Summary
Fokus for dette papir er at detaljere bedste praksis for fremstilling af medier til hurtige anaerobe mikroorganismer erhvervet fra et miljø. Disse metoder hjælper med at håndtere anaerobe kulturer og kan anvendes til at understøtte væksten af undvigende udyrkede mikroorganismer, det "mikrobielle mørke stof".
Abstract
Kulturafhængig forskning af anaerobe mikroorganismer hviler på metodologisk kompetence. Disse metoder skal skabe og opretholde passende vækstbetingelser (f.eks. pH- og kulstofkilder) for anaerobe mikroorganismer, samtidig med at prøverne kan ekstraheres uden at bringe det kunstige miljø i fare. Til dette formål kan metoder, der informeres af og simulerer et in situ-miljø , være til stor hjælp ved dyrkning af mikroorganismer fra dette miljø. Her skitserer vi en in situ informeret og simuleret anaerob metode til dyrkning af jordbaserede overflade- og undergrundsmikroorganismer med vægt på anaerob prøveindsamling med minimal forstyrrelse. Denne protokol beskriver produktionen af et tilpasseligt anaerob flydende medium og miljøerhvervelsen og in vitro-væksten af anaerobe mikroorganismer. Protokollen dækker også kritiske komponenter i en anaerob bioreaktor, der anvendes til miljøsimuleringer af sedimenter og anaerobe flydende medier til miljømæssigt erhvervede kulturer. Vi har inkluderet foreløbige Next Generation Sequencing data fra et vedligeholdt mikrobiom over levetiden for en bioreaktor, hvor den aktive kultur dynamisk justeres som reaktion på en eksperimentel kulstofkilde.
Introduction
De fleste mikroorganismer forbliver ukultiverede; Dette understøttes af den store forskel mellem celler observeret gennem mikroskopi i modsætning til de få mikroorganismer, der med succes dyrkes ved hjælp af agarplader. Staley og Konopka kaldte denne forskel for "Great Plate Count Anomaly"1. Den estimerede ikke-regnskabsmæssige mangfoldighed understøttes af metagenomiske og metatranskriptomiske data, der viser mange nye slægter fordelt i rangtæthedskurver fra flere forskellige miljøer2. Mikroorganismer, der er blevet observeret (generelt ved tilfældig haglgeværsekventering af et mikrobielt samfund), men som ikke er blevet dyrket, er blevet omtalt som "mikrobielt mørkt stof"3,4.
I en alder af -omics er dyrkning af mikroorganismer fortsat afgørende for fuldt ud at evaluere genomiske data og verificere funktionen / fænotypen af tilstedeværende gener. Sekventering af dyrkede mikroorganismer er stadig den eneste måde at opnå komplette genomer på, indtil teknologier som shotgun-metagenomics og metagenom-samlede genomer fra miljøet bliver tilladeligt ufejlbarlige5. Genomiske evalueringer kombineret med dyrkede mikroorganismer giver stærke slutninger til forståelse af "mikrobielt mørkt stof". Mange medlemmer af det "mikrobielle mørke stof" udfører afgørende funktioner, der påvirker kredsløbet af næringsstoffer og andre elementer og produktionen af værdifulde naturlige produkter, understøtter økologiske systemer og udfører økologiske tjenester. Fra et medicinsk perspektiv er omkring halvdelen af alle lægemidler, der markedsføres i dag, produkter og derivater af produkter fra bakterier, og profilering af udyrkede arter mistænkes for at afsløre fremtidens antibiotika. For at få adgang til dette ukultiverede flertal skal en række dyrkningsmetoder øges6. Blandt medlemmerne af det "mikrobielle mørke stof" er anaerobe oligotrofe mikroorganismer stort set underrapporterede og har sandsynligvis økologisk og industrielt værdifulde biokemiske veje7, hvilket gør dem til vigtige mål for dyrkning. Anaerobe oligotrofe mikroorganismer er imidlertid vanskeligere at dyrke end deres aerobe og copiotrofe modstykker på grund af ofte krævede længere inkubationstider, kræsne forhold (f.eks. Særlige ikke-standardiserede in vitro-temperaturer ) og brugen af specialiserede medieopskrifter.
Nuværende udviklingsteknikker til dyrkning af medlemmer af det "mikrobielle mørke stof", herunder nye anaerobe oligotrofe mikroorganismer, har i høj grad forbedret vores forståelse og øget repræsentationen af disse mikroorganismer i det fylogenetiske træ. Nuværende teknikker, der anvender informerede medier til dyrkning af nye mikroorganismer (dvs. medier, der er afledt ved hjælp af viden om den eller de pågældende mikroorganismer), kan opdeles i tre forskellige metoder. Den første af metoderne indebærer direkte fjernelse af en diskret del af miljøet til overførsel til et in vitro vækstkammer, der allerede indeholder mikroorganismer af interesse i en membran. Den diskrete sektion (f.eks. Havvand) virker for at give mikroorganismerne af interesse det geokemiske habitat, de bruger in situ, mens membranen arresterer bevægelsen af celler på tværs (celler af interesse forbliver indeni; fremmede celler, der ankom med den diskrete sektion, forbliver uden). Ved at inkludere forbindelser, der er naturligt tilgængelige for målmikroorganismer, i deres naturlige habitat, kan sådanne mikroorganismer dyrkes8. Den anden metode anvender metatranskriptomics eller genomics til at belyse metaboliske evner, hvilket giver spor til at indsnævre dyrkningsparametre for et målrettet mediumdesign. Denne tilgang giver en øko-fysiologisk profil, der kan bruges til at målrette berigelsen af specifikke typer mikroorganismer ud af et miljø. Mediets bestemmelser er taget højde for de identificerede gener, der er til stede, og som formodes at understøtte målmikroorganismen (-erne) for at reducere berigelsesdiversiteten,9,10. En advarsel er, at genomisk information ikke direkte udleder ekspressionen af gener, mens transkriptomisk information gør det.
Den tredje metode omfatter miljøinformerede og simulerede medier, der adskiller sig fra den første metode, som ikke simulerer medierne, men snarere bruger miljøet direkte som mediekilde. Denne tredje metode kræver miljømæssig rekognoscering af geokemien på et feltsted, der indeholder mikroorganismer af interesse. Med denne viden identificeres primære komponenter og fysiske parametre for at producere et miljøinformeret simuleret medium. Mediet modtager derefter en direkte infusion af mikroorganismeholdigt sediment eller væske fra miljøet til mediet. Denne metode er af særlig værdi i tilfælde, hvor den dyrkende mikrobiolog ikke har adgang til tilstrækkelige mængder kildemiljø (som nødvendigt for den første metode) eller passende metatranskriptomiske eller genomiske data (som nødvendigt for den anden).
Følgende protokol er et eksempel på den tredje metode; Det er informeret af og sigter mod at simulere miljøer af interesse. Tre naive medieopskrifter rettet mod forskellige anaerobe mikroorganismekulturer erhvervet i marken præsenteres parallelt inden for protokollen. De tre kulturer, der er repræsenteret, er blandingskulturer, der stammer fra jord (i det følgende benævnt jordblandingskultur), blandingskulturer, der stammer fra et borehul (i det følgende benævnt blandet borehulskultur), og et isoleret metanogen, der stammer fra et borehul (i det følgende benævnt "borehulsisoleret metanogen"). De sammensatte identiteter og mængder i medieopskrifterne, der deles her, er ment som en begyndelsesvejledning; De er i stand til og opfordres til at blive tilpasset læserens miljø og mikroorganismer af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Produktion af tilpasseligt anaerob flydende medium
- Medium til kulturflasker (produktion af 500 ml)
- Mål og tilsæt forbindelser til en 1 L flaske og juster pH ved hjælp af kolonnen i tabel 1 svarende til læserens interessekultur (mængderne i tabel 1 registreres for produktion på 1.000 ml, juster i overensstemmelse hermed). Bland forbindelser til homogenitet ved at hvirvle flasken.
- Opvarm væsken til kogning ved at mikrobølgeovn flasken i 5-6 min. Åbn mikrobølgeovnen ofte, og hvirvl forsigtigt væsken med en varmebestandig handske. Åbn mikrobølgeovnen hurtigt, hvis væsken går stille efter boblende; Ellers kan væsken hurtigt ekspandere og overløb flasken.
- Fastgør en steril 10 ml glaspipette til en N2 gasmanifoldopsætning (baseret på designet af Balch et al.11, men kræver ikke en opvarmet kobbersøjle til N2 renhedsgas; se supplerende fil 1 for flere oplysninger om gasmanifold). Åbn manifolden for at udlufteO2 , og ladN2-gassen strømme ud.
- Anbring pipettespidsen i væsken, og juster gasstrømmen, så boblerne er moderat kraftige. Skyl væsken medN2 , indtil flasken ikke længere er for varm til at røre ved.
BEMÆRK: Dette afhænger af mediets indhold, men tager generelt ~20 min. - Mens du venter på, at flasken er afkølet, skal du sætte 10 sterile 100 ml kulturflasker ud; eller, hvis der fremstilles medier til opsamling af jordblandingskultur, anbringes to sterile 500 ml flasker.
- Når medieflasken er kølig at røre ved, skal du trække pipettespidsen op i flaskens headspace. Der tilsættes 0,125 g NaHCO3 og 0,300 gNa2S∙9H2O, og vent, indtil resazurin bliver farveløst.
FORSIGTIG: Na2S∙9 H2O er ætsende, giftig og irriterende. Brug personlige værnemidler, når du håndterer og skyller metalværktøj grundigt efter kontakt. - Mens du venter på, at resazurin skifter farve, skal du fastgøre metalkanyler til gasmanifoldopsætningen og placere kanylespidserne i kulturflasker. Juster strømmen afN2 ind i flaskerne til en moderat hastighed, så væsken, der tilsættes i det efterfølgende trin, ikke suser rundt på grund af gasstrømmen.
- Når resazurin er farveløs, alikvote 50 ml væske i hver kulturflaske eller 250 ml væske i hver 500 ml flaske.
- Hætte hver flaske med en matchende gummiprop umiddelbart efter fjernelse af kanylerne. Fastgør proppen med en aluminiumsforsegling (til kulturflasker) eller et GL45 skruelåg med åben top (til 500 ml flasker).
- Læg flaskerne i en autoklaverbar skraldespand, og fyld beholderen med postevand, indtil vandstanden svarer til vandstanden i flaskerne.
BEMÆRK: Dette sikrer, at flaskerne ikke brister på grund af stress forårsaget af temperaturforskelle på glasset under autoklavering. - Autoklave flaskerne ved 121 °C i 30 min.
- Medium til bioreaktor (produktion af 8 L)
- Forberedelse af carboy
- Åbn ventilen på en 1/4" (6,4 mm) slangemodhagekugleventil. Fastgør to 6 cm længder på 1/4" (6,4 mm) indvendig diameter (ID) og 1/2" (12,7 mm) udvendig diameter (OD) silikoneslange på hver ende af slangens modhagekugleventil.
- Fastgør til den ene ende af enheden en 5/16 "-1/4" (7,9 mm-6,4 mm) slangemodhageadapter. Fastgør den anden ende af enheden til slangemodhagen på en 8 L carboy.
- Brug en lynlås til at sikre forbindelsen mellem carboyens slangemodhager og slangen og forbindelsen mellem slangemodhageadapterbeslaget og slangen.
- Autoklave carboy med samling ved 121 °C i 30 min.
- Mellem produktion
- Luk ventilen på slangens modhagekugleventil på 8 L carboy-enheden.
- Mål og tilsæt forbindelser til 8 L carboy og juster pH ved hjælp af kolonnen i tabel 1 svarende til læserens interessekultur (mængder i tabel 1 registreres for produktion på 1.000 ml, juster i overensstemmelse hermed). Tilsæt en omrøringsstang og brug en omrøringsvarmeplade til at blande forbindelserne til homogenitet.
- Opvarm væsken til kogning med den omrørende kogeplade. Lad væsken koge i 30 min.
BEMÆRK: Opvarmning af væsken til kogning afhænger af mediets indhold, men kan tage 2-3 timer. - Fastgør en steril 10 ml glaspipette til en N2 gasmanifoldopsætning (baseret på designet af Balch et al.11, men kræver ikke en opvarmet kobbersøjle til N2 renhedsgas; se supplerende fil 1 for flere oplysninger om gasmanifold). Åbn manifolden for at udlufteO2 , og ladN2-gassen strømme ud.
- Sluk for varmen, anbring derefter pipettespidsen i væsken, og juster gasstrømmen, så boblerne er moderat kraftige, men ikke overfyldte. Skyl væsken med N2 i 30 min.
- Træk pipettespidsen op i bildrengens headspace. Tilsæt 2,0 g NaHCO3 og 4,8 gNa2S∙9H2O, og vent, indtil resazurin bliver farveløs.
FORSIGTIG: Na2S∙9 H2O er ætsende, giftig og irriterende. Brug personlige værnemidler, når du håndterer og skyller metalværktøj grundigt efter kontakt. - Når resazurin er farveløs, skal du fjerne glaspipetten og straks dække carboyen med en #10 prop. Drej en ledning over proppen og rundt om carboyens læbe for at fastgøre proppen.
- Forberedelse af carboy
2. In situ-erhvervelse af anaerobe mikroorganismer i miljøet
- Indsamling af anaerobe prøver på overfladen (jordblandingskultur)
- Medbring flasken / flaskerne med blandede jordkulturmedier fremstillet som ovenfor og en corer i marken.
BEMÆRK: En Giddings 2 5/8" standard konisk jordbit bruges af forfatterne (materialetabel). Enhver jordkorer eller murske, der kan prøve til den ønskede dybde, kan dog anvendes. - Koreren skubbes ind i sedimentet, indtil toppen af prøveopsamlingscylinderen flugter med sedimentets overflade.
- Drej coreren 90° for at frigøre kernen, og træk opad, indtil prøven er ekstraheret fra miljøet.
- I løse sedimenter (som f.eks. hvad der kan opstå ved prøveudtagning af vådområder) skal du dække bunden af kernen med en ny nitrilhandskehånd, mens den ekstraheres for at forhindre, at prøven falder ud eller spredes i vandet ved ekstraktion.
- Tilnærm hurtigt med øjet 6-7 cm op fra bunden af kernen. Brug en ny nitrilhandskehånd til at skære ind i kernen og adskille bunden 6-7 cm.
- Overfør straks bunden af kernen til kulturflasken. Hvis jorden / sedimentet er for stort, skal du hurtigt forme det til at passe lettere ind i flasken, hvilket minimerer eksponeringen for den aerobe atmosfære så meget som muligt.
- Når prøven er overført, skal du straks sætte proppen på plads igen og holde den på plads med et skruelåg.
- Hold prøven kølig. Opsamlingsflasken opbevares i køleskab ved 4 °C, når den returneres til laboratoriet.
- Medbring flasken / flaskerne med blandede jordkulturmedier fremstillet som ovenfor og en corer i marken.
- Anaerob prøvetagning under overfladen (boringshulsblandingskultur)
- Sæt en steril 1 L flaske ud ved gasmanifolden. Sæt flasken på hætten med en gummiprop. Dryp 100% ethanol på proppen og sæt den i brand ved hjælp af en lighter.
- Sæt en steril 23 G kanyle på N 2-gasmanifoldopsætningen. Åbn manifolden for at udlufteO2, og ladN2 (eller Ar) gas strømme ud med moderat hastighed.
- Når proppen ikke længere brænder, skal du stikke kanylen ind i flasken. Stik endnu en steril 23 G kanyle, der ikke er fastgjort til gasmanifolden, ind i flasken. Skyl flasken i 1-2 min.
- Udtræk nålen, der ikke er fastgjort til gasmanifolden. Tryk på flasken i 1 min. Udtræk den resterende nål.
- Bring trykflasken og en steriliseret 23 G nål til borehullet. Der trækkes væske op fra borehullet efter metoderne i Merino et al.12.
BEMÆRK: Afhængigt af borehullets metode, tilslutning og strømningshastighed ændrer dette strategien for at erhverve en vandprøve. Hvis der er en kontinuerlig vandstrøm, opsamling af vand som beskrevet i trin 2.2.6. vil være tilstrækkeligt. Hvis vandstrømmen er batchopsamlet eller lavt flow, kan der anvendes en alternativ indløbs-/udløbsmetode. I alle situationer skal kontaminering minimeres, og det skal sikres, at den indsamlede prøve er repræsentativ for det miljø, der ønskes udtaget. Dette er en bredt generaliseret erklæring, fordi det har været forfatternes erfaring, at enhver prøveindsamlingsbegivenhed fra offentlige eller private websteder skulle være meget tilpasningsdygtig til den tilgængelige tilgængelighed. - Åbn hurtigt flasken, pump væske ind for at fylde flasken helt, og luk flasken.
- Indsæt 23 G nålen, der blev bragt med til stedet, i flaskens gummiprop for at lette trykket i flasken. Udtræk nålen.
- Hold prøven kølig. Opsamlingsflasken opbevares i køleskab ved 4 °C, når den returneres til laboratoriet.
3. In vitro-vækst af anaerobe mikroorganismer erhvervet i marken
- Vækst efter kulturflaske
- Der anbringes en steril flaske med prop med N2 og kulturflaskerne og opsamlingsflasken tilberedt som ovenfor. Dryp 100% ethanol på propperne og sæt dem i brand ved hjælp af en lighter.
- Saml en 23 G kanyle på en 1 ml sprøjte. Når propperne ikke længere brænder, skal nålen stikke nålen ind i N2-flasken og trække ~ 1 ml N2 op. Udtræk nålen.
- Tryk langsomt ned på stemplet for at udløse N2. Så snart sprøjten er tom, indsættes kanylen i opsamlingsflasken, og 0,5 ml af miljøprøven trækkes op. Udtræk nålen.
- Stik kanylen ind i kulturflasken og injicer prøven. Udtræk nålen.
- Drej flasken rundt og anbring den i en inkubator ved temperatur, som oplyst af tabel 1 eller læserens miljø af interesse.
BEMÆRK: Kulturfremskridt (enten flaske eller bioreaktor) overvåges ved hjælp af et 0,02 mm dybt Petroff-Hauser-hæmocytometer. Berigelser af anaerobe eller kræsne mikroorganismer når typisk ikke celletætheder, hvor OD600 er anvendelig, og andre detektionsmetoder er upraktiske til rutinemæssig og gentagen overvågning. Registreringsgrænser, kvalitetskontrol og statistiske beregninger afhænger af typen af celletællingskammer og brugerens behov.
- Vækst efter bioreaktor
- Forberedelse af en ballon med en modificeret sprøjte
- Fjern stemplet fra tre 10 ml luer lock sprøjter (en til hver slutsamling). Skær flangen af hver sprøjte og fil den afskårne ende, så den ikke gennemborer ballonerne. Rens alle arkiverede chips ud af den modificerede sprøjte.
- Forbered en fordoblet ballon ved at placere en ballon inde i en anden.
- Stræk enden af den fordoblede ballon over den modificerede 10 ml sprøjte.
- Adskil enden af den ydre ballon lidt fra den indre ballon. Klem al luften fanget mellem ballonerne ud.
- Stram et lynlåsbånd omkring bunden af ballonerne for at fastgøre ballonerne til sprøjten.
- Fremstilling af en modificeret prop
- Fjern stemplerne fra ti 1 ml luer lock sprøjter (to for hver prop, der skal ændres). Skær flangen af sprøjterne.
- Sæt to gummipropper størrelse #10 (til 8 L carboys) og tre størrelser til flasker med GL45 gevindfinish (til fangstflasker). Brug et 1/4" (6,4 mm) bor du to huller gennem toppen af hver gummiprop, der er bred nok til, at de modificerede sprøjter kan passe, og smalle nok til, at pasformen er lufttæt.
- Indsæt de modificerede sprøjter gennem hullerne i gummiproppen.
- Rengør og autoklav den modificerede prop ved 121 °C i 30 minutter.
- Forberedelse af bioreaktorenheden
- Desinficer med 70% ethanol alle stophaner, hun-luer lock-adapterstik og andre ikke-autoklaverbare bioreaktormaterialer, og autoklave ved 121 °C i 30 minutter alle slanger (efter skæring i længden), propper, glasuld og andre autoklaverbare bioreaktormaterialer.
- Sæt en steril bioreaktor (figur 1 og figur 2) på et ringstativ, og fastgør den med en kæderem. Der er også et vandbad, en peristaltisk pumpe, den stoppede 8 L carboy indeholdende medium (fra protokoltrin 1.2), en 3,5 L flaske (ikke-prøveudtagningsflaske) og en 500 ml flaske (prøveudtagningsflaske).
- Stopper carboy
- Sæt en ballon ud med en modificeret sprøjte. Tilslut en trevejs stophane til sprøjtens luer lock-spids.
- Tag ballonenheden og tilslut trevejs stophanen til slangen på en tank på N2. Drej trevejs stophanen for at blokere enden, der er åben for atmosfæren.
- Åbn gastanken, og fyld ballonen med N2. Når den er fuld, skal du dreje trevejs stophanen for at blokere enden af ballonen. Luk gastanken, og frakobl tankslangen fra trevejs stophanen.
- Tilslut følgende i rækkefølge: en trevejs stophane (af ballonen med den modificerede sprøjte), en tovejs stophane, en kvindelig luer lock adapterkobling og luer lock-spidsen på en af den modificerede props sprøjter.
- Tilslut en tovejs stophane til den anden sprøjtes luerlåsspids. Luk begge ventiler på tovejs stophanerne på den modificerede propenhed.
- Drej ledningen, der holder carboyens umodificerede størrelse #10 prop. Udskift hurtigt den umodificerede prop med den modificerede propenhed, og drej ledningen som før for at fastgøre den modificerede propenhed til carboyen.
BEMÆRK: Hvis den er sikker og klargjort, kan den modificerede propenhed bruges til at stoppe ballonen på det sidste trin af medium forberedelse (trin 1.2.2.7). - Drej trevejs stophanen for at blokere enden, der er åben for atmosfæren. Åbn tovejs stophanen i rækkefølge. Ballonens gas og hovedrummet på 8 L carboy er nu forbundet.
- Standsning af ikke-prøveudtagnings- og prøveudtagningsflasken
- Dæk den 3,5 L ikke-prøvetagningsopsamlingsflaske med en modificeret propstørrelse til flasker med GL45-gevindfinish, og påfør 70% ethanol på bunden af proppen for at hjælpe med at passe den ind i flasken. Overtræk flasken med et GL45 skruelåg med åben top.
- Tilslut følgende i rækkefølge: en ballon med den modificerede sprøjtes luer lock-spids, en trevejs stophane, en kvindelig luer lock-adapterkobling og luer-låsespidsen på en af den modificerede props sprøjter. Drej trevejs stophanen for at blokere enden, der er åben direkte til atmosfæren.
- Tilslut en kvindelig luer lock-adapter til den anden sprøjtes luer lock-spids.
- Gentag ovenstående tre trin for 500 ml prøvetagningsflasken.
- Opsætning af slanger
- Mål afstanden mellem bioreaktorens vandkappeporte og vandbadsslangens modhager. Skær to længder af 3/16" (4,8 mm) ID, 3/8" (9,5 mm) OD silikoneslange for at spænde over denne afstand.
- Saml to lige slangestik med GL14 skruelåg med åben top. Fastgør hver til den ene ende af de to slangestykker.
- Drej skruelågene på portene på bioreaktorens vandkappe. Fastgør de andre ender af slangen til vandbadsslangens modhager, så vandet strømmer ud af vandbadet, gå ind i bunden af bioreaktorens vandkappe, gå ud øverst på vandkappen og vend tilbage til vandbadet. Stram lynlåsbåndene rundt om enderne af slangen for at fastgøre slangen til vandbadsslangens modhager.
- For pumper, der ligner VWR Ultra Low Flow Variable Flow Mini-Pump, skal du trække den medfølgende 3/16" (4,8 mm) OD-slidslange gennem pumpen.
- Mål afstanden mellem carboyslangeenheden og den peristaltiske pumpeslangeenhed. Skær en længde på 3/16" (4,8 mm) ID, 3/8" (9,5 mm) OD silikoneslange for at spænde over denne afstand.
- Fastgør den ene ende af slangen til slangemodhagen på carboyslangeenheden og den anden til slangemodhagen på den peristaltiske pumpeslangeenhed, orienteret således, at mediet strømmer fra carboy og gennem den peristaltiske pumpe.
- Mål afstanden mellem den peristaltiske pumpeslangeenhed og bioreaktorens nederste port. Skær en længde på 3/16" (4,8 mm) ID, 3/8" (9,5 mm) OD silikoneslange for at spænde over denne afstand.
- Fastgør den ene ende af denne slange til slangemodhagen i den peristaltiske pumpeslangeenhed, og fastgør forsigtigt den anden til bioreaktorens nederste port. Pas på ikke at revne glasset, men også for at sikre forbindelsen, stram en lynlås rundt om enden af slangen for at fastgøre slangen til bioreaktorens nederste port.
- Mål og skær ca. 5" (127mm) længde på 3/16" (4,8 mm) ID, 3/8" (9,5 mm) OD silikone slange.
- Fastgør et hun-luer lock-adapterstik til en trevejs stophane. Fastgør enhver ende af trevejs stophanen til slangen.
- Saml et vinklet slangestik med GL14 skruelåg med åben top. Fastgør den til den anden ende af slangen.
- Drej skruelåget på bioreaktorens øverste lodrette port. Drej trevejs stophanen for at blokere enden, der peger på bioreaktoren.
- Mål afstanden mellem den øverste lodrette portenhed og den ikke-prøveudtagningsflaskeenhed. Skær en længde på 3/16" (4,8 mm) ID, 3/8" (9,5 mm) OD silikoneslange for at spænde over denne afstand. Skær flangerne af to 1 ml luer lock sprøjter og sæt dem i enderne af slangen.
- Fastgør den ene ende af denne slangeenhed til trevejs stophanen på den øverste lodrette portenhed, og fastgør den anden ende til hunluerlåsadapterstikket på den ikke-prøveudtagningsflaskeenhed.
- Mål afstanden mellem den øverste lodrette portenhed og prøvetagningsflaskeenheden. Skær en længde på 3/16" (4,8 mm) ID, 3/8" (9,5 mm) OD silikoneslange for at spænde over denne afstand. Skær flangerne af to 1 ml luer lock sprøjter og sæt dem i enderne af slangen.
- Fastgør den ene ende af denne slangeenhed til trevejs stophanen på den øverste lodrette portenhed, og fastgør den anden til hunluerlåsadapterstikket på prøveudtagningsflaskeenheden.
- Påfyldning af bioreaktoren
- Dæk en af bioreaktorens GL18-porte med en hvid gummiskillevæg. Sæt låg på den anden GL18-port og de resterende lodrette eksponerede GL14-porte med PTFE-septa i GL18/GL14-størrelse (PTFE vendt mod glasset) og skruelåg med åben top.
- Med en 50 cm lang stang pakkes 0,9 g glasuld i bunden af bioreaktoren.
- Autoklave 1,3 L sand ved 121 °C i 30 min. Fyld bioreaktoren med sandet ved hjælp af en tragt.
BEMÆRK: Andre sedimenttyper informeret af læserens miljø og mikroorganismer af interesse kan erstattes her. - Placer slangen til en tank med N2 i toppen af bioreaktoren, og skyl bioreaktorens hovedrum med N2 i 2 minutter. Sæt straks låg på bioreaktoren med en prop i #7-størrelse og et GL45 skruelåg med åben top.
- Fra den ikke-prøveudtagningsflaske skal du frakoble slangen og dreje trevejs stophanen for at blokere enden, der peger på ballonen. Tilslut slangen til en tank med N2 til hunluer lock-adapterstikket, og skyl bioreaktorens headspace med N2 i 2 minutter. Tilslut straks slangen igen, og returner trevejs stophanen for at blokere enden, der er åben for atmosfæren.
- Gentag ovenstående trin for prøvetagningsflasken.
- Drej trevejs stophanen på bioreaktorens øverste lodrette port for at blokere den ende, der peger på prøvetagningsflasken. Pump væske fra carboy ind i bioreaktoren. Sæt pumpen på pause, og udluft prøvetagningsflaskens ballon, og fyld carboyens ballon med N2 efter behov.
- Når bioreaktoren er fyldt med mediet, indstilles pumpens flowhastighed til 0,6 ml/min (digital værdi på 40 på minipumpen).
BEMÆRK: Andre læserønskede strømningshastigheder kan erstattes her. - Indstil vandbadstemperaturen som oplyst i tabel 1 eller læserens miljø af interesse.
BEMÆRK: Inokulum kan tilføjes på dette tidspunkt eller senere, afhængigt af undersøgelsens specifikationer. Hvis der podes på dette tidspunkt, fortsættes til trin 3.2.4.10. Hvis der podes senere, fortsættes til trin 3.2.5. - Der stilles en opsamlingsflaske eller podet kulturflaske og en steril flaske med prop med N2 frem. Dryp 100% ethanol på propperne og sæt dem i brand ved hjælp af en lighter.
- Saml en 23 G kanyle på en 60 ml sprøjte. Når propperne ikke længere brænder, skal nålen indsættes i N 2-flasken og trækkes op ~ 50 ml N2. Udtræk nålen.
- Tryk langsomt ned på stemplet for at udløse N2. Så snart sprøjten er tom, stikkes kanylen ind i opsamlingsflasken, og 50 ml af miljøprøven trækkes op. Udtræk nålen.
- Udskift 23 G nålen med en steril lang metalnål (kanyle, længde 31,5 cm). Indsæt den lange metalnål gennem den hvide gummiskillevæg på bioreaktorens GL18-port.
- Skub nålen ind i sedimentet og injicer podningen. Udtræk nålen.
- Drift af vedligeholdelse af bioreaktorer
- Hver dag, hvor bioreaktoren kører, skal du udføre følgende:
- Kontroller vandbadniveauet. Hvis det er lavt, skal du tilføje mere vand (brug destilleret vand til udstyrets levetid ved at reducere korrosion og mineralopbygning).
- Kontroller ballonen på den ikke-prøveudtagningsflaske; En fuld ballon vil hæmme mediets strømning. Når den er fuld, skal du dreje trevejs stophanen for at blokere enden, der peger på fangstflasken. Klem ballonen for at tømme den; returner derefter trevejs stophanen for at blokere enden, der er åben for atmosfæren; Gentag, indtil ballonen er tom.
- Kontroller ballonen på 8 L carboy. Hvis den er lav, skal du lukke tovejsstophanen i rækkefølge og frakoble trevejsstophanen fra tovejsstophanen. Ballonenheden fyldes op igen, og den sættes på igen ved at følge trin 3.2.3.3.2, 3.2.3.3.3 og 3.2.3.3.7.
- Kontroller mediets niveau i 8 L carboy. Hvis det er lavt, skal du samle en anden 8 L carboy og forberede mere medium efter protokoltrin 1.2. og 3.2.3.3. Sæt pumpen på pause, luk slangens modhagekugleventil, frakobl hurtigt den gamle carboy, og tilslut den nye carboy.
BEMÆRK: For en strømningshastighed på 0,6 ml / min er der behov for nyt medium hver 9. dag. - Kontroller niveauet af substratet i den ikke-prøveudtagningsflaske. Hvis den er fuld, samles endnu en ikke-prøveudtagningsflaske, i overensstemmelse med trin 3.2.3.4.1. Skyl den nye flaske med N2, frakobl hurtigt ballonen med den modificerede sprøjte og slange fra den gamle flaske, og tilslut den til den nye flaske.
- Fjern den modificerede prop fra en fuld ikke-prøveudtagningsflaske. Væsken autoklaveres ved 121 °C i 30 minutter; Bortskaf derefter væsken i henhold til læserens institutionelle politikker. Rengør og autoklave alle stykker af den ikke-prøveudtagningsflaskesamling for at forberede dem til næste brug.
- Udfør prøveudtagning hver 7. (eller læserønsket antal) dage ved at gøre følgende:
- Drej trevejs stophanen på bioreaktorens øverste lodrette port for at blokere enden, der peger på den ikke-prøveudtagningsflaske. Opsaml 250 ml væske.
BEMÆRK: For en strømningshastighed på 0,6 ml / min vil opsamling af 250 ml tage ~ 7 timer. - Returner trevejs stophanen på bioreaktorens øverste lodrette port for at blokere enden, der peger på prøvetagningsflasken. Afbryd slangen og prøvetagningsflasken fra trevejs stophanen på bioreaktorens øverste lodrette port.
- Efter testning, opbevaring og/eller korrekt bortskaffelse af prøvetagningsvæske rengøres alle dele af prøvetagningsflasken undtagen ballonen med den modificerede sprøjte. Autoklave alle stykker ved 121 °C i 30 minutter undtagen ballonen med den modificerede sprøjte og kvindelige luer lock-adapterstik. Saml igen til næste prøveudtagningsdag.
BEMÆRK: Det anbefales stærkt at have dobbelt eller tredobbelt redundans af dele, hætter, slanger og septa til hurtig reparation og udskiftning, hvis det er nødvendigt.
- Drej trevejs stophanen på bioreaktorens øverste lodrette port for at blokere enden, der peger på den ikke-prøveudtagningsflaske. Opsaml 250 ml væske.
- Hver dag, hvor bioreaktoren kører, skal du udføre følgende:
- Forberedelse af en ballon med en modificeret sprøjte
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her viser vi resultater fra en bioreaktorundersøgelse ved hjælp af en borehulsblandingskulturmedium forberedelsesmetode og en bioreaktoropsætningsmetode som beskrevet heri. Borehullets blandede kulturmedium blev modificeret til som kulstofkilde at indeholde en opslæmning af majskolber behandlet ved oxidativ hydrotermisk opløsning (OHD)13,14. Modificeret borehulsblandingskulturmedium blev pumpet ind i bioreaktoren i 44 dage med en hastighed på 0,4 ml / min. På dag 23 blev et podemateriale hentet fra borehullet BLM-1 i Death Valley-regionen i Nevada, USA, tilføjet15. Væskeprøver fra bioreaktoren blev opsamlet i en prøvetagningsflaske på dag 1, 8, 15, 22, 23 (efter podning), 30, 37 og 44.
For at spore den generelle status for podekulturen (og præ-inokulum autoklave-overlevende beboere af bioreaktorsedimentet) blev bioreaktorvæskeprøver observeret ved direkte celletællinger. Direkte celletællinger af udtaget væske blev udført med et Petroff-Hauser-hæmocytometer. For at lære identiteten af mikrobielle medlemmer af bioreaktoren blev DNA ekstraheret fra bioreaktorvæskeprøver, og 16S rRNA-generne blev analyseret ved Next Generation Sequencing (NGS). NGS-dataene blev behandlet internt ved hjælp af Mothur efter MiSeq SOP16.
Før podning var direkte celletal ofte under detektionsgrænsen (b.d.l.) på 1,0 × 106 celler / ml. Dag 23 (efter podning) havde et lavt celletal på 2,6 × 106 celler/ml, mens de følgende dage 30, 37 og 44 havde celletal over 1,0 × 107 celler/ml (figur 3). Selvom celletal var b.d.l. på dag 1, 8 og 22, blev DNA ekstraheret for NGS fra hvert tidspunkt, hvilket indikerer en basal tilstedeværelse af præinokulummikroorganismer i sedimentet, selv efter autoklavering. Den vigtigste tilstedeværende slægt (bestemt af antallet af aflæsninger i hver operationel taksonomisk enhed (OTU)) var stabil på dag 8, 15 og 22 og blev identificeret som Geobacillus. Efter podning med BLM-1-inokulum på dag 23 dominerede Geobacillus ikke længere, og nye større slægter opstod sammen med en lang række mindre tilstedeværende slægter, som for det meste opretholdt en tilstedeværelse til slutningen af undersøgelsen (figur 4). Ud fra disse konkluderer vi, at BLM-1-inokulummet var en aktiv og dynamisk skiftende kultur inden for bioreaktoren.
En yderligere undersøgelse af NGS-dataene afslørede medlemmer af det "mikrobielle mørke stof". OTU'er med tildelte taksonomiske navne, der indeholder ordene "uklassificeret" eller "ukultiveret", blev brugt som proxy for OTU'er, der indeholdt medlemmer af det "mikrobielle mørke stof". NGS-data blev indsamlet for dag 44 (den sidste dag efter podning med mikroorganismer fra borehul BLM-1) og filtreret til ikke at indeholde OTU'er, der havde aflæsninger i præpodningsdata (dag 1, 8, 15 eller 22), da disse OTU'er sandsynligvis ikke havde været i podningen. De filtrerede dag 44 NGS-data indeholdt 1.844 OTU'er og 3.396 læsninger. Af disse var 366 OTU'er (20%) og 925 læsninger (27%) uklassificerede på phylum-niveau, og 1252 OTU'er (68%) og 2357 læsninger (69%) var uklassificerede eller udyrkede på slægtsniveau. Selvom det er kortsigtet, understøtter denne pilotundersøgelse potentialet i en bioreaktor med miljøinformerede medier til dyrkning af medlemmer af det "mikrobielle mørke stof".
Figur 1: Skematisk oversigt over specialdesignet borosilikatbioreaktor, der anvendes til anaerob dyrkning. (A) Bioreaktor set fra den ene side. (B) Rotation af A med 90° (med uret) om z-aksen giver udsigten). (C) Et billede set ovenfra af bioreaktoren. Det kappede design giver mulighed for temperaturregulering med vand eller olie. De to jacketporte ses i højre side af udsigten i B. Det indre kammer kan fyldes med sediment af enhver art eller kan efterlades tomt for sediment til planktondyrkning. Tre prøvetagningsporte (set til højre i billedet i A) gør det muligt at fjerne materiale i forskellige dybder af bioreaktorsøjlen. Standard 45, 18 og 14 GL-åbninger kan forsegles ved hjælp af teflon eller butylsepta, der holder en gastæt forsegling i 1-6 måneder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Aktiv bioreaktorsamling. Glasvarer præsenteret på foto fra venstre mod højre er (A) 8 L carboy, (B) bioreaktor (se figur 1) og (C) ikke-prøveudtagningsflaske. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Direkte celletal fra bioreaktorundersøgelse. Mikrobielle populationer i bioreaktoren blev overvåget ved hjælp af et 0,02 mm Petroff-Hauser-hæmocytometercelletællekammer. Inokulum blev tilføjet ved starten af dag 23. Celletal for dag 1, 8 og 22 var under detektionsgrænsen. Den effektive detektionsgrænse for direkte celletælling er 1 × 106 celler/ml. Forkortelse: b.d.l. = under detektionsgrænsen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Bioreaktor næste generations sekventering. OTU'er er repræsenteret i stablede søjlediagrammer, der angiver procentdelen af aflæsninger, der tilhører unikke OTU'er fra hvert tidspunkt i bioreaktorundersøgelsen. Unikke OTU'er blev tildelt deres tilknyttede taksonomi ved en slægtsskæring. Slægt 'Andre' defineres som alle slægter, der er mindre end 10% af læsningerne i hvert tidspunkt. Det samlede antal DNA-aflæsninger, der er repræsenteret, er 506.358. Antallet af læsninger for hvert tidspunkt vises øverst i grafen. Inokulum blev tilføjet ved starten af dag 23. Forkortelse: OTU = Operationel taksonomisk enhed. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Forbindelse | Beløb for jordblandingskultur | Beløb for blandet boringskultur | Beløb for isoleret metanogen isoleret i borehullet |
| Destilleret vand | 1000,0 ml | 1000,0 ml | 1000,0 ml |
| HEPES | 3.600 g | - | - |
| MOPPER | - | - | 2.000 g |
| MgCl2 ∙6H2O | 0,400 g | 0,400 g | 0,400 g |
| KCl | 0,500 g | 0,250 g | 0,500 g |
| NH:4Cl | 0,268 g | 0,268 g | 0,268 g |
| Na2SÅ4 | - | 0,284 g | 1.500 g |
| Na2HPO4 ∙2 H2O | - | - | 0,356 g |
| 1 M KH2PO4 ved pH 6 | 1,0 ml | 1,0 ml | - |
| 1 MH3BO3 ved pH 9,4 | 1,0 ml | 1,0 ml | 1,0 ml |
| Spormineraler | 1,0 ml | - | 1,0 ml |
| Vitaminer | - | - | 1,0 ml |
| 1 mg/ml natriumresazurin | 0,4 ml | 0,3 ml | 0,4 ml |
| pH-justering til | - | 7.0 | 7.0 |
| justering af pH ved | - | NaOH | KOH |
| Inkubationstemperatur | 25 °C | 60 °C | 47 °C |
Tabel 1: Mediernes sammensætning. Liste over forbindelser og fysiske parametre for hvert medium. De præsenterede medier er naive; De indeholder ikke kulstof og energikilder, da disse kan være specifikke for og bør informeres af læserens mikroorganismer og miljø af interesse. Se diskussionsafsnittet for ideer til mulige kulstof- og energikilder.
Supplerende fil 1: Opsætning af gasmanifold. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mellemproduktionsafsnittet i denne protokol (afsnit 1) skylder sin struktur til den modificerede Hungate-teknik fra Miller og Wolin17, som har været meget udbredt siden offentliggørelsen. Det praktiske ved denne udvidede protokol kommer fra dens beskrivende natur og parring med in situ-erhvervelse af mikroorganismer. Kulturflasker indeholdende miljøinformerede og simulerede medier er blevet brugt til succesfuldt at dyrke følgende in situ-erhvervede tidligere medlemmer af det "mikrobielle mørke stof": anaerobe undergrundsbakterier Thermoanaerosceptrum fracticalcis stamme DRI1318, Caldiatribacterium inferamans stamme SIUC1 (tiltrædelsesnummer MT023787; manuskript under udarbejdelse) og Anaerothermus hephaesti stamme SIUC3 (tiltrædelsesnummer MK618647; manuskript under udarbejdelse) og anaerob undergrundsbakterie ukarakteriseret stamme DRI14 (tiltrædelsesnummer KR708540).
Et fokus i denne protokol er, at den er lavet til at være meget tilpasningsdygtig til overflade og undergrund anaerobe miljøer og mikroorganismer. For det første opfordres mediesammensætningen til at blive ændret for at afspejle sammensætningen af det interessante miljø. For eksempel kan 3.000 mg / L NaCl tilsættes til opskriften, når man simulerer et miljø med ionkoncentrationer på 3.000 mg / L for både Na+ og Cl-; eller 650 ml sand og 650 ml skifer kan placeres i bioreaktoren, når man simulerer et miljø med et 1: 1 volumenforhold mellem sandsten og skifer. For det andet kan mediumsammensætningen modificeres for at fremme væksten af specifikke mikroorganismer af interesse. Især naive medier som de tre medier i denne artikel er forberedt på og afhængige af sådanne ændringer. Eksempler på kulstof og energikilder omfatter fumarat18, pepton18, celluloseholdigt organisk stof19, acetat20, gærekstrakt19,20, xylitol (stamme SIUC1), formiat (stamme SIUC3) og andre potentielle kilder såsomH2/CO2, citrat og glucose. Endelig kan mediesammensætningen ændres afhængigt af den ønskede undersøgelse. For eksempel var hovedinteressen for undersøgelsen beskrevet i afsnittet om repræsentative resultater at opdage, hvordan repræsentative anaerobe mikroorganismer under overfladen ville reagere på en unik blandet organisk gylle (en opslæmning af majskolber behandlet af OHD13,14); Således indeholdt opskriften denne kulstofkilde i stedet for mere konventionelle muligheder. Andre potentielle ændringer til specifikke undersøgelser omfatter tilsætning af plast, syrer og tungmetaller eller andre xenobiotika til bioremedieringsundersøgelser; tilsætning af genstridige kulstofpolymerer såsom cellulose og plast til undersøgelser af depolymeriserede produkter med merværdi og tilsætning af husdyrgødning og planteaffald til kompost i mindre målestok og andre landbrugsundersøgelser.
Hvis der ønskes postreduktantanalyse af et medium, såsom målinger af pH, oxidationsreduktionspotentiale (ORP) og opløst ilt (DO), kan dette opnås indirekte ved at ofre et repræsentativt antal mellemstore flasker for med sikkerhed at forstå karakteren af den batch. Ved udsættelse af en forseglet medium flaske for luft anbefales det kraftigt, at ORP- og DO-aflæsninger tages under 1 minut efter åbning. Ikke-iltafhængige målinger (f.eks. pH) kan foretages uden hastende karakter efter den første åbning. Kræsne anaerobe mikroorganismer kræver typisk ORP-værdier < -200 mV for vækst. Hvis mediet resulterer i en ORP-værdi på > -200 mV og/eller DO-værdier >0,40 mg/l, kan yderligereNa2S(0,1-0,2 g/l) eller et andet reduktant (f.eks. titancitrat, L-cystein, ascorbinsyre) anvendes til at reducere mediet yderligere.
Resazurin bruges ofte som iltindikator (som i denne protokol); Det er imidlertid mere præcist en redoxindikator21, der angiver tilstedeværelsen af ilt indirekte, da oxygenet ændrer redoxpotentialet i en opløsning. Resazurin i opløsning vises oprindeligt blå i farven. Ved eksponering for reduktionsmidler skifter opløsningen irreversibelt til en lyserød farve. Når opløsningen reduceres yderligere, skifter den reversibelt til farveløs og vender tilbage til lyserød ved oxidering. Forfatterne har observeret tilfælde, hvor reducerede medier indeholdende resazurin skiftede fra blå til lyserød, men undlod at skifte til farveløs. Forfatterne har imidlertid også observeret, at sådanne medier ofte skifter til farveløse efter autoklavering, og at øget tid brugt på kogning og skylning af medierne generelt gør det muligt for resazurin at skifte til sin farveløse form efter tilsætning af reduktionsmidler. Hvis det ønskes, kan koncentrationen af ilt i mediet verificeres med en sonde til opløst ilt.
Alle materialer, der var nødvendige for at køre disse bioreaktorer og de specialfremstillede glasbioreaktorer selv, oversteg ikke ~ $ 5K (dette forudsætter, at supportudstyr allerede er tilgængeligt, såsom vandbad, pumper og inkubatorer). Disse anaerobe dyrkningsteknikker er økonomisk venlige sammenlignet med kommercielle automatiserede bioreaktorer, der kan starte ved > $ 10K. Derudover skifter mange kommercielle bioreaktorer til engangsreaktorbeholdere, hvilket ændrer sammenligningsdynamikken og ikke er omkostningseffektivt for mindre forskningslaboratorier / universiteter løbende at udskifte. Derudover kan kommercielle systemer have kemiske forstyrrelser (fra den anvendte plast, fedt på pakninger / fittings eller kemisk behandlet vand), der vil påvirke succesen med voksende kræsne mikroorganismer. De lave omkostninger, tilpasningsmuligheder og alsidighed til at indsamle en anaerob miljøprøve i kombination med et informeret medie, der kan podes, hvilket resulterer i generering af berigelser til undersøgelse, forbedrer chancerne for at erhverve unikke mikroorganismer betydeligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende den afstamning af information og mentorskab, der har påvirket / udviklet disse teknikker gennem årene. Dr. Hamilton-Brehm som tidligere kandidatstuderende, postdoc og nuværende professor skylder en taknemmelighed til dem, der tog sig tid til at undervise i anaerobe teknikker: Dr. Mike Adams, Dr. Gerti Schut, Dr. Jim Elkins, Dr. Mircea Podar, Dr. Duane Moser og Dr. Brian Hedlund. Nature Conservancy og American Rivers støttede dette arbejde gennem tilskud G21-026-CON-P og AR-CE21GOS373, henholdsvis. Eventuelle meninger, resultater, konklusioner eller anbefalinger udtrykt i dette papir er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis synspunkterne fra Nature Conservancy eller American Rivers. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra SIU Advanced Energy Institute, som taknemmeligt anerkender midler tildelt gennem Advanced Energy Resource Board. NGS blev udført af LC Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Materials | |||
| 1 L borosillicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 1 mL syringe with slip tip | Fisher Scientific | ||
| 10 mL glass pipette | Fisher Scientific | ||
| 100 mL culture bottle | Fisher Scientifc | ||
| 20 mm hand crimper | Fisher Scientifc | ||
| 23 G needle | Fisher Scientifc | ||
| 500 mL borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| Aluminum seal | Fisher Scientifc | ||
| Cannula, 31.5 cm length | Fisher Scientific | ||
| Cannula, 6 cm length | Fisher Scientifc | ||
| Corer | Giddings Machine Company | Assembled from company parts | |
| Gas manifold | Swagelok | Assembled from many different parts | |
| Lighter | Lowe's | ||
| N2 gas | Airgas | ||
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | ||
| Rubber stopper (for GL45 bottles) | Glasgeratebau OCHS | ||
| Rubber stopper (for culture bottles) | Ace Glass | ||
| Stirring hot plate | Corning | ||
| Trace minerals | ATCC | ||
| Vitamins | ATCC | ||
| Bioreactor-specific Materials | |||
| #10 rubber stopper | Ace Glass | ||
| #7 rubber stopper | Fisher Scientifc | ||
| 1 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 1/4" hose barb ball valve | Amazon | ||
| 10 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 3.5 L borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 5/16" - 1/4" hose barb adapter fitting | Amazon | ||
| 60 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 8 L borosillicate carboy | Allen Glass | ||
| Angled hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-20 | |
| Balloon | Party City | ||
| Borosillicate bioreactor | Allen Scientific Glass | Custom made upon request | |
| Drill | Lowe's | ||
| Female luer lock adapter coupler | Amazon | ||
| GL14 open top cap | Ace Glass | 7621-04 | |
| GL18 open top cap | Ace Glass | 7621-08 | |
| GL45 open top cap | Ace Glass | ||
| PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap | Ace Glass | 7625-06 | |
| PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap | Ace Glass | 7625-07 | |
| Ring stand | Fisher Scientific | ||
| Ring stand chain clamp | Amazon | ||
| Ring stand clamp | Fisher Scientific | ||
| Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od | Grainger | 55YG13 | |
| Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od | Grainger | ||
| Straight hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-22 | |
| Three-way stopcock | Amazon | ||
| Two-way stopcock | Amazon | ||
| Ultra low flow variable flow mini-pump | VWR | ||
| Water bath | Fisher Scientifc | ||
| White rubber septum for 13-18 mm od tubes | Ace Glass | 9096-49 | |
| Wire | Lowe's | ||
| Zip tie | Lowe's |
References
- Staley, J. T., Konopka, A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).
- Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes. MSystems. 3 (5), e00055 (2018).
- Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
- Marcy, Y., et al. Dissecting biological "dark matter" with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).
- Giovannoni, S., Stingl, U. The importance of culturing bacterioplankton in the'omics' age. Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).
- Stewart, E. J.
- Dedysh, S. N. Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps. Front. Microbiol. 2, 184 (2011).
- Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. Isolating" uncultivable" microorganisms in pure culture in a simulated natural environment. Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).
- Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012 (2011).
- Tyson, G. W., et al. Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community. Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).
- Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).
- Merino, N., et al. Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow. Sci. Total Environ. 842, 156768 (2022).
- Anderson, K. B., Creeping, J. C., Huggett, W. W. Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791. , Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf (2013).
- Anderson, K. B., Crelling, J. C., Huggett, W. W., Perry, D. M. Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512. , Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf (2018).
- Mullin, S. W., et al. Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer. Front. Microbiol. 11, 536535 (2020).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Miller, T. L., Wolin, M. A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes. Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin. Front. Microbiol. 10, 2224 (2019).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).
- Twigg, R. S.
