Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Et sett med in situ-informerte simulerte mediumformater for dyrking av miljøervervede anaerobe mikroorganismer

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/66228
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 3, 1, 4, 1
1Department of Microbiology, Southern Illinois University Carbondale, 2MEDPREP, Southern Illinois University School of Medicine, 3Department of Geology, Southern Illinois University Carbondale, 4Department of Zoology, Southern Illinois University Carbondale

Summary

Fokuset i denne artikkelen er å detaljere beste praksis for å lage medier for kresne anaerobe mikroorganismer ervervet fra et miljø. Disse metodene bidrar til å håndtere anaerobe kulturer og kan brukes til å støtte veksten av unnvikende ukultiverte mikroorganismer, den "mikrobielle mørke materien."

Abstract

Dyrkningsavhengig forskning av anaerobe mikroorganismer hviler på metodisk kompetanse. Disse metodene må skape og opprettholde passende vekstforhold (f.eks. pH- og karbonkilder) for anaerobe mikroorganismer, samtidig som prøvene kan ekstraheres uten at det går ut over det kunstige miljøet. For dette formål kan metoder som er informert av og simulerer et in situ miljø være til stor hjelp for å dyrke mikroorganismer fra dette miljøet. Her skisserer vi en in situ informert og simulert anaerob metode for dyrking av terrestriske overflate- og undergrunnsmikroorganismer, med vekt på anaerob prøveinnsamling med minimal forstyrrelse. Denne protokollen beskriver produksjonen av et tilpassbart anaerob væskemedium, og miljøoppkjøpet og in vitro-veksten av anaerobe mikroorganismer. Protokollen dekker også kritiske komponenter i en anaerob bioreaktor som brukes til miljøsimuleringer av sediment og anaerobe flytende medier for miljøervervede kulturer. Vi har inkludert foreløpige neste generasjons sekvenseringsdata fra et vedlikeholdt mikrobiom over levetiden til en bioreaktor der den aktive kulturen dynamisk justeres som svar på en eksperimentell karbonkilde.

Introduction

De fleste mikroorganismer forblir ukultiverte; Dette støttes av den store forskjellen mellom celler observert gjennom mikroskopi i motsetning til de få mikroorganismer som er vellykket dyrket ved hjelp av agarplater. Staley og Konopka kalte denne ulikheten "Great Plate Count Anomaly"1. Det estimerte ikke-regnskapsførte mangfoldet støttes av metagenomiske og metatranskriptomiske data som viser mange nye slekter fordelt på rangkurver fra flere forskjellige miljøer2. Mikroorganismer som har blitt observert (vanligvis ved tilfeldig haglesekvensering av et mikrobielt samfunn), men som ikke har blitt dyrket, har blitt referert til som "mikrobiell mørk materie"3,4.

I en alder av -omics er dyrking av mikroorganismer fortsatt viktig for å fullt ut evaluere genomiske data og verifisere funksjonen / fenotypen av gener som er tilstede. Sekvensering av dyrkede mikroorganismer er fortsatt den eneste måten å trygt oppnå komplette genomer til teknologier som haglemetagenomikk og metagenommonterte genomer fra miljøet blir tillatelig ufeilbarlige5. Genomiske evalueringer kombinert med dyrkede mikroorganismer gir sterke slutninger for å forstå "mikrobiell mørk materie." Mange medlemmer av den "mikrobielle mørke materien" utfører viktige funksjoner som påvirker syklingen av næringsstoffer og andre elementer og produksjonen av verdifulle naturlige produkter, støtter økologiske systemer og utfører økologiske tjenester. Fra det medisinske perspektivet er omtrent halvparten av alle legemidler som markedsføres i dag produkter og derivater av produkter fra bakterier, og profilering av ukultiverte arter mistenkes å avsløre fremtidens antibiotika. For å få tilgang til denne ukultiverte majoriteten må ulike dyrkingsmetoder økes6. Blant medlemmene av den "mikrobielle mørke materien" er anaerobe oligotrofe mikroorganismer i stor grad underrapportert og sannsynligvis økologisk og industrielt verdifulle biokjemiske veier7, noe som gjør dem til viktige mål for dyrking. Imidlertid er anaerobe oligotrofe mikroorganismer vanskeligere å dyrke enn deres aerobe og kopiotrofe kolleger på grunn av ofte nødvendige lengre inkubasjonstider, kresne forhold (f.eks. Spesielt ikke-standard in vitro-temperaturer ) og bruk av spesialiserte medieoppskrifter.

Nåværende utviklingsteknikker for å dyrke medlemmer av "mikrobiell mørk materie", inkludert nye anaerobe oligotrofe mikroorganismer, har forbedret vår forståelse og økt representasjonen av disse mikroorganismer i det fylogenetiske treet. Nåværende teknikker som bruker informerte medier for å dyrke nye mikroorganismer (dvs. medier som er avledet ved hjelp av kunnskap om mikroorganismen / s av interesse) kan deles inn i tre forskjellige metoder. Den første av metodene innebærer direkte fjerning av en diskret del av miljøet for overføring til et in vitro vekstkammer som allerede inneholder mikroorganismer av interesse i en membran. Den diskrete delen (f.eks. sjøvann) virker for å gi mikroorganismer av interesse det geokjemiske habitatet de bruker in situ, mens membranen arresterer bevegelsen av celler over (celler av interesse vil forbli innenfor; fremmede celler som ankom med den diskrete delen vil forbli uten). Ved å inkludere forbindelser som er naturlig tilgjengelige for å målrette mikroorganismer i deres naturlige habitat, kan slike mikroorganismer dyrkes8. Den andre metoden benytter metatranskriptomikk eller genomikk for å belyse metabolske evner, og gir ledetråder til smale dyrkingsparametere for en målrettet mediumdesign. Denne tilnærmingen gir en øko-fysiologisk profil som kan brukes til å målrette anrikning av bestemte typer mikroorganismer ut av et miljø. Mediets bestemmelser er rettet mot de identifiserte gener som antas å støtte de målrettede mikroorganismene for å redusere anrikningsmangfoldet,9,10. En advarsel er at genomisk informasjon ikke direkte utleder uttrykket av gener, mens transkriptomisk informasjon gjør det.

Den tredje metoden omfatter miljøinformerte og simulerte medier, forskjellig fra den første metoden, som ikke simulerer mediene, men bruker miljøet direkte som mediekilde. Denne tredje metoden krever miljørekognosering av geokjemien til et feltområde som inneholder mikroorganismer av interesse. Med denne kunnskapen identifiseres primære komponenter og fysiske parametere for å produsere et miljøinformert simulert medium. Mediet mottar deretter en direkte infusjon av mikroorganismeholdig sediment eller væske fra miljøet inn i mediet. Denne metoden er spesielt verdifull i tilfeller der dyrkningsmikrobiologen ikke har tilgang til tilstrekkelige mengder kildemiljø (som nødvendig for den første metoden) eller passende metatranskriptomiske eller genomiske data (som nødvendig for den andre).

Følgende protokoll er et eksempel på den tredje metoden; Det er informert av og har som mål å simulere miljøer av interesse. Tre naive medieoppskrifter rettet mot ulike anaerobe mikroorganismekulturer ervervet i feltet presenteres parallelt i protokollen. De tre kulturene som er representert er blandingskulturer som stammer fra jord (heretter jordblandingskultur), blandingskulturer som stammer fra et borehull (heretter blandet borehullskultur), og et isolert metanogen som stammer fra et borehull (heretter isolert metanogen). De sammensatte identitetene og mengdene i medieoppskriftene som deles her, er ment som en begynnelsesguide; De er i stand til og oppfordres til å bli tilpasset leserens miljø og mikroorganismer av interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Produksjon av tilpassbart anaerob flytende medium

  1. Medium for kulturflasker (produksjon på 500 ml)
    1. Mål og tilsett forbindelser til en 1 L-flaske og juster pH ved hjelp av kolonnen i tabell 1 som tilsvarer leserens interessekultur (beløp i tabell 1 er registrert for produksjon på 1000 ml, juster tilsvarende). Bland forbindelser til homogenitet ved å virvle flasken.
    2. Varm væsken til koking ved å mikrobølgeovn flasken i 5-6 min. Åpne mikrobølgeovnen ofte og virvle væsken forsiktig med en varmebestandig hanske. Åpne mikrobølgeovnen raskt hvis væsken går stille etter boblende; Ellers kan væsken raskt ekspandere og overløpe flasken.
    3. Fest en steril 10 ml glasspipette til et N2 gassmanifoldoppsett (basert på utformingen av Balch et al.11, men krever ikke en oppvarmet kobberkolonne for N2 renhetsgass, se tilleggsfil 1 for mer informasjon om gassmanifold). Åpne manifolden for å ventilere O2 og la N2 gass strømme ut.
    4. Plasser pipettespissen i væsken og juster gassstrømmen slik at boblene er moderat kraftige. Skyll væsken med N2 til flasken ikke lenger er for varm til å berøre.
      MERK: Dette er avhengig av innholdet i media, men tar vanligvis ~ 20 min.
    5. Mens du venter på at flasken skal avkjøles, sett ut 10 sterile 100 ml kulturflasker; eller hvis du forbereder medier for innsamling av jordblandet kultur, sett ut to sterile 500 ml flasker.
    6. Når medieflasken er avkjølt å ta på, trekker du pipettespissen opp i hodeplassen på flasken. Tilsett 0,125 g NaHCO3 og 0,300 g Na2S ∙ 9 H2O og vent til resazurin blir fargeløs.
      FORSIKTIG: Na2S ∙ 9 H2O er etsende, giftig og irriterende. Bruk personlig verneutstyr ved håndtering og skyll metallverktøy grundig etter kontakt.
    7. Mens du venter på at resazurin skal skifte farge, fest metallkanyler til gassmanifoldoppsettet og plasser kanylespissene i kulturflasker. Juster strømmen av N2 i flaskene til en moderat hastighet, slik at væsken tilsatt i det påfølgende trinnet ikke skvulper rundt på grunn av gasstrømmen.
    8. Når resazurin er fargeløs, allikot 50 ml væske inn i hver kulturflaske eller 250 ml væske i hver 500 ml flaske.
    9. Kork hver flaske med en gummipropp av tilsvarende størrelse umiddelbart etter at kanylene er fjernet. Fest proppen med en aluminiumsforsegling (for kulturflasker) eller en GL45 skrukork med åpen topp (for 500 ml flasker).
    10. Plasser flaskene i en autoklaverbar beholder og fyll beholderen med vann fra springen til vannstanden samsvarer med de i flaskene.
      MERK: Dette vil sikre at flaskene ikke sprekker på grunn av stress forårsaket av temperaturforskjeller på glasset under autoklavering.
    11. Autoklav flaskene ved 121 °C i 30 minutter.
  2. Medium for bioreaktor (produksjon av 8 L)
    1. Forberedelse av carboy
      1. Åpne ventilen på en 1/4" (6,4 mm) slangebarbkuleventil. Fest to 6 cm lengder på 1/4" (6,4 mm) indre diameter (ID) og 1/2" (12,7 mm) ytre diameter (OD) silikonrør på hver ende av slangebarbkuleventilen.
      2. Fest til den ene enden av enheten en 5/16"-1/4" (7,9 mm-6,4 mm) slangestang adapter montering. Fest den andre enden av forsamlingen til slangestengen til en 8 L carboy.
      3. Bruk glidelås for å sikre forbindelsen mellom carboyens slangestang og slangen, og forbindelsen mellom slangefesteadapteren og slangen.
      4. Autoklav carboyen med montering ved 121 °C i 30 min.
    2. Middels produksjon
      1. Lukk ventilen til slangebarbkuleventilen på 8 L carboy-enheten.
      2. Mål og tilsett forbindelser til 8 L carboy og juster pH ved hjelp av kolonnen i tabell 1 som tilsvarer leserens kultur av interesse (beløp i tabell 1 er registrert for produksjon på 1000 ml, juster tilsvarende). Tilsett en rørestang og bruk en omrørende kokeplate for å blande forbindelsene til homogenitet.
      3. Varm væsken til koking med omrøringskokeplaten. La væsken koke i 30 min.
        MERK: Oppvarming av væsken til koking er avhengig av innholdet i mediet, men kan ta 2-3 timer.
      4. Fest en steril 10 ml glasspipette til et N2 gassmanifoldoppsett (basert på utformingen av Balch et al.11, men krever ikke en oppvarmet kobberkolonne for N2 renhetsgass, se tilleggsfil 1 for mer informasjon om gassmanifold). Åpne manifolden for å ventilere O2 og la N2 gass strømme ut.
      5. Slå av varmen, plasser deretter pipettespissen i væsken, og juster gassstrømmen slik at boblene er moderat kraftige, men ikke overfylte. Skyll væsken med N2 i 30 minutter.
      6. Trekk pipettespissen opp i hoderommet på carboyen. Tilsett 2,0 g NaHCO3 og 4,8 g Na2S ∙ 9 H2O, og vent til resazurin blir fargeløs.
        FORSIKTIG: Na2S ∙ 9 H2O er etsende, giftig og irriterende. Bruk personlig verneutstyr ved håndtering og skyll metallverktøy grundig etter kontakt.
      7. Når resazurin er fargeløs, fjern glasspipetten og dekk umiddelbart carboyen med en #10-propp. Vri en ledning over proppen og rundt leppen på carboyen for å sikre proppen.

2. in situ oppkjøp av miljøanaerobe mikroorganismer

  1. Overflateanaerob prøvetaking (jordblandingskultur)
    1. Ta med flasken(e) med blandet jordkultur laget som ovenfor og en corer ut i åkeren.
      MERK: En Giddings 2 5 / 8 "standard taper jordbit brukes av forfatterne (Table of Materials). Imidlertid kan enhver jordkorer eller sparkel som kan prøve til ønsket dybde brukes.
    2. Skyv (haug / stake drive) coreren inn i sedimentet til toppen av prøveinnsamlingssylinderen er i flukt med overflaten av sedimentet.
    3. Vri coreren 90° for å frigjøre kjernen og trekk oppover til prøven trekkes ut av miljøet.
    4. I løse sedimenter (som det som kan oppstå ved prøvetaking av våtmarker), dekk bunnen av kjernen med en ny nitrilhansket hånd når den blir ekstrahert for å forhindre at prøven faller ut eller sprer seg i vannet ved utvinning.
    5. Raskt omtrentlig med øyet 6-7 cm opp fra bunnen av kjernen. Bruk en ny hånd med nitrilhansker til å skjære inn i kjernen og skill de nederste 6-7 cm.
    6. Overfør umiddelbart bunnen av kjernen til kulturflasken. Hvis jordsmonnet / sedimentet er for stort, form det raskt for å passe lettere inn i flasken, og minimer eksponeringen for den aerobe atmosfæren så mye som mulig.
    7. Når prøven er overført, plasserer du umiddelbart proppen og holder den på plass med en skrukork.
    8. Hold prøven kjølig. Sett oppsamlingsflasken i kjøleskap ved 4 °C når den returneres til laboratoriet.
  2. Anaerob prøvetaking i undergrunnen (blandet kultur av borehull)
    1. Sett ut en steril 1 l flaske ved hjelp av gassmanifolden. Kork flasken med en gummipropp. Drypp 100% etanol på proppen og sett den i brann med en lighter.
    2. Fest en steril 23 G kanyle til N2 gassmanifoldoppsettet. Åpne manifolden for å ventilereO2 og la N2 (eller Ar) gass strømme ut med moderat hastighet.
    3. Når proppen ikke lenger brenner, stikk kanylen inn i flasken. Stikk en annen steril 23 G kanyle som ikke er festet til gassmanifolden inn i flasken. Skyll flasken i 1-2 min.
    4. Trekk ut kanylen som ikke er festet til gassmanifolden. Trykk flasken i 1 min. Trekk ut den gjenværende kanylen.
    5. Ta trykkflasken og en sterilisert 23 G kanyle til borehullsstedet. Trekk opp væske fra borehullet etter metodene til Merino et al.12.
      MERK: Avhengig av metoden, tilkoblingen og strømningshastigheten til borehullet, endrer dette strategien for å anskaffe en vannprøve. Hvis det er en kontinuerlig strøm av vann, samler du vann som beskrevet i trinn 2.2.6. vil være tilstrekkelig. Hvis vannstrømmen er batchoppsamlet eller lav strømning, kan en alternativ innløps- / utløpsmetode brukes. I alle situasjoner, minimer forurensning, og forsøk å sikre at prøven som samles inn er representativ for miljøet som ønskes å prøve. Dette er en bredt generalisert uttalelse fordi det har vært forfatternes erfaring at hver prøveinnsamlingshendelse fra offentlige eller private nettsteder måtte være svært tilpasningsdyktig til den tilgjengelige tilgjengeligheten.
    6. Åpne flasken raskt, pump inn væske for å fylle flasken helt, og lukk flasken.
    7. Stikk 23 G kanylen som ble ført til stedet inn i flaskens gummipropp for å lette trykket i flasken. Trekk ut kanylen.
    8. Hold prøven kjølig. Sett oppsamlingsflasken i kjøleskap ved 4 °C når den returneres til laboratoriet.

3. in vitro vekst av anaerobe mikroorganismer ervervet i feltet

  1. Vekst etter kulturflaske
    1. Sett ut en proppet steril flaske med N2 og dyrkningsflasker og oppsamlingsflaske tilberedt som ovenfor. Drypp 100% etanol på proppene og sett dem i brann med en lighter.
    2. Monter en 23 G kanyle på en 1 ml sprøyte. Når proppene ikke lenger brenner, stikk kanylen inn i N2-flasken og trekk opp ~1 ml N2. Trekk ut kanylen.
    3. Trykk stempelet sakte ned for å løsne N2. Så snart sprøyten er tom, stikk kanylen inn i oppsamlingsflasken og trekk opp 0,5 ml av miljøprøven. Trekk ut kanylen.
    4. Stikk kanylen inn i dyrkningsflasken og injiser prøven. Trekk ut kanylen.
    5. Roter flasken og legg den i en inkubator ved temperatur, som informert av tabell 1 eller leserens interessemiljø.
      MERK: Kulturfremgang (enten flaske eller bioreaktor) overvåkes ved hjelp av et 0,02 mm dypt Petroff-Hauser hemocytometer. Anrikninger av anaerobe eller kresne mikroorganismer når vanligvis ikke celletettheter der OD600 er brukbar, og andre deteksjonsmetoder er upraktiske for rutinemessig og repeterende overvåking. Deteksjonsgrenser, kvalitetskontroll og statistiske beregninger er avhengig av typen celletellingskammer og brukerens behov.
  2. Vekst av bioreaktor
    1. Klargjøring av en ballong med en modifisert sprøyte
      1. Fjern stempelet fra tre 10 ml luerlåssprøyter (én for hver sluttmontering). Klipp av flensen fra hver sprøyte og fil den avskårne enden slik at den ikke stikker hull på ballongene. Rengjør alle arkiverte sjetonger ut av den modifiserte sprøyten.
      2. Forbered en dobbel ballong ved å plassere en ballong inne i en annen.
      3. Strekk enden av den doble ballongen over den modifiserte 10 ml sprøyten.
      4. Litt skille enden av den ytre ballongen fra den indre ballongen. Klem ut all luften som er fanget mellom ballongene.
      5. Stram et glidelåsbånd rundt bunnen av ballongene for å feste ballongene til sprøyten.
    2. Klargjøring av en modifisert propp
      1. Fjern stemplene fra ti 1 ml luerlåssprøyter (to for hver propp som skal endres). Klipp flensen fra sprøytene.
      2. Sett ut to gummipropper størrelse #10 (for 8 L carboys) og tre størrelser for flasker med GL45 gjengefinish (for fangflasker). Bruk et 1/4" (6,4 mm) bor og bor to hull gjennom toppen av hver gummipropp som er brede nok til at de modifiserte sprøytene får plass og er smale nok til at passformen er lufttett.
      3. Sett de modifiserte sprøytene gjennom hullene på gummiproppen.
      4. Rengjør og autoklav den modifiserte proppen ved 121 °C i 30 minutter.
    3. Forberedelse av bioreaktorenheten
      1. Desinfiser med 70% etanol alle stoppekraner, kvinnelige luerlåsadapterkontakter og andre ikke-autoklaverbare bioreaktormaterialer, og autoklav ved 121 ° C i 30 minutter alle rør (etter kutting i lengden), propper, glassull og andre autoklaverbare bioreaktormaterialer.
      2. Sett en steril bioreaktor (figur 1 og figur 2) på et ringstativ og fest den med en kjedestropp. Sett også ut et vannbad, en peristaltisk pumpe, den stoppede 8 L carboy inneholdende medium (fra protokoll trinn 1.2), en 3.5 L flaske (ikke-prøvetaking fangstflaske), og en 500 ml flaske (prøvetaking fangstflaske).
      3. Stopper carboyen
        1. Sett ut en ballong med en modifisert sprøyte. Koble en treveis stoppekran til sprøytens luerlåsespiss.
        2. Ta ballongenheten og koble treveis stoppekranen til slangen til en tank på N2. Vri treveis stoppekran for å blokkere enden som er åpen for atmosfæren.
        3. Åpne bensintanken og fyll ballongen med N2. Når den er full, snu treveis stoppekranen for å blokkere enden til ballongen. Lukk bensintanken og koble tankslangen fra treveis stoppekran.
        4. Koble til følgende i rekkefølge: en treveis stoppekran (av ballongen med den modifiserte sprøyten), en toveis stoppekran, en hunnlåsadapterkobling og luerlåsspissen på en av sprøytene til den modifiserte proppen.
        5. Til den andre sprøytens luerlåsspiss, koble til en toveis stoppekran. Lukk begge ventilene til toveis stoppekranene på den modifiserte stoppenheten.
        6. Vri ledningen som holder carboyens umodifiserte størrelse #10-stopper. Bytt raskt ut den umodifiserte stopperen med den modifiserte stopperenheten og vri ledningen som før for å feste den modifiserte stopperenheten til carboyen.
          MERK: Hvis den er trygg og forberedt, kan den modifiserte stopperenheten brukes til å stoppe carboyen på det siste trinnet med middels forberedelse (trinn 1.2.2.7).
        7. Vri treveis stoppekran for å blokkere enden som er åpen for atmosfæren. Åpne toveis stoppekran i sekvensen. Gassen fra ballongen og hoderommet til 8 L carboy er nå koblet sammen.
      4. Stoppe fangstflasker uten prøvetaking og prøvetaking
        1. Stopp den 3,5 l ikke-prøvetakende fangstflasken med en modifisert propp størrelse for flasker med GL45 gjengefinish, og påfør 70% etanol på bunnen av proppen for å hjelpe til med å passe den inn i flasken. Kork flasken med en GL45 skrukork med åpen topp.
        2. Koble til følgende i rekkefølge: en ballong med den modifiserte sprøytens luerlåsspiss, en treveis stoppekran, en hunnlåsadapterkobling og luerlåsspissen på en av sprøytene til den modifiserte proppen. Vri treveis stoppekranen for å blokkere enden som er åpen direkte mot atmosfæren.
        3. Til den andre sprøytens luer lock-spiss, koble til en hunnlig luer lock adapter coupler.
        4. Gjenta de tre trinnene ovenfor for 500 ml prøvetakingsfangstflasken.
      5. Oppsett av slanger
        1. Mål avstanden mellom bioreaktorens vannkappeporter og vannbadslangestengene. Klipp to lengder på 3/16" (4,8 mm) ID, 3/8" (9,5 mm) OD silikonrør for å spenne over denne avstanden.
        2. Monter to rette slangekoblinger med GL14 skrukork med åpen topp. Fest hver til den ene enden av de to rørstykkene.
        3. Vri skrukorkene på portene på bioreaktorens vannkappe. Fest de andre endene av slangen til vannbadslangestengene slik at vannet vil strømme ut av vannbadet, gå inn i bunnen av bioreaktorens vannkappe, gå ut på toppen av vannkappen og gå tilbake til vannbadet. Stram glidelåsen rundt endene av slangen for å feste slangen til vannbadslangestengene.
        4. For pumper som ligner på VWR Ultra Low Flow Variable Flow Mini-Pump, trer du den medfølgende 3/16" (4,8 mm) OD-slissede rørenheten gjennom pumpen.
        5. Mål avstanden mellom carboy-slangeenheten og den peristaltiske pumpeslangeenheten. Klipp en lengde på 3/16" (4,8 mm) ID, 3/8" (9,5 mm) OD silikonrør for å spenne over denne avstanden.
        6. Fest den ene enden av slangen til slangestengen på carboy-slangeslangeenheten og den andre til slangebarben til den peristaltiske pumpeslangeslangen, orientert slik at mediet vil strømme fra kargutten og gjennom den peristaltiske pumpen.
        7. Mål avstanden mellom den peristaltiske pumpeslangeenheten og den nederste porten til bioreaktoren. Klipp en lengde på 3/16" (4,8 mm) ID, 3/8" (9,5 mm) OD silikonrør for å spenne over denne avstanden.
        8. Fest den ene enden av denne slangen til slangerøret på den peristaltiske pumpeslangeenheten og fest den andre forsiktig til den nederste porten på bioreaktoren. Pass på at du ikke sprekker glasset, men også for å sikre tilkoblingen, stram et glidelåsbånd rundt enden av slangen for å feste slangen til den nederste porten på bioreaktoren.
        9. Mål og kutt omtrent 5" (127mm) lengde på 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD silikonrør.
        10. Fest en hunnkontakt for luerlåsadapter til en treveis stoppekran. Fest enhver ende av treveis stoppekran til slangen.
        11. Monter en vinklet slangekontakt med GL14 skrukork med åpen topp. Fest den til den andre enden av slangen.
        12. Vri skrukorken på den øverste vertikale porten på bioreaktoren. Vri treveis stoppekran for å blokkere enden som peker mot bioreaktoren.
        13. Mål avstanden mellom den øverste vertikale portenheten og fangstflaskeenheten uten prøvetaking. Klipp en lengde på 3/16" (4,8 mm) ID, 3/8" (9,5 mm) OD silikonrør for å spenne over denne avstanden. Klipp flensene av to 1 ml luerlåssprøyter og sett dem inn i endene av slangen.
        14. Fest den ene enden av denne slangeenheten til den treveis stoppekranen på den øverste vertikale portenheten og fest den andre enden til hunnlåsadapterkontakten på fangflaskeenheten uten prøvetaking.
        15. Mål avstanden mellom den øverste vertikale portenheten og prøvetakingsflaskeenheten. Klipp en lengde på 3/16" (4,8 mm) ID, 3/8" (9,5 mm) OD silikonrør for å spenne over denne avstanden. Klipp flensene av to 1 ml luerlåssprøyter og sett dem inn i endene av slangen.
        16. Fest den ene enden av denne slangeenheten til treveis stoppekran på den øverste vertikale portenheten og fest den andre til hunnlåsadapterkontakten på prøvetakingsflaskeenheten.
    4. Fylling av bioreaktoren
      1. Dekk en av bioreaktorens GL18-porter med en hvit gummiseptum. Sett lokk på den andre GL18-porten og gjenværende vertikale, eksponerte GL14-porter med PTFE-størrelse GL18/GL14-størrelse med silikonsepta (PTFE mot glasset) og skrukork med åpen topp.
      2. Pakk 0,9 g glassull inn i bioreaktorens base med en 50 cm lengde.
      3. Autoklav 1,3 liter sand ved 121 °C i 30 minutter. Fyll bioreaktoren med sanden ved hjelp av en trakt.
        MERK: Andre sedimenttyper informert av leserens miljø og mikroorganismer av interesse kan erstattes her.
      4. Plasser røret til en tank på N2 i toppen av bioreaktoren og skyll bioreaktorens headspace med N2 i 2 minutter. Sett umiddelbart lokk på bioreaktoren med en #7-størrelse propp og en GL45 skrukork med åpen topp.
      5. Fra fangstflasken uten prøvetaking, koble fra slangen og vri treveis stoppekran for å blokkere enden som peker mot ballongen. Koble slangen til en tank på N2 til hunnlåsadapterkontakten og skyll bioreaktorens headspace med N2 i 2 minutter. Koble umiddelbart til slangen og returner treveis stoppekran for å blokkere enden som er åpen for atmosfæren.
      6. Gjenta trinnet ovenfor for prøvetakingsfangstflasken.
      7. Vri treveis stoppekran på bioreaktorens øverste vertikale port for å blokkere enden som peker på prøvetakingsflasken. Pump væske fra carboyen inn i bioreaktoren. Pause pumpen, og luft prøvetakingsflaskens ballong, og fyll carboyens ballong med N2 etter behov.
      8. Når bioreaktoren er fylt med mediet, setter du pumpens strømningshastighet til 0,6 ml/min (digital verdi på 40 på minipumpen).
        MERK: Andre leserønskede strømningshastigheter kan erstattes her.
      9. Still inn temperaturen i vannbadet, som informert av tabell 1 eller leserens interessemiljø.
        MERK: Inokulum kan legges til på dette tidspunktet eller senere, avhengig av studiespesifikasjoner. Hvis du er inokulert på dette tidspunktet, fortsett til trinn 3.2.4.10. Hvis du vaksinerer senere, går du videre til trinn 3.2.5.
      10. Sett ut en oppsamlingsflaske eller inokulert dyrkningsflaske og en proppet steril flaske N2. Drypp 100% etanol på proppene og sett dem i brann med en lighter.
      11. Monter en 23 G kanyle på en 60 ml sprøyte. Når proppene ikke lenger brenner, stikk kanylen inn i N2-flasken og trekk opp ~50 ml N2. Trekk ut kanylen.
      12. Trykk stempelet sakte ned for å løsne N2. Så snart sprøyten er tom, stikk kanylen inn i oppsamlingsflasken og trekk opp 50 ml av miljøprøven. Trekk ut kanylen.
      13. Bytt 23 G kanylen mot en steril lang metallkanyle (kanyle, lengde 31,5 cm). Sett den lange metallnålen gjennom den hvite gummiseptumen på bioreaktorens GL18-port.
      14. Skyv nålen inn i sedimentet og injiser inokulumet. Trekk ut kanylen.
    5. Kjører vedlikehold av bioreaktorer
      1. Hver dag som bioreaktoren kjører, utfør følgende:
        1. Sjekk vannbadnivået. Hvis det er lavt, tilsett mer vann (bruk destillert vann for utstyrets levetid ved å redusere korrosjon og mineraloppbygging).
        2. Sjekk ballongen på fangstflasken uten prøvetaking; En full ballong vil hemme strømmen av mediet. Når den er full, vrir du treveis stoppekranen for å blokkere enden som peker på fangstflasken. Klem ballongen for å tømme den; Deretter returnerer du treveis stoppekranen for å blokkere enden som er åpen for atmosfæren; Gjenta til ballongen er tom.
        3. Sjekk ballongen til 8 L carboy. Hvis den er lav, lukker du toveis stoppekran i sekvensen og kobler treveis stoppekran fra toveis stoppekran. Fyll på og fest ballongenheten på nytt ved å følge trinn 3.2.3.3.2, 3.2.3.3.3 og 3.2.3.3.7.
        4. Sjekk nivået på mediet i 8 L carboy. Hvis den er lav, monter du en annen 8 L carboy og klargjør mer medium etter protokolltrinn 1.2. og 3.2.3.3. Sett pumpen på pause, lukk slangekuleventilen, koble fra den gamle carboyen raskt og koble til den nye carboyen.
          MERK: For en strømningshastighet på 0,6 ml / min, vil det være behov for nytt medium hver 9. dag.
        5. Kontroller nivået på mediet i fangstflasken uten prøvetaking. Hvis den er full, monterer du en annen fangstflaske uten prøvetaking i henhold til trinn 3.2.3.4.1. Skyll den nye flasken med N2, koble ballongen raskt fra den modifiserte sprøyten og slangen fra den gamle flasken, og koble til den nye flasken.
        6. Fjern den modifiserte proppen fra en full fangstflaske uten prøvetaking. Autoklav væsken ved 121 °C i 30 minutter; Kast deretter væsken i henhold til leserens institusjonelle retningslinjer. Rengjør og autoklav alle deler av den ikke-prøvetakende fangstflaskeenheten for å forberede dem til neste bruk.
      2. Utfør prøvetaking hver 7. (eller leserønsket antall) dager ved å gjøre følgende:
        1. Vri den treveis stoppekranen på bioreaktorens øverste vertikale port for å blokkere enden som peker på fangstflasken uten prøvetaking. Samle 250 ml væske.
          MERK: For en strømningshastighet på 0,6 ml / min, vil oppsamling av 250 ml ta ~ 7 timer.
        2. Sett den treveis stoppekranen tilbake på bioreaktorens øverste vertikale port for å blokkere enden som peker på prøvetakingsflasken. Koble slangen og prøvetakingsflasken fra den treveis stoppekranen på bioreaktorens øverste vertikale port.
        3. Etter testing, lagring og/eller riktig avhending av prøvetakingsvæske, rengjør alle deler av prøvetakingsflaskeenheten unntatt ballongen med den modifiserte sprøyten. Autoklav alle deler ved 121 °C i 30 minutter, unntatt ballongen med modifisert sprøyte og hunnluerlåsadapterkontakter. Sett sammen igjen for neste prøvetakingsdag.
          MERK: Det anbefales sterkt å ha duplisert eller trippel redundans av deler, caps, rør og septa for rask reparasjon og utskifting om nødvendig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her viser vi resultater fra en bioreaktorstudie ved bruk av en borehullsblandingskulturmediumprepareringsmetode og en bioreaktoroppsettmetode som beskrevet her. Borehullsblandingskulturmediet ble modifisert til å inneholde som karbonkilde en oppslemming av maiskolber behandlet ved oksidativ hydrotermisk oppløsning (OHD)13,14. Modifisert borehullsblandingsmedium ble pumpet inn i bioreaktoren i 44 dager med en hastighet på 0,4 ml/min. På dag 23 ble en inokulum hentet fra borehull BLM-1 i Death Valley-regionen i Nevada, USA, lagt til15. Væskeprøver fra bioreaktoren ble samlet i en prøvetakingsflaske på dagene 1, 8, 15, 22, 23 (etter inokulering), 30, 37 og 44.

For å spore den generelle statusen til inokulumkulturen (og pre-inokulum autoklav-overlevende beboere av bioreaktorsedimentet), ble bioreaktorvæskeprøver observert ved direkte celletelling. Direkte celletellinger av samplet væske ble gjort med et Petroff-Hauser hemocytometer. For å lære identiteten til mikrobielle medlemmer av bioreaktoren ble DNA ekstrahert fra bioreaktorvæskeprøver, og 16S rRNA-genene ble analysert ved Next Generation Sequencing (NGS). NGS-dataene ble behandlet internt ved hjelp av mothur etter MiSeq SOP16.

Før inokulering var direkte celletall ofte under deteksjonsgrensen (b.d.l.) på 1,0 × 106 celler/ml. Dag 23 (etter inokulering) hadde et lavt celletall på 2,6 × 106 celler/ml, mens de påfølgende dagene 30, 37 og 44 hadde celletall over 1,0 × 107 celler/ml (figur 3). Selv om celletall var b.d.l. på dag 1, 8 og 22, ble DNA ekstrahert for NGS fra hvert tidspunkt, noe som indikerer en basal tilstedeværelse av pre-inokulum mikroorganismer i sedimentet selv etter autoklavering. Hovedslekten som var tilstede (bestemt av antall avlesninger i hver operative taksonomiske enhet (OTU)) var stabil på dag 8, 15 og 22, og ble identifisert som Geobacillus. Etter inokulering med BLM-1-inokulum dag 23 dominerte ikke Geobacillus lenger, og nye store slekter oppsto sammen med en mengde mindre tilstedeværende slekter, som for det meste opprettholdt en tilstedeværelse til slutten av studien (figur 4). Fra disse konkluderer vi med at BLM-1-inokulumet var en aktiv og dynamisk skiftende kultur i bioreaktoren.

En ytterligere studie av NGS-dataene avslørte medlemmer av den "mikrobielle mørke materien." OTUer med tildelte taksonomiske navn som inneholder ordene "uklassifisert" eller "ukultivert" ble brukt som en proxy for OTUer som inneholder medlemmer av den "mikrobielle mørke materien." NGS-data ble samlet inn for dag 44 (siste dag av postinokulasjon med mikroorganismer fra borehull BLM-1) og filtrert til ikke å inneholde OTUer som hadde avlesninger i preinokulasjonsdata (dag 1, 8, 15 eller 22) da disse OTUene sannsynligvis ikke var i inokulum. De filtrerte dag 44 NGS-dataene inneholdt 1.844 OTUer og 3.396 avlesninger. Av disse var 366 OTUer (20%) og 925 lesninger (27%) uklassifisert på fylumnivå, og 1252 OTUs (68%) og 2357 reads (69%) var uklassifiserte eller ukultiverte på slektsnivå. Selv om det er kortsiktig, støtter denne pilotstudien potensialet til en bioreaktor med miljøinformerte medier til kulturmedlemmer av den "mikrobielle mørke materien."

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av spesialdesignet bioreaktor av borosilikater brukt til anaerob dyrking. (A) Bioreaktor utsikt fra den ene siden. (B) Hvis du roterer A 90° (med klokken) om z-aksen, får du visningen). (C) Et toppbilde av bioreaktoren. Den jakkede designen gir mulighet for temperaturkontroll med vann eller olje. De to jacket-portene kan sees på høyre side av utsikten i B. Det indre kammeret kan fylles med sedimenter av enhver type eller kan stå tomt for sediment for planktonisk dyrking. Tre prøvetakingsporter (sett på høyre side av visningen i A) gjør det mulig å fjerne materiale på forskjellige dybder i bioreaktorkolonnen. Standard 45, 18 og 14 GL åpninger kan forsegles ved hjelp av Teflon eller butylsepta som vil holde en gasstett forsegling i 1-6 måneder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Aktiv bioreaktormontering. Glass presentert på bildet fra venstre til høyre er (A) 8 L carboy, (B) bioreaktor (se figur 1) og (C) ikke-prøvetaking fangstflaske. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Direkte celletall fra bioreaktorstudie. Mikrobielle populasjoner i bioreaktoren ble overvåket ved hjelp av et 0,02 mm Petroff-Hauser hemocytometer celletellekammer. Inokulum ble lagt til ved starten av dag 23. Celletallet for dag 1, 8 og 22 var under deteksjonsgrensen. Den effektive deteksjonsgrensen for direkte celletelling er 1 × 106 celler/ml. Forkortelse: b.d.l. = under deteksjonsgrensen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Bioreaktor neste generasjons sekvensering. OTUer er representert i stablede søylediagrammer som indikerer prosentandelen av avlesninger som tilhører unike OTUer fra hvert tidspunkt i bioreaktorstudien. Unike OTUer ble tildelt deres tilknyttede taksonomi ved en slektsavskjæring. Slekten «Annet» er definert som alle slekter mindre enn 10 % av lesningene i hvert tidspunkt. Det totale antallet DNA-avlesninger representert er 506 358. Antall avlesninger for hvert tidspunkt er oppført øverst i diagrammet. Inokulum ble lagt til ved starten av dag 23. Forkortelse: OTU = Operational Taxonomic Unit. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Sammensatt Beløp for jordblandet kultur Beløp for blandet kultur av borehull Mengde for borehullsisolert metanogen
Destillert vann 1000,0 ml 1000,0 ml 1000,0 ml
HEPES 3.600 g - -
MOPPER - - 2.000 g
MgCl2 ∙6 H2O 0,400 g 0,400 g 0,400 g
KCl 0,500 g 0,250 g 0,500 g
NH4Cl 0,268 g 0,268 g 0,268 g
Na2SO4 - 0,284 g 1.500 g
Na2HPO4 ∙2 H2O - - 0,356 g
1 M KH2PO4 ved pH 6 1,0 ml 1,0 ml -
1 M H3BO3 ved pH 9,4 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml
Spormineraler 1,0 ml - 1,0 ml
Vitaminer - - 1,0 ml
1 mg/ml natriumresazurin 0,4 ml 0,3 ml 0,4 ml
pH-justering til - 7.0 7.0
pH-justering med - NaOH KOH
Inkubasjon temperatur 25 °C 60 °C 47 °C

Tabell 1: Mediesammensetning. Liste over forbindelser og fysiske parametere for hvert medium. De presenterte mediene er naive; De inneholder ikke karbon- og energikilder, da disse kan være spesifikke for og bør informeres av leserens mikroorganismer og miljø av interesse. Se diskusjonsdelen for ideer om mulige karbon- og energikildetillegg.

Tilleggsfil 1: Oppsett av gassmanifold. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Middelproduksjonsdelen av denne protokollen (seksjon 1) skylder sin struktur til den modifiserte Hungate-teknikken til Miller og Wolin17, som har blitt mye brukt siden utgivelsen. Det praktiske ved denne utvidede protokollen kommer fra dens beskrivende natur og sammenkobling med in situ-oppkjøpet av mikroorganismer. Kulturflasker som inneholder miljøinformerte og simulerte medier har blitt brukt til å lykkes med å dyrke følgende in situ-ervervede tidligere medlemmer av den "mikrobielle mørke materien": anaerobe undergrunnsbakterier Thermoanaerosceptrum fracticalcis stamme DRI1318, Caldiatribacterium inferamans stamme SIUC1 (tiltredelsesnummer MT023787; manuskript under forberedelse), og Anaerothermus hephaesti stamme SIUC3 (tiltredelsesnummer MK618647; manuskript under forberedelse), og anaerob undergrunnsbakterie ukarakterisert stamme DRI14 (tiltredelsesnummer KR708540).

Et fokus i denne protokollen er at den er laget for å være svært tilpasningsdyktig til overflate- og undergrunnsanaerobe miljøer og mikroorganismer. For det første oppfordres mediesammensetningen til å endres for å gjenspeile sammensetningen av interessemiljøet. For eksempel kan 3,000 mg / L NaCl legges til oppskriften når man simulerer et miljø med ioniske konsentrasjoner på 3,000 mg / L for både Na + og Cl-; eller 650 ml sand og 650 ml skifer kan plasseres i bioreaktoren når man simulerer et miljø med et volumforhold på 1:1 mellom sandstein og skifer. For det andre kan mediesammensetningen modifiseres for å oppmuntre til vekst av spesifikke mikroorganismer av interesse. Spesielt naive medier som de tre mediene i denne artikkelen er primet for og avhengig av slike modifikasjoner. Eksempler på karbon- og energikilder inkluderer fumarat18, pepton18, celluloseholdig organisk materiale19, acetat20, gjærekstrakt19,20, xylitol (stamme SIUC1), formate (stamme SIUC3) og andre potensielle kilder som H2 / CO2, citrat og glukose. Endelig kan mediumsammensetningen endres avhengig av ønsket studie. For eksempel var hovedinteressen for studien beskrevet i den representative resultatdelen å oppdage hvordan representative undergrunns anaerobe mikroorganismer ville reagere på en unik blandet organisk oppslemming (en oppslemming av maiskolber behandlet av OHD13,14); Dermed inneholdt oppskriften denne karbonkilden i stedet for mer konvensjonelle alternativer. Andre potensielle endringer for spesifikke studier inkluderer tilsetning av plast, syrer og tungmetaller, eller andre xenobiotika for bioremedieringsstudier; tilsetning av gjenstridige karbonpolymerer som cellulose og plast for verdiskapende depolymeriserte produktstudier; og tilsetning av gjødsel og planteavfall for småskala kompost og andre landbruksstudier.

Hvis post-reduktiv analyse av et medium er ønsket, for eksempel målinger av pH, oksidasjonsreduksjonspotensial (ORP) og oppløst oksygen (DO), kan dette oppnås indirekte ved å ofre et representativt antall mediumflasker for å trygt forstå karakteren til den batchen. Ved eksponering av en forseglet mediumflaske for luft, anbefales det sterkt at ORP- og DO-avlesninger tas under 1 min ved åpning. Ikke-oksygenavhengige målinger (f.eks. pH) kan tas umiddelbart etter den første åpningen. Kresne anaerobe mikroorganismer krever vanligvis ORP-verdier < -200 mV for vekst. Hvis mediet resulterer i en ORP-verdi på > -200 mV og / eller DO-verdier >0,40 mg / L, kan ytterligere Na2S (0,1-0,2 g / L) eller et annet reduksjonsmiddel (f.eks. titancitrat, L-cystein, askorbinsyre) brukes til å redusere mediet ytterligere.

Resazurin brukes ofte som oksygenindikator (som i denne protokollen); Imidlertid er det mer nøyaktig en redoksindikator21, som indikerer tilstedeværelsen av oksygen indirekte ettersom oksygenet endrer redokspotensialet til en løsning. Resazurin i oppløsning vises i utgangspunktet blå i fargen. Ved eksponering for reduksjonsmidler skifter løsningen irreversibelt til en rosa farge. Når løsningen reduseres ytterligere, skifter den reversibelt til fargeløs og går tilbake til rosa ved oksidering. Forfatterne har observert tilfeller der reduserte medier som inneholder resazurin skiftet fra blått til rosa, men ikke klarte å skifte til fargeløs. Forfatterne har imidlertid også observert at slike medier ofte skifter til fargeløse etter autoklavering, og at økt tid brukt på koking og spyling av media generelt tillater resazurin å skifte til sin fargeløse form etter tilsetning av reduksjonsmidler. Om ønskelig kan konsentrasjonen av oksygen i mediet verifiseres med en sonde for oppløst oksygen.

Alle materialer som trengs for å kjøre disse bioreaktorene og de skreddersydde glassbioreaktorene selv, oversteg ikke ~ $ 5K (dette forutsetter at støtteutstyr allerede er tilgjengelig, for eksempel vannbad, pumper og inkubatorer). Disse anaerobe dyrkingsteknikkene er økonomisk vennlige, sammenlignet med kommersielle automatiserte bioreaktorer som kan starte på > $ 10K. I tillegg bytter mange kommersielle bioreaktorer til engangsreaktorbeholdere, noe som endrer sammenligningsdynamikken og ikke er kostnadseffektivt for mindre forskningslaboratorier / universiteter å kontinuerlig erstatte. I tillegg kan kommersielle systemer ha produksjonskjemiske skjevheter (fra plasten som brukes, fett på pakninger / beslag eller kjemisk behandlet vann) som vil påvirke suksessen til å dyrke raske mikroorganismer. Den lave kostnaden, tilpassbarheten og allsidigheten til å samle en anaerob miljøprøve, i kombinasjon med et informert medium som kan inokuleres, noe som resulterer i å generere anrikninger for studier, øker sjansene for å anskaffe unike mikroorganismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å anerkjenne avstamningen av informasjon og mentorskap som har påvirket / utviklet disse teknikkene gjennom årene. Dr. Hamilton-Brehm som tidligere kandidatstudent, postdoktor og nåværende professor skylder en takknemlighetsgjeld til de som tok seg tid til å undervise i anaerobe teknikker: Dr. Mike Adams, Dr. Gerti Schut, Dr. Jim Elkins, Dr. Mircea Podar, Dr. Duane Moser og Dr. Brian Hedlund. Nature Conservancy og American støttet dette arbeidet gjennom tilskudd G21-026-CON-P og AR-CE21GOS373, henholdsvis. Eventuelle meninger, funn, konklusjoner eller anbefalinger uttrykt i denne artikkelen er forfatternes og gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene til Nature Conservancy eller American. Dette arbeidet ble støttet av et tilskudd fra SIU Advanced Energy Institute, som takknemlig anerkjenner finansiering tildelt gjennom Advanced Energy Resource Board. NGS ble utført av LC Sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
General Materials
1 L borosillicate bottle Fisher Scientific
1 mL syringe with slip tip Fisher Scientific
10 mL glass pipette Fisher Scientific
100 mL culture bottle Fisher Scientifc
20 mm hand crimper Fisher Scientifc
23 G needle Fisher Scientifc
500 mL borosilicate bottle Fisher Scientific
Aluminum seal Fisher Scientifc
Cannula, 31.5 cm length Fisher Scientific
Cannula, 6 cm length Fisher Scientifc
Corer Giddings Machine Company  Assembled from company parts
Gas manifold Swagelok Assembled from many different parts
Lighter Lowe's
N2 gas Airgas
Nitrile gloves Fisher Scientific
Rubber stopper (for GL45 bottles) Glasgeratebau OCHS
Rubber stopper (for culture bottles) Ace Glass
Stirring hot plate Corning
Trace minerals ATCC
Vitamins ATCC
Bioreactor-specific Materials
#10 rubber stopper Ace Glass
#7 rubber stopper Fisher Scientifc
1 mL syringe with luer lock tip Fisher Scientifc
1/4" hose barb ball valve Amazon
10 mL syringe with luer lock tip Fisher Scientifc
3.5 L borosilicate bottle Fisher Scientific
5/16" - 1/4" hose barb adapter fitting Amazon
60 mL syringe with luer lock tip Fisher Scientifc
8 L borosillicate carboy Allen Glass
Angled hose connector for GL14 open top cap Ace Glass 7623-20
Balloon Party City
Borosillicate bioreactor Allen Scientific Glass Custom made upon request
Drill Lowe's
Female luer lock adapter coupler Amazon
GL14 open top cap Ace Glass 7621-04
GL18 open top cap Ace Glass 7621-08
GL45 open top cap Ace Glass
PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap Ace Glass 7625-06
PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap Ace Glass 7625-07
Ring stand Fisher Scientific
Ring stand chain clamp Amazon
Ring stand clamp Fisher Scientific
Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od Grainger 55YG13
Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od Grainger
Straight hose connector for GL14 open top cap Ace Glass 7623-22
Three-way stopcock Amazon
Two-way stopcock Amazon
Ultra low flow variable flow mini-pump VWR
Water bath Fisher Scientifc
White rubber septum for 13-18 mm od tubes Ace Glass 9096-49
Wire Lowe's
Zip tie Lowe's

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Staley, J. T., Konopka, A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).
  2. Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes. MSystems. 3 (5), e00055 (2018).
  3. Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
  4. Marcy, Y., et al. Dissecting biological "dark matter" with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).
  5. Giovannoni, S., Stingl, U. The importance of culturing bacterioplankton in the'omics' age. Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).
  6. Stewart, E. J. Growing unculturable bacteria. J. Bacteriol. 194 (16), 4151-4160 (2012).
  7. Dedysh, S. N. Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps. Front. Microbiol. 2, 184 (2011).
  8. Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. Isolating" uncultivable" microorganisms in pure culture in a simulated natural environment. Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).
  9. Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012 (2011).
  10. Tyson, G. W., et al. Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community. Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).
  11. Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).
  12. Merino, N., et al. Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow. Sci. Total Environ. 842, 156768 (2022).
  13. Anderson, K. B., Creeping, J. C., Huggett, W. W. Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791. , Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf (2013).
  14. Anderson, K. B., Crelling, J. C., Huggett, W. W., Perry, D. M. Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512. , Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf (2018).
  15. Mullin, S. W., et al. Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer. Front. Microbiol. 11, 536535 (2020).
  16. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).
  17. Miller, T. L., Wolin, M. A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes. Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).
  18. Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin. Front. Microbiol. 10, 2224 (2019).
  19. Hamilton-Brehm, S. D., et al. Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).
  20. Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).
  21. Twigg, R. S. Oxidation-reduction aspects of resazurin. Nature. 155 (3935), 401-402 (1945).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 203
Et sett med <em>in situ-informerte</em> simulerte mediumformater for dyrking av miljøervervede anaerobe mikroorganismer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zimmerman, T., Leamon, G.,… More

Zimmerman, T., Leamon, G., Dillenburg, G., Egge, B., Pierce, J., Elliott, B., Murphy, T., Brooks, M., Hamilton-Brehm, S. D. A Set of In Situ Informed Simulated Medium Formats for Culturing Environmentally Acquired Anaerobic Microorganisms. J. Vis. Exp. (203), e66228, doi:10.3791/66228 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter