Summary
Bu makalenin odak noktası, bir ortamdan elde edilen titiz anaerobik mikroorganizmalar için ortam yapmak için en iyi uygulamaları detaylandırmaktır. Bu yöntemler anaerobik kültürlerin yönetilmesine yardımcı olur ve "mikrobiyal karanlık madde" olarak adlandırılan, kültürlenmemiş mikroorganizmaların büyümesini desteklemek için uygulanabilir.
Abstract
Anaerobik mikroorganizmaların kültüre bağlı araştırmaları metodolojik yeterliliğe dayanır. Bu yöntemler, anaerobik mikroorganizmalar için uygun büyüme koşulları (örneğin, pH ve karbon kaynakları) yaratmalı ve sürdürmeli, aynı zamanda yapay ortamdan ödün vermeden numunelerin ekstrakte edilmesine izin vermelidir. Bu amaçla, yerinde bir ortam tarafından bilgilendirilen ve simüle edilen yöntemler, o ortamdan mikroorganizmaların kültürlenmesinde çok yardımcı olabilir. Burada, minimum bozulma ile anaerobik numune toplamayı vurgulayarak, karasal yüzey ve yüzey altı mikroorganizmaların kültürlenmesi için yerinde bilgilendirilmiş ve simüle edilmiş bir anaerobik yöntemin ana hatlarını çiziyoruz. Bu protokol, özelleştirilebilir bir anaerobik sıvı ortamın üretimini ve anaerobik mikroorganizmaların çevresel edinimini ve in vitro büyümesini detaylandırır. Protokol ayrıca, çevresel olarak edinilen kültürler için tortu ve anaerobik sıvı ortamın çevresel simülasyonları için kullanılan bir anaerobik biyoreaktörün kritik bileşenlerini de kapsar. Aktif kültürün deneysel bir karbon kaynağına yanıt olarak dinamik olarak ayarlandığı bir biyoreaktörün ömrü boyunca korunan bir mikrobiyomdan elde edilen ön Yeni Nesil Dizileme verilerini dahil ettik.
Introduction
Çoğu mikroorganizma kültürlenmemiş olarak kalır; Bu, agar plakaları kullanılarak başarılı bir şekilde kültürlenen birkaç mikroorganizmanın aksine, mikroskopi ile gözlemlenen hücreler arasındaki büyük eşitsizlik ile desteklenir. Staley ve Konopka bu eşitsizliği "Büyük Plaka Sayısı Anomalisi" olarak adlandırdılar1. Tahmini hesaplanmamış çeşitlilik, birkaç farklı ortamdan sıra bolluk eğrilerinde dağılmış birçok yeni cinsi gösteren metagenomik ve metatranskriptomik verilerle desteklenmektedir2. Gözlemlenen mikroorganizmalar (genellikle bir mikrobiyal topluluğun rastgele av tüfeği dizilimi ile) ancak kültürlenmemiş "mikrobiyal karanlık madde" olarak adlandırılmıştır3,4.
-Omik çağında, genomik verileri tam olarak değerlendirmek ve mevcut genlerin işlevini/fenotipini doğrulamak için mikroorganizmaların kültürlenmesi zorunludur. Kültürlenmiş mikroorganizmaların dizilenmesi, av tüfeği metagenomikleri ve çevreden metagenomla birleştirilmiş genomlar gibi teknolojiler kabul edilebilir bir şekilde yanılmaz hale gelene kadar tam genomları güvenle elde etmenin tek yoludur5. Kültürlenmiş mikroorganizmalarla birleştirilmiş genomik değerlendirmeler, "mikrobiyal karanlık maddeyi" anlamak için güçlü çıkarımlar sağlar. "Mikrobiyal karanlık maddenin" birçok üyesi, besinlerin ve diğer elementlerin döngüsünü ve değerli doğal ürünlerin üretimini etkileyen, ekolojik sistemleri destekleyen ve ekolojik hizmetleri yerine getiren önemli işlevleri yerine getirir. Tıbbi açıdan bakıldığında, şu anda pazarlanan tüm ilaçların yaklaşık yarısı, bakterilerden elde edilen ürünlerin ürünleri ve türevleridir ve kültürlenmemiş türlerin profillenmesinin geleceğin antibiyotiklerini ortaya çıkardığından şüphelenilmektedir. Bu kültürsüz çoğunluğa erişmek için, çeşitli kültür metodolojileri artırılmalıdır6. "Mikrobiyal karanlık madde" üyeleri arasında, anaerobik oligotrofik mikroorganizmalar büyük ölçüde rapor edilmemiştir ve muhtemelen ekolojik ve endüstriyel olarak değerli biyokimyasal yollara7 sahiptir, bu da onları kültürlemenin önemli hedefleri haline getirir. Bununla birlikte, anaerobik oligotrofik mikroorganizmaların kültürlenmesi, genellikle gerekli olan daha uzun inkübasyon süreleri, titiz koşullar (örneğin, belirli standart dışı in vitro sıcaklıklar) ve özel ortam tariflerinin kullanımı nedeniyle aerobik ve kopiotrofik muadillerine göre daha zordur.
Yeni anaerobik oligotrofik mikroorganizmalar da dahil olmak üzere "mikrobiyal karanlık madde" üyelerini kültürlemek için mevcut gelişen teknikler, anlayışımızı büyük ölçüde geliştirdi ve bu mikroorganizmaların filogenetik ağaç içindeki temsilini artırdı. Yeni mikroorganizmaların kültürlenmesi için bilgilendirilmiş ortam kullanan mevcut teknikler (yani, ilgilenilen mikroorganizma/organizmaların bilgisi kullanılarak türetilen ortam) üç farklı yönteme ayrılabilir. Yöntemlerden ilki, bir zar içinde ilgilenilen mikroorganizmaları zaten içeren bir in vitro büyüme odasına transfer için ortamın ayrı bir bölümünün doğrudan çıkarılmasını gerektirir. Ayrık bölüm (örneğin, deniz suyu), ilgilenilen mikroorganizmalara yerinde kullandıkları jeokimyasal habitatı sağlamak için hareket ederken, zar hücrelerin hareketini durdurur (ilgilenilen hücreler içeride kalacaktır; ayrık bölümle gelen yabancı hücreler dışarıda kalacaktır). Mikroorganizmaları doğal ortamlarında hedeflemek için doğal olarak bulunan bileşikleri dahil ederek, bu tür mikroorganizmalar kültürlenebilir8. İkinci yöntem, metabolik yetenekleri aydınlatmak için metatranskriptomik veya genomik kullanır ve hedeflenen bir ortam tasarımı için dar kültür parametrelerine ipuçları sağlar. Bu yaklaşım, belirli mikroorganizma türlerinin bir ortamdan zenginleştirilmesini hedeflemek için kullanılabilecek eko-fizyolojik bir profil sağlar. Ortamın hükümleri, zenginleştirme çeşitliliğini azaltmak için hedeflenen mikroorganizma(lar)ı desteklediği varsayılan mevcut tanımlanmış genlere yöneliktir,9,10. Bir uyarı, genomik bilginin genlerin ekspresyonunu doğrudan anlamadığı, transkriptomik bilginin ise çıkardığıdır.
Üçüncü yöntem, medyayı simüle etmeyen, bunun yerine çevreyi doğrudan bir medya kaynağı olarak kullanan birinci yöntemden farklı olarak, çevresel olarak bilgilendirilmiş ve simüle edilmiş medyayı kapsar. Bu üçüncü yöntem, ilgilenilen mikroorganizmaları içeren bir saha sahasının jeokimyasının çevresel keşfini gerektirir. Bu bilgiyle, çevresel olarak bilgilendirilmiş simüle edilmiş bir ortam üretmek için birincil bileşenler ve fiziksel parametreler tanımlanır. Ortam daha sonra ortamdan ortama mikroorganizma içeren tortu veya sıvının doğrudan infüzyonunu alır. Bu yöntem, kültür mikrobiyoloğunun yeterli miktarda kaynak ortama (ilk yöntem için gerektiği gibi) veya uygun metatranskriptomik veya genomik verilere (ikincisi için gerektiği gibi) erişiminin olmadığı durumlarda özellikle değerlidir.
Aşağıdaki protokol üçüncü yönteme bir örnektir; İlgilenilen ortamlar tarafından bilgilendirilir ve simüle etmeyi amaçlar. Protokol kapsamında, sahada elde edilen farklı anaerobik mikroorganizma kültürlerini hedef alan üç naif besiyeri reçetesi paralel olarak sunulmaktadır. Temsil edilen üç kültür, topraktan kaynaklanan karışık kültürler (bundan sonra toprak karışık kültür olarak anılacaktır), bir sondaj deliğinden kaynaklanan karışık kültürler (bundan sonra sondaj deliği karışık kültürü) ve bir sondaj deliğinden kaynaklanan izole edilmiş bir metanojendir (bundan sonra, sondaj deliği izole metanojen). Burada paylaşılan medya tariflerinde yer alan bileşik kimlikler ve miktarlar bir başlangıç rehberi niteliğindedir; Okuyucunun çevresine ve ilgilendiği mikroorganizmalara göre özelleştirilebilir ve teşvik edilirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Özelleştirilebilir anaerobik sıvı ortam üretimi
- Kültür şişeleri için ortam (500 mL üretim)
- Bileşikleri ölçün ve 1 L'lik bir şişeye ekleyin ve okuyucunun ilgilendiği kültüre karşılık gelen Tablo 1'deki sütunu kullanarak pH'ı ayarlayın ( Tablo 1'deki miktarlar 1.000 mL'lik üretim için kaydedilir, buna göre ayarlayın). Şişeyi döndürerek bileşikleri homojen hale getirin.
- Şişeyi 5-6 dakika mikrodalgada pişirerek sıvıyı kaynama noktasına kadar ısıtın. Mikrodalgayı sık sık açın ve ısıya dayanıklı bir eldiven kullanarak sıvıyı hafifçe döndürün. Köpürdükten sonra sıvı hareketsiz kalırsa mikrodalgayı hızlı bir şekilde açın; Aksi takdirde, sıvı hızla genişleyebilir ve şişeden taşabilir.
- N10 gaz manifoldu kurulumuna steril bir 2 mL cam pipet takın (Balch ve ark.11'in tasarımına dayalıdır, ancak N2 saflık gazı için ısıtılmış bir bakır kolon gerektirmez; daha fazla gaz manifoldu bilgisi için Ek Dosya 1'e bakın). O2'yi havalandırmak için manifoldu açın veN2 gazının dışarı akmasına izin verin.
- Pipet ucunu sıvıya yerleştirin ve kabarcıklar orta derecede kuvvetli olacak şekilde gaz akışını ayarlayın. Şişe artık dokunulamayacak kadar sıcak olana kadar sıvıyıN2 ile yıkayın.
NOT: Bu, ortamın içeriğine bağlıdır ancak genellikle ~20 dakika sürer. - Şişenin soğumasını beklerken 10 adet steril 100 mL kültür şişesi koyun; veya toprakla karıştırılmış kültürün toplanması için ortam hazırlıyorsanız, iki adet steril 500 mL şişe koyun.
- Medya şişesi dokunulamayacak kadar soğuduktan sonra, pipet ucunu şişenin üst boşluğuna doğru çekin. 0.125 gNaHCO3 ve 0.300 gNa2S∙9H2Oekleyin ve resazurin renksiz hale gelene kadar bekleyin.
DİKKAT: Na 2 S∙9 H2O aşındırıcı, toksik ve tahriş edicidir. Tutarken kişisel koruyucu ekipman kullanın ve temastan sonra metal aletleri iyice durulayın. - Resazurin'in renginin değişmesini beklerken, gaz manifoldu kurulumuna metal kanüller takın ve kanül uçlarını kültür şişelerine yerleştirin. N2'nin şişelere akışını ılımlı bir hıza ayarlayın, böylece bir sonraki adımda eklenen sıvı gaz akışı nedeniyle kaymaz.
- Resazorin renksiz olduğunda, her kültür şişesine 50 mL sıvı veya her 500 mL şişeye 250 mL sıvı alikot.
- Kanülleri çıkardıktan hemen sonra her şişeyi uygun boyutta bir lastik tıpa ile kapatın. Tıpayı alüminyum conta (kültür şişeleri için) veya GL45 üstü açık vidalı kapak (500 mL şişeler için) ile sabitleyin.
- Şişeleri otoklavlanabilir bir çöp kutusuna koyun ve su seviyeleri şişelerdekilerle eşleşene kadar hazneyi musluk suyuyla doldurun.
NOT: Bu, otoklavlama sırasında cam üzerindeki sıcaklık farklılıklarının neden olduğu stres nedeniyle şişelerin yırtılmamasını sağlayacaktır. - Şişeleri 121 °C'de 30 dakika otoklavlayın.
- Biyoreaktör ortamı (8 L üretimi)
- Damacana hazırlanması
- 1/4" (6.4 mm) hortum dikenli küresel vananın vanasını açın. Hortum dikenli küresel vananın her iki ucuna 6/1" (4 mm) iç çaplı (ID) ve 4/1" (2 mm) dış çaplı (OD) iki adet 12.7 cm uzunluğunda silikon boru takın.
- Düzeneğin bir ucuna 5/16"-1/4" (7.9 mm-6.4 mm) hortum dikeni adaptör bağlantısı takın. Düzeneğin diğer ucunu 8 L'lik bir damacananın hortum ucuna takın.
- Damacananın hortum ucu ile hortum arasındaki bağlantıyı ve hortum ucu adaptör bağlantısı ile boru arasındaki bağlantıyı sabitlemek için bir fermuar kullanın.
- Damacanayı 121 °C'de 30 dakika otoklavlayın.
- Orta üretim
- 8 L damacana tertibatındaki hortum dikenli küresel vananın vanasını kapatın.
- 8 L damacanaya bileşikleri ölçün ve ekleyin ve okuyucunun ilgilendiği kültüre karşılık gelen Tablo 1'deki sütunu kullanarak pH'ı ayarlayın ( Tablo 1'deki miktarlar 1.000 mL'lik üretim için kaydedilmiştir, buna göre ayarlayın). Bir karıştırma çubuğu ekleyin ve bileşikleri homojen hale getirmek için bir karıştırma sıcak plakası kullanın.
- Sıvıyı karıştıran sıcak plaka ile kaynayana kadar ısıtın. Sıvının 30 dakika kaynamasına izin verin.
NOT: Sıvının kaynama noktasına kadar ısıtılması, ortamın içeriğine bağlıdır ancak 2-3 saat sürebilir. - N10 gaz manifoldu kurulumuna steril bir 2 mL cam pipet takın (Balch ve ark.11'in tasarımına dayalıdır, ancak N2 saflık gazı için ısıtılmış bir bakır kolon gerektirmez; daha fazla gaz manifoldu bilgisi için Ek Dosya 1'e bakın). O2'yi havalandırmak için manifoldu açın veN2 gazının dışarı akmasına izin verin.
- Isıyı kapatın, ardından pipet ucunu sıvıya yerleştirin ve gaz akışını, kabarcıklar orta derecede kuvvetli olacak ancak taşmayacak şekilde ayarlayın. Sıvıyı N2 ile 30 dakika yıkayın.
- Pipet ucunu damacananın baş boşluğuna doğru çekin. 2.0 gNaHCO3 ve 4.8 gNa2S∙9H2Oekleyin ve resazurin renksiz hale gelene kadar bekleyin.
DİKKAT: Na 2 S∙9 H2O aşındırıcı, toksik ve tahriş edicidir. Tutarken kişisel koruyucu ekipman kullanın ve temastan sonra metal aletleri iyice durulayın. - Resazurin renksiz olduğunda, cam pipeti çıkarın ve hemen damacanayı #10 tıpa ile kapatın. Tıpayı sabitlemek için tıpanın üzerine ve damacananın dudağının etrafına bir tel bükün.
- Damacana hazırlanması
2. Çevresel anaerobik mikroorganizmaların yerinde edinilmesi
- Yüzey anaerobik numune alımı (toprak karışık kültür)
- Yukarıdaki gibi yapılmış karışık toprak kültürü ortamının şişelerini / şişelerini ve bir çekirdeği tarlaya getirin.
NOT: Yazarlar tarafından bir Giddings 2 5/8" standart konik toprak ucu kullanılmıştır (Malzeme Tablosu). Bununla birlikte, istenen derinliğe kadar numune alabilen herhangi bir toprak karot veya mala kullanılabilir. - Numune toplama silindirinin üst kısmı tortunun yüzeyi ile aynı hizaya gelene kadar çekirdeği tortunun içine itin (kazık/kazık çakmak).
- Çekirdeği serbest bırakmak için çekirdeği 90° döndürün ve numune ortamdan çıkarılana kadar yukarı doğru çekin.
- Gevşek çökeltilerde (sulak alanlardan numune alırken karşılaşılabilecekler gibi), numunenin ekstraksiyon sırasında düşmesini veya suya yayılmasını önlemek için ekstrakte edilirken çekirdeğin tabanını yeni bir nitril eldivenli el ile örtün.
- Çekirdeğin tabanından 6-7 cm yukarıya doğru gözle hızlı bir şekilde yaklaşın. Çekirdeği dilimlemek için yeni bir nitril eldivenli el kullanın ve altını 6-7 cm ayırın.
- Çekirdeğin altını hemen kültür şişesine aktarın. Toprak/tortu çok büyükse, aerobik atmosfere maruz kalmayı mümkün olduğunca en aza indirerek şişeye daha kolay sığacak şekilde hızlı bir şekilde şekillendirin.
- Numune aktarıldıktan sonra, durdurucuyu hemen yeniden konumlandırın ve bir vidalı kapakla yerinde tutun.
- Numuneyi serin tutun. Laboratuvara döndükten sonra toplama şişesini 4 °C'de soğutun.
- Yukarıdaki gibi yapılmış karışık toprak kültürü ortamının şişelerini / şişelerini ve bir çekirdeği tarlaya getirin.
- Yeraltı anaerobik numune alımı (sondaj deliği karışık kültürü)
- Gaz manifoldunun yanına steril 1 L'lik bir şişe koyun. Şişeyi lastik bir tıpa ile kapatın. Tıpa üzerine% 100 etanol damlatın ve bir çakmak kullanarak ateşe verin.
- N 23 gaz manifoldu kurulumuna steril bir 2 G iğne takın. O2'yi havalandırmak için manifoldu açın veN2 (veya Ar) gazının ılımlı bir hızda dışarı akmasına izin verin.
- Tıpa artık yanmadığında, iğneyi şişeye sokun. Gaz manifolduna takılı olmayan ikinci bir steril 23 G iğneyi şişeye yerleştirin. Şişeyi 1-2 dakika yıkayın.
- Gaz manifolduna bağlı olmayan iğneyi çıkarın. Şişeyi 1 dakika basınçlandırın. Kalan iğneyi çıkarın.
- Basınçlı şişeyi ve sterilize edilmiş 23 G'lik bir iğneyi sondaj deliği alanına getirin. Merinos ve ark.12'nin yöntemlerini izleyerek sondaj deliğinden sıvı çekin.
NOT: Sondaj deliğinin yöntemine, bağlantısına ve akış hızına bağlı olarak bu, bir su numunesi alma stratejisini değiştirir. Sürekli bir su akışı varsa, adım 2.2.6'da belirtildiği gibi su toplamak. yeterli olacaktır. Su akışı toplu olarak toplanmışsa veya düşük akışlıysa, alternatif bir giriş/çıkış yöntemi kullanılabilir. Her durumda, kontaminasyonu en aza indirin ve toplanan numunenin, numune alınması istenen ortamı temsil ettiğinden emin olmaya çalışın. Bu genel olarak genelleştirilmiş bir ifadedir, çünkü yazarların deneyimi, devlet veya özel sitelerden gelen her örnek toplama etkinliğinin mevcut erişilebilirliğe son derece uyarlanabilir olması gerektiğidir. - Şişeyi hızlıca açın, şişeyi tamamen doldurmak için sıvıyı pompalayın ve şişeyi kapatın.
- Şişedeki basıncı hafifletmek için bölgeye getirilen 23 G iğneyi şişenin kauçuk tıpasına sokun. İğneyi çıkarın.
- Numuneyi serin tutun. Laboratuvara döndükten sonra toplama şişesini 4 °C'de soğutun.
3. Sahada edinilen anaerobik mikroorganizmaların in vitro büyümesi
- Kültür şişesi ile büyüme
- Tıpalı steril bir N2 şişesi ve yukarıdaki gibi hazırlanmış kültür şişeleri ve toplama şişesi yerleştirin. Tıpaların üzerine %100 etanol damlatın ve çakmak kullanarak ateşe verin.
- 23 G'lik bir iğneyi 1 mL'lik bir şırıngaya monte edin. Tıpalar artık yanmadığında, iğneyiN2 şişesine sokun ve ~1 mLN2 çekin. İğneyi çıkarın.
- N2'yi serbest bırakmak için pistona yavaşça bastırın. Şırınga boşalır boşalmaz, iğneyi toplama şişesine yerleştirin ve 0,5 mL çevresel numune alın. İğneyi çıkarın.
- İğneyi kültür şişesine yerleştirin ve numuneyi enjekte edin. İğneyi çıkarın.
- Şişeyi döndürün ve Tablo 1'de veya okuyucunun ilgilendiği ortamda belirtildiği gibi sıcaklıkta bir inkübatöre yerleştirin.
NOT: Kültür ilerlemesi (şişe veya biyoreaktör) 0.02 mm derinliğinde bir Petroff-Hauser hemositometresi kullanılarak izlenir. Anaerobik veya titiz mikroorganizmaların zenginleştirilmesi tipik olarak OD600'ün kullanılabildiği hücre yoğunluklarına ulaşmaz ve diğer tespit yöntemleri rutin ve tekrarlayan izleme için pratik değildir. Algılama limitleri, kalite kontrol ve istatistiksel hesaplamalar, hücre sayma odasının tipine ve kullanıcının ihtiyaçlarına bağlıdır.
- Biyoreaktör ile büyüme
- Modifiye edilmiş bir şırınga ile bir balonun hazırlanması
- Pistonu üç adet 10 mL luer kilit şırıngasından çıkarın (her son montaj için bir tane). Her şırınganın flanşını kesin ve kopan ucu balonları delmeyecek şekilde törpüleyin. Değiştirilmiş şırıngadaki tüm talaşları temizleyin.
- Bir balonu diğerinin içine yerleştirerek ikiye katlanmış bir balon hazırlayın.
- İki katına çıkarılmış balonun ucunu modifiye edilmiş 10 mL'lik şırınganın üzerine gerin.
- Dış balonun ucunu iç balondan biraz ayırın. Balonlar arasında sıkışan tüm havayı sıkın.
- Balonları şırıngaya sabitlemek için balonların tabanının etrafına bir fermuar sıkın.
- Modifiye edilmiş bir tıpanın hazırlanması
- Pistonları on adet 1 mL luer kilit şırıngasından çıkarın (değiştirilecek her tıpa için iki tane). Flanşı şırıngalardan kesin.
- #10 boyutunda iki lastik tıpa (8 L damacanalar için) ve GL45 iplik kaplamalı şişeler için üç boy (yakalama şişeleri için) ayarlayın. 1/4" (6.4 mm) matkap ucu kullanarak, her bir lastik tıpanın üstünden, modifiye edilmiş şırıngaların sığması için yeterince geniş ve geçme parçasının hava geçirmez olması için yeterince dar iki delik açın.
- Modifiye edilmiş şırıngaları lastik tıpanın deliklerinden geçirin.
- Modifiye edilmiş tıpayı 121 °C'de 30 dakika boyunca temizleyin ve otoklavlayın.
- Biyoreaktör düzeneğinin hazırlanması
- Tüm muslukları, dişi luer kilit adaptörü konektörlerini ve diğer otoklavlanamayan biyoreaktör malzemelerini %70 etanol ile dezenfekte edin ve tüm boruları (uzunlamasına kestikten sonra), tıpaları, cam yünü ve diğer otoklavlanabilir biyoreaktör malzemelerini 121 °C'de 30 dakika otoklavlayın.
- Steril bir biyoreaktörü (Şekil 1 ve Şekil 2) bir halka standına yerleştirin ve bir zincir kayışla sabitleyin. Ayrıca bir su banyosu, bir peristaltik pompa, orta içeren tıpalı 8 L damacana (protokol adımı 1.2'den itibaren), bir adet 3,5 L şişe (örneksiz yakalama şişesi) ve bir adet 500 mL şişe (örnekleme yakalama şişesi) hazırlayın.
- Damacanayı durdurmak
- Modifiye edilmiş bir şırınga ile bir balon yerleştirin. Şırınganın luer kilit ucuna üç bir musluk bağlayın.
- Balon tertibatını alın ve üç vanayıN2'lik bir tankın borusuna bağlayın. Atmosfere açık ucu kapatmak için üç vanayı çevirin.
- Benzin deposunu açın ve balonuN2 ile doldurun. Dolduğunda, balonun ucunu bloke etmek için üç vanayı çevirin. Benzin deposunu kapatın ve depo borusunu üç vanadan ayırın.
- Aşağıdakileri sırayla bağlayın: üç bir musluk (modifiye şırıngalı balonun ucu), iki yönlü bir musluk, bir dişi luer kilit adaptörü kuplörü ve modifiye edilmiş tıpa şırıngalarından birinin luer kilit ucu.
- Diğer şırınganın luer kilit ucuna iki yönlü bir musluk bağlayın. Modifiye edilmiş durdurucu tertibatındaki iki vanaların her iki valfini de kapatın.
- Damacananın değiştirilmemiş #10 numara tıpasını tutan teli açın. Değiştirilmemiş durdurucuyu değiştirilmiş durdurucu tertibatı ile hızlı bir şekilde değiştirin ve değiştirilmiş durdurucu tertibatını damacanaya sabitlemek için teli daha önce olduğu gibi bükün.
NOT: Kendinden emin ve hazırlıklı olunursa, modifiye edilmiş tıpa tertibatı, orta hazırlığın son adımında damacanayı durdurmak için kullanılabilir (adım 1.2.2.7). - Atmosfere açık ucu kapatmak için üç vanayı çevirin. Sıralı iki yönlü vanayı açın. Balonun gazı ve 8 litrelik damacananın tepe boşluğu artık birbirine bağlanmıştır.
- Numune alınmayan ve numune alma yakalama şişelerinin durdurulması
- 3,5 L'lik örneksiz yakalama şişesini, GL45 diş kaplamalı şişeler için boyutlandırılmış, şişeye sığdırmaya yardımcı olmak için tıpanın tabanına %70 etanol uygulayarak durdurun. Şişeyi GL45 üstü açık vidalı kapakla kapatın.
- Aşağıdakileri sırayla bağlayın: modifiye edilmiş şırınganın luer kilit ucuna sahip bir balon, üç bir musluk, bir dişi luer kilit adaptör kuplörü ve modifiye edilmiş tıpa şırıngalarından birinin luer kilit ucu. Doğrudan atmosfere açılan ucu kapatmak için üç vanayı çevirin.
- Diğer şırınganın luer kilit ucuna bir dişi luer kilit adaptör kuplörü bağlayın.
- 500 mL örnekleme yakalama şişesi için yukarıdaki üç adımı tekrarlayın.
- Boru kurulumu
- Biyoreaktör su ceketi portları ile su banyosu hortumu dikenleri arasındaki mesafeyi ölçün. Bu mesafeyi genişletmek için iki uzunlukta 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD silikon boru kesin.
- GL14 üstü açık vidalı kapaklı iki düz hortum konektörünü birleştirin. Her birini iki boru parçasının bir ucuna takın.
- Vidalı kapakları biyoreaktör su ceketinin bağlantı noktalarına çevirin. Borunun diğer uçlarını su banyosu hortum dikenlerine takın, böylece su su banyosundan dışarı akacak, biyoreaktör su ceketinin altından girecek, su ceketinin üstünden çıkacak ve su banyosuna geri dönecektir. Boruyu su banyosu hortum dikenlerine sabitlemek için borunun uçlarının etrafındaki fermuarları sıkın.
- VWR Ultra Düşük Akışlı Değişken Akışlı Mini Pompaya benzer pompalar için, beraberindeki 3/16" (4.8 mm) OD oluklu boru tertibatını pompadan geçirin.
- Damacana boru tertibatı ile peristaltik pompa hortum tertibatı arasındaki mesafeyi ölçün. Bu mesafeyi genişletmek için 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD silikon boru uzunluğunu kesin.
- Borunun bir ucunu damacana boru tertibatının hortum ucuna ve diğer ucunu peristaltik pompa boru tertibatının hortum ucuna, ortamın damacanadan ve peristaltik pompadan akacak şekilde yönlendirilmiş olarak takın.
- Peristaltik pompa hortumu tertibatı ile biyoreaktörün alt portu arasındaki mesafeyi ölçün. Bu mesafeyi genişletmek için 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD silikon boru uzunluğunu kesin.
- Bu borunun bir ucunu peristaltik pompa borusu tertibatının hortum ucuna takın ve diğer ucunu dikkatlice biyoreaktörün alt portuna takın. Camı çatlatmamaya ve aynı zamanda bağlantıyı sabitlemeye dikkat ederek, boruyu biyoreaktörün alt portuna sabitlemek için borunun ucundaki bir fermuarı sıkın.
- Yaklaşık 5" (127 mm) uzunluğunda 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD silikon boruyu ölçün ve kesin.
- Üç bir vanaya bir dişi luer kilit adaptörü konektörü takın. Üç musluğun herhangi bir ucunu boruya takın.
- GL14 üstü açık vidalı kapaklı bir açılı hortum konektörünü monte edin. Borunun diğer ucuna takın.
- Vidalı kapağı biyoreaktörün en üstteki dikey portuna çevirin. Biyoreaktörü gösteren ucu kapatmak için üç vanayı çevirin.
- En üstteki dikey port tertibatı ile örnekleme yapmayan yakalama şişesi tertibatı arasındaki mesafeyi ölçün. Bu mesafeyi genişletmek için 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD silikon boru uzunluğunu kesin. Flanşları iki adet 1 mL luer kilitli şırıngadan kesin ve borunun uçlarına yerleştirin.
- Bu boru tertibatının bir ucunu en üstteki dikey bağlantı noktası tertibatının üç vanasına takın ve diğer ucunu sampling olmayan yakalama şişesi tertibatındaki dişi luer kilit adaptör konektörüne takın.
- En üstteki dikey port tertibatı ile numune alma şişesi tertibatı arasındaki mesafeyi ölçün. Bu mesafeyi genişletmek için 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD silikon boru uzunluğunu kesin. Flanşları iki adet 1 mL luer kilitli şırıngadan kesin ve borunun uçlarına yerleştirin.
- Bu boru tertibatının bir ucunu en üstteki dikey bağlantı noktası tertibatının üç vanasına takın ve diğer ucunu sampling catch şişe tertibatındaki dişi luer kilit adaptörü konektörüne.
- Biyoreaktörün doldurulması
- Biyoreaktörün GL18 portlarından birini beyaz kauçuk bir septum ile kapatın. Diğer GL18 bağlantı noktasını ve kalan dikey açıkta kalan GL14 bağlantı noktalarını GL18/GL14 boyutlu PTFE yüzlü silikon septa (PTFE cama bakacak şekilde) ve üstü açık vidalı kapaklarla kapatın.
- 50 cm uzunluğunda bir çubukla, biyoreaktörün tabanına 0,9 g cam yünü koyun.
- 121 °C'de 1,3 L kumu 30 dakika boyunca otoklavlayın. Bir huni kullanarak biyoreaktörü kumla doldurun.
NOT: Okuyucunun çevresi ve ilgilenilen mikroorganizmalar tarafından bilgilendirilen diğer tortu türleri burada ikame edilebilir. - Boruyu biyoreaktörün tepesineN2'lik bir tanka yerleştirin ve biyoreaktör üst boşluğunuN2 ile 2 dakika yıkayın. Biyoreaktörü hemen #7 boyutlu bir tıpa ve bir GL45 üstü açık vidalı kapakla kapatın.
- Örnekleme yapmayan yakalama şişesinden, hortumu ayırın ve balonu gösteren ucu kapatmak için üç vanayı çevirin. Boruyu N2'lik bir tanka dişi luer kilit adaptörü konektörüne bağlayın ve biyoreaktör üst boşluğunu 2 dakika boyunca N2 ile yıkayın. Boruyu hemen yeniden bağlayın ve atmosfere açık ucu kapatmak için üç vanayı geri takın.
- Örnekleme yakalama şişesi için yukarıdaki adımı tekrarlayın.
- Sampling catch şişesine işaret eden ucu kapatmak için biyoreaktörün en üstteki dikey portunun üç vanasını çevirin. Damacanadan biyoreaktöre sıvı pompalayın. Pompayı duraklatın ve numune alma şişesinin balonunu havalandırın ve damacananın balonunu gerektiği gibi N2 ile doldurun.
- Biyoreaktör ortamla doldurulduktan sonra, pompa akış hızını 0,6 mL/dk'ya ayarlayın (Mini Pompada dijital değer 40).
NOT: Okuyucu tarafından istenen diğer akış hızları burada değiştirilebilir. - Su banyosu sıcaklığını, Tablo 1'de veya okuyucunun ilgilendiği ortamda belirtildiği gibi ayarlayın.
NOT: Aşı, çalışma özelliklerine bağlı olarak bu noktada veya daha sonra eklenebilir. Bu noktada aşı yapıyorsanız, adım 3.2.4.10'a geçin. Daha sonra aşılama yapıyorsanız, adım 3.2.5'e geçin. - Bir toplama şişesi veya aşılanmış kültür şişesi ve tıpalı steril bir N2 şişesi yerleştirin. Tıpaların üzerine %100 etanol damlatın ve çakmak kullanarak ateşe verin.
- 23 G'lik bir iğneyi 60 mL'lik bir şırıngaya monte edin. Tıpalar artık yanmadığında, iğneyiN2 şişesine sokun ve ~50 mLN2 çekin. İğneyi çıkarın.
- N2'yi serbest bırakmak için pistona yavaşça bastırın. Şırınga boşalır boşalmaz, iğneyi toplama şişesine yerleştirin ve 50 mL çevresel numune alın. İğneyi çıkarın.
- 23 G iğneyi steril uzun bir metal iğne (kanül, uzunluk 31,5 cm) ile değiştirin. Uzun metal iğneyi biyoreaktörün GL18 portundaki beyaz kauçuk septumdan geçirin.
- İğneyi tortuya itin ve aşıyı enjekte edin. İğneyi çıkarın.
- Biyoreaktör bakımının çalıştırılması
- Biyoreaktörün çalıştığı her gün aşağıdakileri gerçekleştirin:
- Su banyosu seviyesini kontrol edin. Düşükse, daha fazla su ekleyin (korozyonu ve mineral birikimini azaltarak ekipmanın uzun ömürlü olması için damıtılmış su kullanın).
- Örnekleme yapmayan yakalama şişesinin balonunu kontrol edin; Dolu bir balon, ortamın akışını engelleyecektir. Dolduğunda, yakalama şişesine bakan ucu kapatmak için üç vanayı çevirin. Balonu boşaltmak için sıkın; Ardından, atmosfere açık ucu kapatmak için üç vanayı geri getirin; Balon boşalana kadar tekrarlayın.
- 8 L damacananın balonunu kontrol edin. Düşükse, sıralı iki yönlü vanayı kapatın ve üç vanayı iki yönlü vanadan ayırın. 3.2.3.3.2, 3.2.3.3.3 ve 3.2.3.3.7 adımlarını izleyerek balon düzeneğini yeniden doldurun ve yeniden takın.
- 8 L damacanadaki ortamın seviyesini kontrol edin. Düşükse, başka bir 8 L damacana monte edin ve protokol adımları 1.2'yi izleyerek daha fazla orta hazırlayın. ve 3.2.3.3. Pompayı duraklatın, hortum dikenli küresel vanayı kapatın, eski damacanayı hızlıca ayırın ve yeni damacanayı bağlayın.
NOT: 0.6 mL/dk'lık bir akış hızı için her 9 günde bir yeni ortama ihtiyaç duyulacaktır. - Örnekleme yapılmayan yakalama şişesindeki ortamın seviyesini kontrol edin. Doluysa, 3.2.3.4.1 adımına göre numune alınmayan başka bir yakalama şişesi takın. Yeni şişeyiN2 ile yıkayın, modifiye edilmiş şırınga ve hortum ile balonu eski şişeden hızlı bir şekilde ayırın ve yeni şişeye bağlayın.
- Değiştirilmiş tıpayı dolu, numune alınmayan bir yakalama şişesinden çıkarın. Sıvıyı 121 °C'de 30 dakika otoklavlayın; Ardından, sıvıyı okuyucunun kurumsal politikalarına göre atın. Numune alınmayan yakalama şişesi tertibatının tüm parçalarını bir sonraki kullanıma hazırlamak için temizleyin ve otoklavlayın.
- Aşağıdakileri yaparak her 7 günde bir (veya okuyucu tarafından istenen sayıda) örnekleme gerçekleştirin:
- Biyoreaktörün en üstteki dikey portunun üç vanasını, numune alınmayan yakalama şişesine işaret eden ucu bloke etmek için çevirin. 250 mL sıvı toplayın.
NOT: 0.6 mL/dk'lık bir akış hızı için 250 mL toplamak ~7 saat sürecektir. - Biyoreaktörün en üstteki dikey portunun üç vanasını, numune alma yakalama şişesine işaret eden ucu bloke etmek için geri takın. Boruyu ve s'yi ayırınampling yakalama şişesi, biyoreaktörün en üstteki dikey portunun üç vanasından.
- Test ettikten, sakladıktan ve/veya uygun şekilde imha edildikten sonraampling sıvısı, s'nin tüm parçalarını temizleyinampling yakalama şişesi tertibatı balon hariç, modifiye şırınga ile. Modifiye şırınga ve dişi luer kilit adaptör konektörlü balon hariç tüm parçaları 121 °C'de 30 dakika otoklavlayın. Bir sonraki numune alma günü için tekrar birleştirin.
NOT: Gerekirse hızlı onarım ve değiştirme için parçaların, kapakların, boruların ve septaların çoğaltılması veya üç kez yedeklenmesi şiddetle tavsiye edilir.
- Biyoreaktörün en üstteki dikey portunun üç vanasını, numune alınmayan yakalama şişesine işaret eden ucu bloke etmek için çevirin. 250 mL sıvı toplayın.
- Biyoreaktörün çalıştığı her gün aşağıdakileri gerçekleştirin:
- Modifiye edilmiş bir şırınga ile bir balonun hazırlanması
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, burada açıklandığı gibi bir sondaj deliği karışık kültür ortamı hazırlama yöntemi ve bir biyoreaktör kurulum yöntemi kullanan bir biyoreaktör çalışmasının sonuçlarını gösteriyoruz. Sondaj deliği karışık kültür ortamı, bir karbon kaynağı olarak Oksidatif Hidrotermal Çözünme (OHD) 13,14 ile işlenmiş bir mısır koçanı bulamacı içerecek şekilde modifiye edildi. Modifiye edilmiş sondaj deliği karışık kültür ortamı, 0.4 mL/dk hızında 44 gün boyunca biyoreaktöre pompalandı. 23. günde, ABD'nin Nevada eyaletinin Ölüm Vadisi bölgesindeki BLM-1 sondaj deliğinden elde edilen bir aşı eklendi15. Biyoreaktörden alınan sıvı numuneler, 1, 8, 15, 22, 23 (aşılamadan sonra), 30, 37 ve 44. günlerde bir numune alma şişesinde toplandı.
İnokulum kültürünün (ve biyoreaktör sedimentinin aşılama öncesi otoklavda hayatta kalan sakinlerinin) genel durumunu izlemek için, biyoreaktör sıvı numuneleri doğrudan hücre sayımları ile gözlemlendi. Örneklenen sıvının doğrudan hücre sayımı Petroff-Hauser hemositometresi ile yapıldı. Biyoreaktörün mikrobiyal üyelerinin kimliğini öğrenmek için, biyoreaktör sıvı örneklerinden DNA ekstrakte edildi ve 16S rRNA genleri Yeni Nesil Dizileme (NGS) ile analiz edildi. NGS verileri, MiSeq SOP16'yı takiben mothur kullanılarak kurum içinde işlendi.
Aşılamadan önce, doğrudan hücre sayıları genellikle 1.0 × 106 hücre / mL'lik saptama sınırının (bdl) altındaydı. 23. gün (aşılamadan sonra) 2.6 × 106 hücre/mL'lik düşük hücre sayısına sahipken, sonraki 30, 37 ve 44. günlerde hücre sayısı 1.0 × 107 hücre/mL'nin üzerindeydi (Şekil 3). Hücre sayımları 1, 8 ve 22. günlerde b.d.l. olmasına rağmen, otoklavlamadan sonra bile tortuda aşılama öncesi mikroorganizmaların bazal varlığını gösteren her zaman noktasından NGS için DNA ekstrakte edildi. Mevcut ana cins (her bir Operasyonel Taksonomik Birimdeki (OTU) okuma sayısına göre belirlenir) 8, 15 ve 22. günlerde stabildi ve Geobacillus olarak tanımlandı. 23. günde BLM-1 aşısı ile aşılamadan sonra, Geobacillus artık baskın değildi ve çoğunlukla çalışmanın sonuna kadar varlığını sürdüren çok sayıda küçük cinsle birlikte yeni ana cinsler ortaya çıktı (Şekil 4). Bunlardan, BLM-1 aşısının biyoreaktör içinde aktif ve dinamik olarak değişen bir kültür olduğu sonucuna vardık.
NGS verilerinin ek bir çalışması, "mikrobiyal karanlık madde" üyelerini ortaya çıkardı. "Sınıflandırılmamış" veya "kültürlenmemiş" kelimelerini içeren atanmış taksonomik adlara sahip OTU'lar, "mikrobiyal karanlık madde" üyelerini içeren OTU'lar için bir vekil olarak kullanıldı. NGS verileri 44. gün için toplandı (BLM-1 sondaj deliğinden mikroorganizmalarla aşılama sonrası son gün) ve aşılama öncesi verilerde (1, 8, 15 veya 22. günler) okunan OTU'ları içermeyecek şekilde filtrelendi, çünkü bu OTU'ların aşılamada olması muhtemel değildi. Filtrelenmiş 44. gün NGS verisi 1.844 OTU ve 3.396 okuma içeriyordu. Bunlardan 366 OTU (%20) ve 925 okuma (%27) filum düzeyinde sınıflandırılmamış, 1252 OTU (%68) ve 2357 okuma (%69) cins düzeyinde sınıflandırılmamış veya kültürlenmemiştir. Kısa vadeli olsa da, bu vekil tarafından, bu pilot çalışma, "mikrobiyal karanlık maddenin" üyelerini kültürlemek için çevresel olarak bilgilendirilmiş medyaya sahip bir biyoreaktörün potansiyelini desteklemektedir.
Şekil 1: Anaerobik kültür için kullanılan özel tasarım borosilikat biyoreaktörün şeması. (A) Bir taraftan biyoreaktör görünümü. (B) A'yı z ekseni etrafında 90° (saat yönünde) döndürmek görünümü verir). (C) Biyoreaktörün üstten görünümü. Ceketli tasarım, su veya yağ ile sıcaklık kontrolüne izin verir. İki ceket portu, B'deki görünümün sağ tarafında görülebilir. İç hazne herhangi bir türde tortu ile doldurulabilir veya planktonik kültür için tortudan boş bırakılabilir. Üç örnekleme portu ( A'daki görünümün sağ tarafında görülür), biyoreaktör kolonunun farklı derinliklerinde malzemenin çıkarılmasını mümkün kılar. Standart 45, 18 ve 14 GL açıklıkları, 1-6 ay boyunca gaz geçirmez bir sızdırmazlık sağlayacak Teflon veya bütil septa kullanılarak kapatılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Aktif biyoreaktör düzeneği. Fotoğrafta soldan sağa sunulan cam eşyalar (A) 8 L damacana, (B) biyoreaktör (bkz. Şekil 1) ve (C) örneksiz yakalama şişesidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Biyoreaktör çalışmasından doğrudan hücre sayımı. Biyoreaktör içindeki mikrobiyal popülasyonlar, 0.02 mm'lik bir Petroff-Hauser hemositometre hücre sayım odası kullanılarak izlendi. 23. günün başında aşı eklendi. 1, 8 ve 22. günler için hücre sayıları algılama sınırının altındaydı. Doğrudan hücre sayımının etkili saptama sınırı 1 × 106 hücre/mL'dir. Kısaltma: b.d.l. = algılama sınırının altında. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Biyoreaktör Yeni Nesil Dizileme. OTU'lar, biyoreaktör çalışmasının her bir zaman noktasından benzersiz OTU'lara ait okumaların yüzdesini gösteren yığılmış çubuk grafiklerle temsil edilir. Benzersiz OTU'lar, bir cins kesiminde ilişkili taksonomilerine atandı. 'Diğer' cinsi, her bir zaman noktasında okunanların %10'undan daha az olan tüm cinsler olarak tanımlanır. Temsil edilen toplam DNA okuma sayısı 506.358'dir. Her bir zaman noktası için okuma sayısı grafiğin üst kısmında listelenir. 23. günün başında aşı eklendi. Kısaltma: OTU = Operasyonel Taksonomik Birim. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Bileşik | Toprak karışık kültür miktarı | Sondaj karışık kültürü için miktar | Sondaj deliği izole metanojen miktarı |
| Damıtılmış su | 1000.0 mL | 1000.0 mL | 1000.0 mL |
| HEPES ÜNİVERSİTESİ | 3.600 gr | - | - |
| MOPLAR | - | - | 2.000 gr |
| MgCl2 ∙6 H2O | 0.400 gr | 0.400 gr | 0.400 gr |
| Kartal | 0.500 gr | 0.250 gr | 0.500 gr |
| NH4Cl | 0.268 gr | 0.268 gr | 0.268 gr |
| Na2YANI4 | - | 0.284 gr | 1.500 gr |
| Na2HPO4 ∙2 H2O | - | - | 0.356 gr |
| pH 6'da 1 M KH2PO4 | 1.0 mL | 1.0 mL | - |
| pH 9.4'te 1 M H3BO3 | 1.0 mL | 1.0 mL | 1.0 mL |
| Eser mineraller | 1.0 mL | - | 1.0 mL |
| Vitamin | - | - | 1.0 mL |
| 1 mg / mL sodyum resazurin | 0,4 mL | 0.3 mL | 0,4 mL |
| pH ayarlaması | - | 7.0 | 7.0 |
| pH ayarlaması | - | NaOH (Nano Değer) | KOH |
| Kuluçka sıcaklığı | 25 °C | 60 °C | 47 °C |
Tablo 1: Medya kompozisyonu. Her ortam için bileşiklerin ve fiziksel parametrelerin listesi. Sunulan medya naiftir; Karbon ve enerji kaynakları içermezler, çünkü bunlar okuyucunun mikroorganizmalarına ve ilgilendiği çevreye özgü olabilir ve bunlar tarafından bilgilendirilmelidir. Olası karbon ve enerji kaynağı ilaveleri hakkında fikirler için tartışma bölümüne bakın.
Ek Dosya 1: Gaz manifoldu kurulumu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolün orta üretim bölümü (bölüm 1) yapısını, yayınlanmasından bu yana yaygın olarak kullanılan Miller ve Wolin17'nin değiştirilmiş Hungate tekniğine borçludur. Bu genişletilmiş protokolün pratikliği, tanımlayıcı doğasından ve mikroorganizmaların yerinde edinilmesiyle eşleşmesinden kaynaklanmaktadır. Çevresel olarak bilgilendirilmiş ve simüle edilmiş ortam içeren kültür şişeleri, "mikrobiyal karanlık maddenin" yerinde edinilmiş eski üyelerini başarılı bir şekilde kültürlemek için kullanılmıştır: anaerobik yeraltı bakterileri Thermoanaerosceptrum fracticalcis suşu DRI1318, Caldiatribacterium inferamans suşu SIUC1 (erişim numarası MT023787; el yazması hazırlık aşamasındadır) ve Anaerothermus hephaesti SIUC3 suşu (erişim numarası MK618647; hazırlık aşamasında olan el yazması) ve anaerobik yeraltı bakteri karakterize edilmemiş suşu DRI14 (erişim numarası KR708540).
Bu protokolün odak noktalarından biri, yüzey ve yüzey altı anaerobik ortamlara ve mikroorganizmalara son derece uyarlanabilir hale getirilmesidir. İlk olarak, ortam bileşiminin, ilgilenilen ortamın bileşimini yansıtacak şekilde değiştirilmesi teşvik edilir. Örneğin, hem Na+ hem de Cl- için 3.000 mg/L iyonik konsantrasyonlara sahip bir ortamı simüle ederken tarife 3.000 mg/L NaCl eklenebilir; veya 1:1 hacimsel kumtaşı/şeyl oranına sahip bir ortamı simüle ederken biyoreaktöre 650 mL kum ve 1 mL şeyl yerleştirilebilir. İkinci olarak, ortam bileşimi, ilgilenilen belirli mikroorganizmaların büyümesini teşvik etmek için değiştirilebilir. Özellikle, bu makaledeki üç medya gibi naif medya, bu tür değişikliklere hazırdır ve bunlara bağımlıdır. Karbon ve enerji kaynaklarına örnek olarak fumarat18, pepton18, selüloz içeren organik madde19, asetat20, maya özütü19,20, ksilitol (SIUC1 suşu), format (SIUC3 suşu) veH2/CO2, sitrat ve glikoz gibi diğer potansiyel kaynaklar bulunur. Son olarak, ortam bileşimi istenen çalışmaya bağlı olarak değiştirilebilir. Örneğin, temsili sonuçlar bölümünde açıklanan çalışmanın ana ilgi alanı, temsili yeraltı anaerobik mikroorganizmalarının benzersiz bir karışık organik bulamaca (OHD13,14 tarafından işlenen bir mısır koçanı bulamacı) nasıl tepki vereceğini keşfetmekti; Bu nedenle, tarifi daha geleneksel seçenekler yerine bu karbon kaynağını içeriyordu. Spesifik çalışmalar için diğer potansiyel değişiklikler arasında biyoremediasyon çalışmaları için plastiklerin, asitlerin ve ağır metallerin veya diğer ksenobiyotiklerin eklenmesi; katma değerli depolimerize ürün çalışmaları için selüloz ve plastik gibi inatçı karbon polimerlerinin eklenmesi; ve küçük ölçekli kompost ve diğer tarımsal çalışmalar için gübre ve bitki atıklarının eklenmesi.
pH, Oksidasyon İndirgeme Potansiyeli (ORP) ve Çözünmüş Oksijen (DO) ölçümleri gibi bir ortamın indirgeyici sonrası analizi isteniyorsa, bu, o partinin karakterini güvenle anlamak için temsili sayıda orta şişeden fedakarlık edilerek dolaylı olarak gerçekleştirilebilir. Kapalı bir orta boy şişeyi havaya maruz bıraktıktan sonra, ORP ve DO okumalarının açıldıktan sonra 1 dakikadan kısa sürede alınması şiddetle tavsiye edilir. Oksijene bağımlı olmayan ölçümler (örn., pH) ilk açılıştan sonra acil olmayan bir şekilde alınabilir. Titiz anaerobik mikroorganizmalar tipik olarak büyüme için -200 mV< ORP değerlerine ihtiyaç duyar. Ortam, > -200 mV'luk bir ORP değeri ve/veya DO değerleri >0.40 mg/L) ile sonuçlanırsa, ortamı daha da azaltmak için ek Na2S (0.1-0.2 g / L) veya başka bir indirgeyici (örneğin, titanyum sitrat, L-sistein, askorbik asit) kullanılabilir.
Resazurin genellikle bir oksijen göstergesi olarak kullanılır (bu protokolde olduğu gibi); Bununla birlikte, oksijen bir çözeltinin redoks potansiyelini değiştirirken dolaylı olarak oksijenin varlığını gösteren bir redoks göstergesi21'dir. Çözeltideki resazurin başlangıçta mavi renkte görünür. İndirgeyici maddelere maruz kaldığında, çözelti geri dönüşü olmayan bir şekilde pembe bir renge kayar. Çözelti daha da azaltıldığında, geri dönüşümlü olarak renksizliğe geçer ve oksitlenme üzerine pembeye döner. Yazarlar, resazurin içeren azaltılmış ortamın maviden pembeye kaydığı, ancak renksizliğe geçemediği örnekleri gözlemlediler. Bununla birlikte, yazarlar ayrıca bu tür ortamların otoklavlamadan sonra genellikle renksizliğe geçtiğini ve ortamın kaynatılması ve yıkanması için harcanan sürenin artmasının, indirgeyiciler eklendikten sonra resazurinin renksiz formuna geçmesine izin verdiğini gözlemlemişlerdir. İstenirse, ortamdaki oksijen konsantrasyonu çözünmüş oksijen probu ile doğrulanabilir.
Bu biyoreaktörleri çalıştırmak için gereken tüm malzemeler ve ısmarlama cam biyoreaktörlerin kendileri ~ 5 bin doları geçmedi (bu, su banyoları, pompalar ve inkübatörler gibi destek ekipmanlarının zaten mevcut olduğunu varsayar). Bu anaerobik yetiştirme teknikleri, 10 bin > dolardan başlayabilen ticari otomatik biyoreaktörlere kıyasla ekonomik olarak dostudur. Ek olarak, birçok ticari biyoreaktör, karşılaştırma dinamiğini değiştiren ve daha küçük araştırma laboratuvarlarının/üniversitelerin sürekli olarak değiştirmesi için uygun maliyetli olmayan tek kullanımlık reaktör kaplarına geçiyor. Ek olarak, ticari sistemler, titiz mikroorganizmaların yetiştirilmesinin başarısını etkileyecek kimyasal önyargılara (kullanılan plastiklerden, contalar/bağlantı parçaları üzerindeki gresten veya kimyasal olarak arıtılmış sudan) sahip olabilir. Anaerobik bir çevresel numuneyi toplamak için düşük maliyet, özelleştirilebilirlik ve çok yönlülük, aşılanabilen bilgili bir ortamla birlikte, çalışma için zenginleştirmeler üretme ile sonuçlanır, benzersiz mikroorganizmalar edinme şansını büyük ölçüde artırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar, yıllar içinde bu teknikleri etkileyen/geliştiren bilgi ve mentorluk soyunu kabul etmek istemektedir. Eski bir yüksek lisans öğrencisi, doktora sonrası ve şu anki profesör olarak Dr. Hamilton-Brehm, anaerobik teknikleri öğretmek için zaman ayıranlara şükran borçludur: Dr. Mike Adams, Dr. Gerti Schut, Dr. Jim Elkins, Dr. Mircea Podar, Dr. Duane Moser ve Dr. Brian Hedlund. Nature Conservancy ve American Rivers, bu çalışmayı sırasıyla G21-026-CON-P ve AR-CE21GOS373 hibeleriyle destekledi. Bu yazıda ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu, sonuç veya tavsiye yazarlara aittir ve Nature Conservancy veya American Rivers'ın görüşlerini yansıtmayabilir. Bu çalışma, Gelişmiş Enerji Kaynakları Kurulu aracılığıyla verilen finansmanı minnetle kabul eden SIU Gelişmiş Enerji Enstitüsü'nden bir hibe ile desteklenmiştir. NGS, LC Sciences tarafından gerçekleştirilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Materials | |||
| 1 L borosillicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 1 mL syringe with slip tip | Fisher Scientific | ||
| 10 mL glass pipette | Fisher Scientific | ||
| 100 mL culture bottle | Fisher Scientifc | ||
| 20 mm hand crimper | Fisher Scientifc | ||
| 23 G needle | Fisher Scientifc | ||
| 500 mL borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| Aluminum seal | Fisher Scientifc | ||
| Cannula, 31.5 cm length | Fisher Scientific | ||
| Cannula, 6 cm length | Fisher Scientifc | ||
| Corer | Giddings Machine Company | Assembled from company parts | |
| Gas manifold | Swagelok | Assembled from many different parts | |
| Lighter | Lowe's | ||
| N2 gas | Airgas | ||
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | ||
| Rubber stopper (for GL45 bottles) | Glasgeratebau OCHS | ||
| Rubber stopper (for culture bottles) | Ace Glass | ||
| Stirring hot plate | Corning | ||
| Trace minerals | ATCC | ||
| Vitamins | ATCC | ||
| Bioreactor-specific Materials | |||
| #10 rubber stopper | Ace Glass | ||
| #7 rubber stopper | Fisher Scientifc | ||
| 1 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 1/4" hose barb ball valve | Amazon | ||
| 10 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 3.5 L borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 5/16" - 1/4" hose barb adapter fitting | Amazon | ||
| 60 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 8 L borosillicate carboy | Allen Glass | ||
| Angled hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-20 | |
| Balloon | Party City | ||
| Borosillicate bioreactor | Allen Scientific Glass | Custom made upon request | |
| Drill | Lowe's | ||
| Female luer lock adapter coupler | Amazon | ||
| GL14 open top cap | Ace Glass | 7621-04 | |
| GL18 open top cap | Ace Glass | 7621-08 | |
| GL45 open top cap | Ace Glass | ||
| PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap | Ace Glass | 7625-06 | |
| PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap | Ace Glass | 7625-07 | |
| Ring stand | Fisher Scientific | ||
| Ring stand chain clamp | Amazon | ||
| Ring stand clamp | Fisher Scientific | ||
| Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od | Grainger | 55YG13 | |
| Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od | Grainger | ||
| Straight hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-22 | |
| Three-way stopcock | Amazon | ||
| Two-way stopcock | Amazon | ||
| Ultra low flow variable flow mini-pump | VWR | ||
| Water bath | Fisher Scientifc | ||
| White rubber septum for 13-18 mm od tubes | Ace Glass | 9096-49 | |
| Wire | Lowe's | ||
| Zip tie | Lowe's |
References
- Staley, J. T., Konopka, A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).
- Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes. MSystems. 3 (5), e00055 (2018).
- Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
- Marcy, Y., et al. Dissecting biological "dark matter" with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).
- Giovannoni, S., Stingl, U. The importance of culturing bacterioplankton in the'omics' age. Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).
- Stewart, E. J.
- Dedysh, S. N. Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps. Front. Microbiol. 2, 184 (2011).
- Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. Isolating" uncultivable" microorganisms in pure culture in a simulated natural environment. Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).
- Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012 (2011).
- Tyson, G. W., et al. Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community. Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).
- Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).
- Merino, N., et al. Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow. Sci. Total Environ. 842, 156768 (2022).
- Anderson, K. B., Creeping, J. C., Huggett, W. W. Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791. , Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf (2013).
- Anderson, K. B., Crelling, J. C., Huggett, W. W., Perry, D. M. Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512. , Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf (2018).
- Mullin, S. W., et al. Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer. Front. Microbiol. 11, 536535 (2020).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Miller, T. L., Wolin, M. A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes. Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin. Front. Microbiol. 10, 2224 (2019).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).
- Twigg, R. S.
