه الزجاج) وأغطية لولبية علوية مفتوحة.
- باستخدام قضيب طوله 50 سم ، قم بتعبئة 0.9 جم من الصوف الزجاجي في قاعدة المفاعل الحيوي.
- الأوتوكلاف 1.3 لتر من الرمل عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. املأ المفاعل الحيوي بالرمل باستخدام قمع.
ملاحظة: يمكن استبدال أنواع الرواسب الأخرى المستنيرة ببيئة القارئ والكائنات الحية الدقيقة ذات الأهمية هنا. - ضع الأنبوب في خزان N2 في الجزء العلوي من المفاعل الحيوي واغسل مساحة رأس المفاعل الحيوي ب N2 لمدة دقيقتين. قم على الفور بتغطية المفاعل الحيوي بسدادة بحجم # 7 وغطاء لولبي مفتوح من الأعلى GL45.
- من زجاجة الصيد غير العينية ، افصل الأنبوب وقم بتدوير المحبس ثلاثي الاتجاهات لسد النهاية التي تشير إلى البالون. قم بتوصيل الأنبوب بخزان N2 بموصل محول قفل luer الأنثوي واغسل مساحة رأس المفاعل الحيوي باستخدام N2 لمدة دقيقتين. أعد توصيل الأنبوب على الفور وأعد المحبس ثلاثي الاتجاهات لإغلاق الطرف المفتوح على الغلاف الجوي.
- كرر الخطوة المذكورة أعلاه لزجاجة التقاط العينات.
- أدر المحبس ثلاثي الاتجاهات للمنفذ الرأسي العلوي للمفاعل الحيوي لسد النهاية التي تشير إلى زجاجة التقاط العينات. ضخ السائل من carboy إلى المفاعل الحيوي. أوقف المضخة مؤقتا ، وقم بتنفيس بالون زجاجة أخذ العينات ، واملأ بالون carboy ب N2 حسب الحاجة.
- بمجرد ملء المفاعل الحيوي بالوسط ، اضبط معدل تدفق المضخة على 0.6 مل / دقيقة (القيمة الرقمية 40 على المضخة الصغيرة).
ملاحظة: يمكن استبدال معدلات التدفق الأخرى التي يريدها القارئ هنا. - اضبط درجة حرارة حمام الماء ، كما هو موضح في الجدول 1 أو بيئة اهتمام القارئ.
ملاحظة: يمكن إضافة اللقاح في هذه المرحلة أو في وقت لاحق ، اعتمادا على تفاصيل الدراسة. في حالة التلقيح في هذه المرحلة ، انتقل إلى الخطوة 3.2.4.10. في حالة التلقيح لاحقا ، انتقل إلى الخطوة 3.2.5. - ضع زجاجة تجميع أو زجاجة مزرعة ملقحة وزجاجة معقمة من N2. قم بتقطير الإيثانول بنسبة 100٪ على السدادات وأشعل النار فيها باستخدام ولاعة.
- قم بتجميع إبرة 23 جم على حقنة سعة 60 مل. بمجرد توقف السدادات عن الاشتعال ، أدخل الإبرة في زجاجة N2 وارسم ~ 50 مل من N2. استخراج الإبرة.
- اضغط ببطء على المكبس لتحرير N2. بمجرد أن تكون المحقنة فارغة ، أدخل الإبرة في زجاجة التجميع وارسم 50 مل من العينة البيئية. استخراج الإبرة.
- استبدل إبرة 23 جم بإبرة معدنية طويلة معقمة (قنية ، طول 31.5 سم). أدخل الإبرة المعدنية الطويلة من خلال الحاجز المطاطي الأبيض على منفذ GL18 للمفاعل الحيوي.
- ادفع الإبرة في الرواسب وحقن اللقاح. استخراج الإبرة.
- تشغيل صيانة المفاعلات الحيوية
- كل يوم يعمل فيه المفاعل الحيوي ، قم بما يلي:
- تحقق من مستوى حمام الماء. إذا كان منخفضا ، أضف المزيد من الماء (استخدم الماء المقطر لطول عمر المعدات عن طريق تقليل التآكل وتراكم المعادن).
- تحقق من بالون زجاجة الصيد غير أخذ العينات ؛ بالون كامل سيمنع تدفق الوسط. عندما تكون ممتلئة ، أدر المحبس ثلاثي الاتجاهات لسد النهاية التي تشير إلى زجاجة الصيد. اضغط على البالون لتفريغه ؛ ثم أعد المحبس ثلاثي الاتجاهات لإغلاق النهاية المفتوحة للغلاف الجوي ؛ كرر حتى يصبح البالون فارغا.
- تحقق من بالون كاربوي 8 لتر. إذا كان منخفضا ، أغلق المحبس ثنائي الاتجاه المتسلسل وافصل المحبس ثلاثي الاتجاهات عن المحبس ثنائي الاتجاه. أعد ملء مجموعة البالونات وأعد توصيلها باتباع الخطوات 3-2-3-3-2 و3-2-3-3-3 و3-2-3-3-7.
- تحقق من مستوى الوسط في 8 لتر carboy. إذا كانت منخفضة ، قم بتجميع 8 لتر أخرى carboy وإعداد المزيد من المتوسطة باتباع خطوات البروتوكول 1.2. و3.2.3.3. أوقف المضخة مؤقتا ، وأغلق صمام الكرة الشائكة للخرطوم ، وافصل الكاربوي القديم بسرعة ، وقم بتوصيل carboy الجديد.
ملاحظة: للحصول على معدل تدفق 0.6 مل / دقيقة ، ستكون هناك حاجة إلى وسيط جديد كل 9 أيام. - تحقق من مستوى الوسط في زجاجة الصيد غير العينية. في حالة الامتلاء، قم بتجميع زجاجة صيد أخرى غير أخذ العينات وفقا للخطوة 3-2-3-4-1. اغسل الزجاجة الجديدة باستخدام N2 ، وافصل البالون بسرعة باستخدام المحقنة والأنبوب المعدل من الزجاجة القديمة ، وقم بتوصيله بالزجاجة الجديدة.
- قم بإزالة السدادة المعدلة من زجاجة التقاط كاملة غير أخذ العينات. الأوتوكلاف السائل عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ؛ ثم تخلص من السائل وفقا للسياسات المؤسسية للقارئ. قم بتنظيف وتعقيم جميع قطع مجموعة زجاجة الصيد غير أخذ العينات لإعدادها للاستخدام التالي.
- قم بإجراء أخذ العينات كل 7 أيام (أو العدد المطلوب من القارئ) عن طريق القيام بما يلي:
- أدر المحبس ثلاثي الاتجاهات للمنفذ الرأسي العلوي للمفاعل الحيوي لسد النهاية مشيرا إلى زجاجة الصيد غير العينية. جمع 250 مل من السائل.
ملاحظة: للحصول على معدل تدفق 0.6 مل / دقيقة ، سيستغرق جمع 250 مل ~ 7 ساعات. - أعد المحبس ثلاثي الاتجاهات للمنفذ الرأسي العلوي للمفاعل الحيوي لسد النهاية مشيرا إلى زجاجة التقاط العينات. افصل الأنبوب وزجاجة التقاط العينات عن المحبس ثلاثي الاتجاهات للمنفذ الرأسي العلوي للمفاعل الحيوي.
- بعد الاختبار والتخزين و / أو التخلص السليم من سائل أخذ العينات ، قم بتنظيف جميع قطع مجموعة زجاجة التقاط العينات باستثناء البالون باستخدام المحقنة المعدلة. الأوتوكلاف جميع القطع في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة باستثناء البالون مع حقنة معدلة وموصلات محول قفل luer الإناث. أعد التجميع ليوم أخذ العينات التالي.
ملاحظة: يوصى بشدة بتكرار مكرر أو ثلاثي للأجزاء والأغطية والأنابيب والحاجز للإصلاح والاستبدال السريع إذا لزم الأمر.
- أدر المحبس ثلاثي الاتجاهات للمنفذ الرأسي العلوي للمفاعل الحيوي لسد النهاية مشيرا إلى زجاجة الصيد غير العينية. جمع 250 مل من السائل.
- كل يوم يعمل فيه المفاعل الحيوي ، قم بما يلي:
- تحضير بالون مع حقنة معدلة
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نعرض هنا نتائج دراسة المفاعل الحيوي باستخدام طريقة تحضير وسط ثقافة البئر المختلطة وطريقة إعداد المفاعل الحيوي كما هو موضح هنا. تم تعديل وسط الاستزراع المختلط للبئر ليحتوي كمصدر للكربون على ملاط من مكعبات الذرة المعالجة بواسطة الذوبان الحراري المائي التأكسدي (OHD) 13,14. تم ضخ وسط استزراع الآبار المختلط المعدل في المفاعل الحيوي لمدة 44 يوما بمعدل 0.4 مل / دقيقة. في اليوم 23 ، تمت إضافة لقاح مصدره بئر BLM-1 في منطقة وادي الموت في نيفادا بالولايات المتحدة الأمريكية، 15. تم جمع عينات سائلة من المفاعل الحيوي في زجاجة التقاط العينات في الأيام 1 و 8 و 15 و 22 و 23 (بعد التلقيح) و 30 و 37 و 44.
ولتتبع الحالة العامة لاستزراع اللقاح (والمقيمين الباقين على قيد الحياة من رواسب المفاعل الحيوي قبل اللقاح)، لوحظت عينات سائلة للمفاعل الحيوي عن طريق العد المباشر للخلايا. تم إجراء تعداد الخلايا المباشر للسائل الذي تم أخذ عينات منه باستخدام مقياس الدم Petroff-Hauser. لمعرفة هوية الأعضاء الميكروبية في المفاعل الحيوي ، تم استخراج الحمض النووي من عينات سائل المفاعل الحيوي ، وتم تحليل جينات 16S rRNA بواسطة تسلسل الجيل التالي (NGS). تمت معالجة بيانات NGS داخليا باستخدام mothur وفقا ل MiSeq SOP16.
قبل التلقيح ، كان عدد الخلايا المباشر في كثير من الأحيان أقل من حد الكشف (b.d.l.) من 1.0 × 106 خلايا / مل. كان اليوم 23 (بعد التلقيح) يحتوي على عدد خلايا منخفض يبلغ 2.6 × 106 خلايا / مل ، بينما في الأيام التالية 30 و 37 و 44 كان عدد الخلايا أكثر من 1.0 × 107 خلايا / مل (الشكل 3). على الرغم من أن عدد الخلايا كان b.d.l. في الأيام 1 و 8 و 22 ، تم استخراج الحمض النووي ل NGS من كل نقطة زمنية تشير إلى وجود قاعدي للكائنات الحية الدقيقة قبل اللقاح في الرواسب حتى بعد التعقيم. كان الجنس الرئيسي الموجود (الذي يحدده عدد القراءات في كل وحدة تصنيف تشغيلية (OTU)) مستقرا في الأيام 8 و 15 و 22 ، وتم تحديده على أنه Geobacillus. بعد التلقيح بلقاح BLM-1 في اليوم 23 ، لم يعد Geobacillus مهيمنا ، ونشأت أجناس رئيسية جديدة جنبا إلى جنب مع العديد من الأجناس الموجودة بشكل ثانوي ، والتي حافظت في معظمها على وجودها حتى نهاية الدراسة (الشكل 4). من هذه ، نستنتج أن لقاح BLM-1 كان ثقافة نشطة ومتغيرة ديناميكيا داخل المفاعل الحيوي.
كشفت دراسة إضافية لبيانات NGS عن أعضاء "المادة المظلمة الميكروبية". تم استخدام وحدات OTU ذات الأسماء التصنيفية المخصصة التي تحتوي على الكلمات "غير مصنفة" أو "غير مستزرعة" كبديل لوحدات OTU التي تحتوي على أعضاء من "المادة المظلمة الميكروبية". تم جمع بيانات NGS لليوم 44 (اليوم الأخير من ما بعد التلقيح بالكائنات الحية الدقيقة من بئر BLM-1) وتصفيتها بحيث لا تحتوي على OTUs التي كانت تقرأ في بيانات ما قبل التلقيح (الأيام 1 أو 8 أو 15 أو 22) حيث لم يكن من المحتمل أن تكون هذه الوحدات في اللقاح. احتوت بيانات اليوم 44 NGS التي تمت تصفيتها على 1,844 OTUs و 3,396 قراءة. من بين هؤلاء ، كانت 366 OTUs (20٪) و 925 قراءة (27٪) غير مصنفة على مستوى الشعب ، و 1252 OTUs (68٪) و 2357 قراءة (69٪) كانت غير مصنفة أو غير مستزرعة على مستوى الجنس. على الرغم من أن هذه الدراسة التجريبية قصيرة الأجل ، إلا أنها تدعم إمكانات مفاعل حيوي مع وسائط مستنيرة بيئيا لزرع أعضاء "المادة المظلمة الميكروبية".
الشكل 1: رسم تخطيطي لمفاعل البورسليكات الحيوي المصمم خصيصا والمستخدم في الزراعة اللاهوائية. (أ) منظر المفاعل الحيوي من جانب واحد. (B) الدوران A بمقدار 90 درجة (في اتجاه عقارب الساعة) حول المحور z يعطي الرؤية). (ج) منظر علوي للمفاعل الحيوي. يسمح التصميم المغلف بالتحكم في درجة الحرارة بالماء أو الزيت. يمكن رؤية منفذي الغلاف على الجانب الأيمن من المنظر في B. يمكن ملء الغرفة الداخلية بالرواسب من أي نوع أو يمكن تركها فارغة من الرواسب لزراعة العوالق. ثلاثة منافذ لأخذ العينات (تظهر على الجانب الأيمن من المنظر في A) تجعل من الممكن إزالة المواد على أعماق مختلفة من عمود المفاعل الحيوي. يمكن إغلاق الفتحات القياسية 45 و 18 و 14 GL باستخدام حاجز تفلون أو بوتيل الذي سيحمل ختما محكما لمدة 1-6 أشهر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تجميع المفاعل الحيوي النشط. الأواني الزجاجية المعروضة في الصورة من اليسار إلى اليمين هي (أ) 8 لتر كاربوي ، (ب) مفاعل حيوي (انظر الشكل 1) ، و (ج) زجاجة صيد غير أخذ العينات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تعداد الخلايا المباشر من دراسة المفاعل الحيوي. تمت مراقبة المجموعات الميكروبية داخل المفاعل الحيوي باستخدام غرفة عد خلايا مقياس الدم Petroff-Hauser مقاس 0.02 مم. تمت إضافة اللقاح في بداية اليوم 23. كان عدد الخلايا للأيام 1 و 8 و 22 أقل من حد الكشف. حد الكشف الفعال لعد الخلايا المباشر هو 1 × 106 خلايا / مل. الاختصار: b.d.l. = أقل من حد الكشف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تسلسل الجيل التالي من المفاعلات الحيوية. يتم تمثيل وحدات OTU في الرسوم البيانية الشريطية المكدسة التي تشير إلى النسبة المئوية للقراءات التي تنتمي إلى وحدات OTU الفريدة من كل نقطة زمنية لدراسة المفاعل الحيوي. تم تعيين وحدات OTU الفريدة للتصنيف المرتبط بها عند قطع الجنس. يتم تعريف الجنس "الآخر" على أنه جميع الأجناس أقل من 10٪ من القراءات في كل نقطة زمنية. إجمالي عدد قراءات الحمض النووي الممثلة هو 506,358. يتم سرد عدد مرات القراءة لكل نقطة زمنية في الجزء العلوي من الرسم البياني. تمت إضافة اللقاح في بداية اليوم 23. اختصار: OTU = وحدة التصنيف التشغيلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مركب | كمية للثقافة المختلطة للتربة | مبلغ للثقافة المختلطة للبئر | كمية الميثانوجين المعزول في البئر |
| ماء مقطر | 1000.0 مل | 1000.0 مل | 1000.0 مل |
| هيبس | 3.600 غ | - | - |
| المماسح | - | - | 2.000 غ |
| MgCl2 ∙6 H2O | 0.400 غ | 0.400 غ | 0.400 غ |
| ككل | 0.500 غ | 0.250 غ | 0.500 غ |
| NH4سل | 0.268 جرام | 0.268 جرام | 0.268 جرام |
| Na2SO4 | - | 0.284 غ | 1.500 غ |
| Na2HPO4 ∙2 H2O | - | - | 0.356 غ |
| 1 م KH2PO4 عند درجة الحموضة 6 | 1.0 مل | 1.0 مل | - |
| 1 م ح3بو3 عند درجة الحموضة 9.4 | 1.0 مل | 1.0 مل | 1.0 مل |
| المعادن النزرة | 1.0 مل | - | 1.0 مل |
| فيتامينات | - | - | 1.0 مل |
| 1 ملغ / مل ريسازورين الصوديوم | 0.4 مل | 0.3 مل | 0.4 مل |
| تعديل درجة الحموضة إلى | - | 7.0 | 7.0 |
| تعديل درجة الحموضة بواسطة | - | هيدروكسيد الصوديوم | كوه |
| درجة حرارة الحضانة | 25 درجة مئوية | 60 درجة مئوية | 47 درجة مئوية |
الجدول 1: تكوين وسائل الإعلام. قائمة المركبات والمعلمات الفيزيائية لكل وسيط. وسائل الإعلام المقدمة ساذجة. لا تحتوي على مصادر الكربون والطاقة لأنها يمكن أن تكون خاصة ويجب أن تكون مستنيرة بالكائنات الحية الدقيقة للقارئ والبيئة ذات الاهتمام. انظر قسم المناقشة للحصول على أفكار حول الإضافات المحتملة لمصادر الكربون والطاقة.
الملف التكميلي 1: إعداد مشعب الغاز. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يدين قسم الإنتاج المتوسط من هذا البروتوكول (القسم 1) بهيكله إلى تقنية Hungate المعدلة ل Miller and Wolin17 ، والتي تم استخدامها على نطاق واسع منذ نشرها. يأتي التطبيق العملي لهذا البروتوكول الموسع من طبيعته الوصفية واقترانه باكتساب الكائنات الحية الدقيقة في الموقع . تم استخدام زجاجات الاستزراع التي تحتوي على وسائط مستنيرة بيئيا ومحاكاة للنجاح في استزراع الأعضاء السابقين التالية في الموقع من "المادة المظلمة الميكروبية": البكتيريا اللاهوائية تحت السطحية سلالة فركتيكالسيس الحرارية اللاهوائية DRI1318 ، سلالة Caldiatribacterium inferamans SIUC1 (رقم الانضمام MT023787 ؛ المخطوطة قيد الإعداد) ، و اللاهوائية هيفايستي سلالة SIUC3 (رقم الانضمام MK618647 ؛ مخطوطة قيد الإعداد) ، والبكتيريا اللاهوائية تحت السطحية سلالة غير مميزة DRI14 (رقم الانضمام KR708540).
أحد محاور هذا البروتوكول هو أنه مصمم ليكون قابلا للتكيف بدرجة كبيرة مع البيئات اللاهوائية السطحية وتحت السطحية والكائنات الحية الدقيقة. أولا، يشجع التكوين المتوسط على تغييره ليعكس تكوين البيئة محل الاهتمام. على سبيل المثال ، يمكن إضافة 3000 مجم / لتر من كلوريد الصوديوم إلى الوصفة عند محاكاة بيئة بتركيزات أيونية تبلغ 3000 مجم / لتر لكل من Na + و Cl- ؛ أو يمكن وضع 650 مل من الرمل و 650 مل من الصخر الزيتي في المفاعل الحيوي عند محاكاة بيئة بنسبة حجم 1: 1 من الحجر الرملي إلى الصخر الزيتي. ثانيا ، يمكن تعديل التركيب المتوسط لتشجيع نمو الكائنات الحية الدقيقة المحددة ذات الأهمية. على وجه الخصوص ، فإن وسائل الإعلام الساذجة مثل الوسائط الثلاثة في هذه الورقة مهيأة وتعتمد على مثل هذه التعديلات. تشمل أمثلة مصادر الكربون والطاقة فومارات18 ، الببتون18 ، المادة العضوية المحتوية على السليلوز19 ، الأسيتات20 ، مستخلص الخميرة19،20 ، إكسيليتول (سلالة SIUC1) ، فورمات (سلالة SIUC3) ، وغيرها من المصادر المحتملة مثل H2 / CO2 ، السترات ، والجلوكوز. أخيرا ، يمكن تغيير التكوين المتوسط اعتمادا على الدراسة المطلوبة. على سبيل المثال ، كان الاهتمام الرئيسي للدراسة الموصوفة في قسم النتائج التمثيلية هو اكتشاف كيفية استجابة الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية تحت السطحية التمثيلية لملاط عضوي مختلط فريد (ملاط من مكعبات الذرة التي تمت معالجتها بواسطة OHD13،14) ؛ وبالتالي ، احتوت وصفتها على مصدر الكربون هذا بدلا من الخيارات التقليدية. وتشمل التعديلات المحتملة الأخرى لدراسات محددة إضافة اللدائن والأحماض والمعادن الثقيلة أو غيرها من الكائنات الحية الغريبة لدراسات المعالجة البيولوجية؛ إضافة بوليمرات الكربون المتمردة مثل السليلوز والبلاستيك لدراسات المنتجات المنزوعة البلمرة ذات القيمة المضافة ؛ وإضافة السماد والنفايات النباتية للسماد على نطاق صغير والدراسات الزراعية الأخرى.
إذا كان التحليل اللاحق للاختزال لوسط ما مطلوبا ، مثل قياسات الأس الهيدروجيني ، وإمكانية تقليل الأكسدة (ORP) ، والأكسجين المذاب (DO) ، فيمكن تحقيق ذلك بشكل غير مباشر عن طريق التضحية بعدد تمثيلي من الزجاجات المتوسطة لفهم طبيعة تلك الدفعة بثقة. عند تعريض زجاجة متوسطة مختومة للهواء ، يوصى بشدة بأخذ قراءات ORP و DO في أقل من 1 دقيقة عند الفتح. يمكن إجراء القياسات غير المعتمدة على الأكسجين (مثل درجة الحموضة) بشكل غير عاجل بعد الفتح الأولي. تتطلب الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية شديدة الحساسية عادة قيم ORP < -200 مللي فولت للنمو. إذا نتج عن الوسط قيمة ORP تبلغ > -200 mV و / أو قيم DO >0.40 مجم / لتر ، يمكن استخدام Na2S إضافي (0.1-0.2 جم / لتر) أو مختزل آخر (على سبيل المثال ، سترات التيتانيوم ، L-cysteine ، حمض الأسكوربيك) لتقليل الوسط بشكل أكبر.
غالبا ما يستخدم Resazurin كمؤشر للأكسجين (كما في هذا البروتوكول) ؛ ومع ذلك ، فهو أكثر دقة مؤشر الأكسدةوالاختزال 21 ، مما يشير إلى وجود الأكسجين بشكل غير مباشر حيث يغير الأكسجين إمكانات الأكسدة والاختزال للمحلول. Resazurin في الحل يظهر في البداية الأزرق اللون. عند التعرض لعوامل الاختزال ، يتحول المحلول بشكل لا رجعة فيه إلى اللون الوردي. عندما يتم تقليل المحلول بشكل أكبر ، فإنه يتحول بشكل عكسي إلى عديم اللون ويعود إلى اللون الوردي عند الأكسدة. لاحظ المؤلفون حالات تحولت فيها الوسائط المختزلة التي تحتوي على resazurin من الأزرق إلى الوردي ولكنها فشلت في التحول إلى اللون عديم اللون. ومع ذلك ، فقد لاحظ المؤلفون أيضا أن هذه الوسائط غالبا ما تتحول إلى عديمة اللون بعد التعقيم ، وأن زيادة الوقت الذي يقضيه في الغليان وتنظيف الوسائط يسمح عموما للريزازورين بالتحول إلى شكله عديم اللون بعد إضافة المختزلات. إذا رغبت في ذلك ، يمكن التحقق من تركيز الأكسجين في الوسط باستخدام مسبار الأكسجين المذاب.
جميع المواد اللازمة لتشغيل هذه المفاعلات الحيوية والمفاعلات الحيوية الزجاجية المصنوعة حسب الطلب نفسها لم تتجاوز ~ $ 5K (وهذا يفترض أن معدات الدعم متوفرة بالفعل مثل حمامات المياه والمضخات والحاضنات). تقنيات الزراعة اللاهوائية هذه صديقة اقتصاديا ، مقارنة بالمفاعلات الحيوية الآلية التجارية التي يمكن أن تبدأ بسعر > 10 آلاف دولار. بالإضافة إلى ذلك ، يتحول العديد من المفاعلات الحيوية التجارية إلى حاويات مفاعلات تستخدم لمرة واحدة ، مما يغير ديناميكية المقارنة وليس فعالا من حيث التكلفة بالنسبة لمختبرات / جامعات الأبحاث الأصغر لتحل محلها باستمرار. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون للأنظمة التجارية تحيزات كيميائية تصنيعية (من المواد البلاستيكية المستخدمة ، أو الشحوم على الحشيات / التجهيزات ، أو المياه المعالجة كيميائيا) والتي ستؤثر على نجاح نمو الكائنات الحية الدقيقة الحساسة. إن التكلفة المنخفضة والتخصيص والتنوع لجمع عينة بيئية لاهوائية ، جنبا إلى جنب مع وسائط مستنيرة يمكن تلقيحها ، مما يؤدي إلى توليد إثراء للدراسة ، يعزز بشكل كبير فرص الحصول على الكائنات الحية الدقيقة الفريدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يود المؤلفون الاعتراف بنسب المعلومات والإرشاد التي أثرت / طورت هذه التقنيات على مر السنين. يدين الدكتور هاميلتون بريم كطالب دراسات عليا سابق ، وما بعد الدكتوراه ، وأستاذ حالي بالامتنان لأولئك الذين أخذوا الوقت الكافي لتدريس التقنيات اللاهوائية: الدكتور مايك آدامز ، والدكتور جيرتي شوت ، والدكتور جيم إلكينز ، والدكتور ميرسيا بودار ، والدكتور دوان موسر ، والدكتور بريان هيدلوند. دعمت منظمة الحفاظ على الطبيعة والأنهار الأمريكية هذا العمل من خلال المنح G21-026-CON-P و AR-CE21GOS373 ، على التوالي. أي آراء أو نتائج أو استنتاجات أو توصيات معبر عنها في هذه الورقة هي آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة آراء منظمة الحفاظ على الطبيعة أو الأنهار الأمريكية. تم دعم هذا العمل بمنحة من معهد الطاقة المتقدمة SIU ، والذي يعترف بامتنان بالتمويل الممنوح من خلال مجلس موارد الطاقة المتقدمة. تم تنفيذ NGS بواسطة LC Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Materials | |||
| 1 L borosillicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 1 mL syringe with slip tip | Fisher Scientific | ||
| 10 mL glass pipette | Fisher Scientific | ||
| 100 mL culture bottle | Fisher Scientifc | ||
| 20 mm hand crimper | Fisher Scientifc | ||
| 23 G needle | Fisher Scientifc | ||
| 500 mL borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| Aluminum seal | Fisher Scientifc | ||
| Cannula, 31.5 cm length | Fisher Scientific | ||
| Cannula, 6 cm length | Fisher Scientifc | ||
| Corer | Giddings Machine Company | Assembled from company parts | |
| Gas manifold | Swagelok | Assembled from many different parts | |
| Lighter | Lowe's | ||
| N2 gas | Airgas | ||
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | ||
| Rubber stopper (for GL45 bottles) | Glasgeratebau OCHS | ||
| Rubber stopper (for culture bottles) | Ace Glass | ||
| Stirring hot plate | Corning | ||
| Trace minerals | ATCC | ||
| Vitamins | ATCC | ||
| Bioreactor-specific Materials | |||
| #10 rubber stopper | Ace Glass | ||
| #7 rubber stopper | Fisher Scientifc | ||
| 1 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 1/4" hose barb ball valve | Amazon | ||
| 10 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 3.5 L borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 5/16" - 1/4" hose barb adapter fitting | Amazon | ||
| 60 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 8 L borosillicate carboy | Allen Glass | ||
| Angled hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-20 | |
| Balloon | Party City | ||
| Borosillicate bioreactor | Allen Scientific Glass | Custom made upon request | |
| Drill | Lowe's | ||
| Female luer lock adapter coupler | Amazon | ||
| GL14 open top cap | Ace Glass | 7621-04 | |
| GL18 open top cap | Ace Glass | 7621-08 | |
| GL45 open top cap | Ace Glass | ||
| PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap | Ace Glass | 7625-06 | |
| PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap | Ace Glass | 7625-07 | |
| Ring stand | Fisher Scientific | ||
| Ring stand chain clamp | Amazon | ||
| Ring stand clamp | Fisher Scientific | ||
| Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od | Grainger | 55YG13 | |
| Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od | Grainger | ||
| Straight hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-22 | |
| Three-way stopcock | Amazon | ||
| Two-way stopcock | Amazon | ||
| Ultra low flow variable flow mini-pump | VWR | ||
| Water bath | Fisher Scientifc | ||
| White rubber septum for 13-18 mm od tubes | Ace Glass | 9096-49 | |
| Wire | Lowe's | ||
| Zip tie | Lowe's |
References
- Staley, J. T., Konopka, A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).
- Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes. MSystems. 3 (5), e00055 (2018).
- Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
- Marcy, Y., et al. Dissecting biological "dark matter" with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).
- Giovannoni, S., Stingl, U. The importance of culturing bacterioplankton in the'omics' age. Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).
- Stewart, E. J.
- Dedysh, S. N. Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps. Front. Microbiol. 2, 184 (2011).
- Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. Isolating" uncultivable" microorganisms in pure culture in a simulated natural environment. Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).
- Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012 (2011).
- Tyson, G. W., et al. Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community. Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).
- Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).
- Merino, N., et al. Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow. Sci. Total Environ. 842, 156768 (2022).
- Anderson, K. B., Creeping, J. C., Huggett, W. W. Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791. , Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf (2013).
- Anderson, K. B., Crelling, J. C., Huggett, W. W., Perry, D. M. Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512. , Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf (2018).
- Mullin, S. W., et al. Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer. Front. Microbiol. 11, 536535 (2020).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Miller, T. L., Wolin, M. A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes. Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin. Front. Microbiol. 10, 2224 (2019).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).
- Twigg, R. S.
