Summary
本文的重点是详细说明为从环境中获得的挑剔厌氧微生物制作培养基的最佳实践。这些方法有助于管理厌氧培养物，并可用于支持难以捉摸的未培养微生物（“微生物暗物质”）的生长。
Abstract
厌氧微生物的培养依赖性研究取决于方法学能力。这些方法必须为厌氧微生物创造和维持合适的生长条件（例如，pH值和碳源），同时还允许在不影响人工环境的情况下提取样品。为此，以 原位 环境为依据并模拟原位环境的方法对从该环境中培养微生物有很大帮助。在这里，我们概述了一种用于培养陆地表面和地下微生物的 原位 知情和模拟厌氧方法，强调以最小的扰动收集厌氧样本。该协议详细介绍了可定制厌氧液体培养基的生产，以及厌氧微生物的环境获取和 体外 生长。该协议还涵盖了厌氧生物反应器的关键组件，该反应器用于沉积物的环境模拟和环境获取培养物的厌氧液体培养基。我们纳入了在生物反应器的整个生命周期内来自维持的微生物组的初步下一代测序数据，其中活性培养物根据实验碳源进行动态调整。
Introduction
大多数微生物仍未培养;通过显微镜观察到的细胞之间的巨大差异与使用琼脂平板成功培养的少数微生物形成鲜明对比。Staley 和 Konopka 将这种差异命名为“大板块计数异常”1。宏基因组学和宏转录组学数据支持估计的未解释多样性，这些数据显示许多新属分布在几种不同环境的等级丰度曲线中 2.已观察到的微生物（通常通过微生物群落的随机鸟枪测序）但尚未培养的微生物被称为“微生物暗物质”3,4。
在组学时代，培养微生物对于全面评估基因组数据和验证现有基因的功能/表型仍然至关重要。对培养的微生物进行测序仍然是自信地获得完整基因组的唯一方法，直到鸟枪法宏基因组学和来自环境的宏基因组组装基因组等技术变得绝对可靠5。基因组评估与培养的微生物相结合，为理解“微生物暗物质”提供了强有力的推论。“微生物暗物质”的许多成员发挥着影响营养物质和其他元素循环以及有价值的天然产物生产的关键功能，支持生态系统并执行生态服务。从医学角度来看，目前销售的所有药品中约有一半是细菌产品和衍生物，对未培养物种的分析被怀疑揭示了未来的抗生素。为了获得这一未开化的大多数，必须增加各种培养方法6。在“微生物暗物质”的成员中，厌氧寡营养微生物在很大程度上被低估了，并且可能具有生态和工业上有价值的生化途径7，使其成为重要的培养目标。然而，厌氧寡养微生物比好氧和共养微生物更难培养，因为通常需要更长的孵育时间、苛刻的条件（例如，特殊的非标准 体外 温度）以及使用专门的培养基配方。
目前开发培养“微生物暗物质”成员的技术，包括新型厌氧寡营养微生物，极大地提高了我们的理解，并增加了这些微生物在系统发育树中的代表性。目前使用知情培养基培养新型微生物的技术（即，利用感兴趣的微生物知识获得的培养基）可以分为三种不同的方法。第一种方法需要直接去除环境中的离散部分，以便转移到体外生长室中，该室已经在膜内包含感兴趣的微生物。离散部分（例如，海水）的作用是为感兴趣的微生物提供它们在原位使用的地球化学栖息地，而膜则阻止细胞的运动（感兴趣的细胞将保留在内部;与离散部分一起到达的外来细胞将保留在外面）。通过在自然生境中加入天然可利用的化合物，可以培养出这些微生物8。第二种方法利用宏转录组学或基因组学来阐明代谢能力，为靶向培养基设计的窄培养参数提供线索。这种方法提供了一种生态生理学特征，可用于靶向环境中特定类型微生物的富集。培养基的规定迎合了存在的已鉴定基因，这些基因被认为支持目标微生物以减少富集多样性，9,10。需要注意的是，基因组信息不能直接推断基因的表达，而转录组信息可以。
第三种方法包括环境知情和模拟媒体，与第一种方法不同，第一种方法不模拟媒体，而是直接使用环境作为媒体来源。第三种方法需要对含有感兴趣微生物的野外地点的地球化学进行环境勘察。有了这些知识，就可以确定主要成分和物理参数，以生产环境知情的模拟介质。然后，培养基将环境中含有微生物的沉积物或液体直接注入培养基中。在培养微生物学家无法获得足够数量的源环境（如第一种方法所需）或适当的宏转录组学或基因组数据（如第二种方法所需）的情况下，该方法特别有价值。
以下协议是第三种方法的示例;它以感兴趣的环境为依据，旨在模拟感兴趣的环境。针对在现场获得的不同厌氧微生物培养物的三种朴素培养基配方在协议中并行提出。所代表的三种培养物是源自土壤的混合培养物（以下简称土壤混合培养物）、源自钻孔内的混合培养物（以下简称钻孔混合培养物）和源自钻孔内的分离产甲烷菌（以下简称钻孔分离产甲烷菌）。此处分享的媒体配方中的化合物标识和数量仅供参考;它们能够并鼓励根据读者的环境和感兴趣的微生物进行定制。
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Protocol
1.可定制厌氧液体介质的生产
- 培养瓶培养基（产量 500 mL）
- 测量化合物并将其添加到 1 L 瓶中，并使用 表 1 中与读者感兴趣的培养物相对应的色谱柱调节 pH 值（ 表 1 中的量记录为 1,000 mL 的产量，相应调整）。通过旋转瓶子将化合物混合至均匀。
- 通过微波炉加热瓶子 5-6 分钟，将液体加热至沸腾。经常打开微波炉，用耐热手套轻轻旋转液体。如果液体冒泡后静止不动，请迅速打开微波炉;否则，液体可能会迅速膨胀并溢出瓶子。
- 将无菌的 10 mL 玻璃移液器连接到 N2 气体歧管装置上（基于 Balch 等人 11 的设计，但不需要加热铜柱来加热纯度的 N2 气体;有关气体歧管的更多信息，请参阅 补充文件 1 ）。打开歧管排出 O2 并让 N2 气体流出。
- 将移液器吸头放入液体中并调节气体流量，使气泡具有适度的活力。用 N2 冲洗液体，直到瓶子不再太热而无法触摸。
注意：这取决于媒体的内容，但通常需要 ~20 分钟。 - 在等待瓶子冷却的同时，放置 10 个无菌 100 mL 培养瓶;或者，如果准备用于收集土壤混合培养物的培养基，则放置两个无菌的 500 mL 瓶。
- 培养基瓶摸起来凉爽后，将移液器吸头向上拉入瓶的顶部空间。加入 0.125 g NaHCO3 和 0.300 g Na2S∙9 H2O，等待刃天青变无色。
注意： Na2S∙9 H2O 具有腐蚀性、毒性和刺激性。搬运时使用个人防护设备，接触金属工具后彻底冲洗干净。 - 在等待刃天青变色的同时，将金属插管连接到气体歧管装置上，然后将插管尖端放入培养瓶中。将N2 进入瓶子的流量调整到适度的速率，以便在后续步骤中添加的液体不会因气体流动而晃动。
- 刃天青无色后，将 50 mL 液体等分到每个培养瓶中，或将 250 mL 液体等分到每个 500 mL 瓶中。
- 取下套管后，立即用匹配尺寸的橡胶塞盖住每个瓶子。用铝制密封件（用于培养瓶）或 GL45 开顶螺旋盖（用于 500 mL 瓶）固定塞子。
- 将瓶子放入可高压灭菌的垃圾箱中，并用自来水填充垃圾箱，直到水位与瓶子中的水位相匹配。
注意： 这将确保瓶子不会因高压灭菌时玻璃上的温差引起的应力而破裂。 - 将瓶子在121°C下高压灭菌30分钟。
- 生物反应器培养基（生产 8 L）
- 细口大瓶的制备
- 打开 1/4“ （6.4 mm） 软管倒钩球阀的阀门。将两根 6 厘米长的 1/4 英寸（6.4 毫米）内径 （ID） 和 1/2 英寸（12.7 毫米）外径 （OD） 硅胶管连接到软管倒钩球阀的两端。
- 将 5/16“-1/4” （7.9 mm-6.4 mm） 软管倒钩适配器接头连接到组件的一端。将组件的另一端连接到 8 升细口大瓶的软管倒钩上。
- 使用扎带固定细口大瓶软管倒钩和管道之间的连接，以及软管倒钩适配器接头和管道之间的连接。
- 将大瓶与组件一起在121°C下高压灭菌30分钟。
- 中等产量
- 关闭 8 L 细口大瓶组件上的软管倒钩球阀的阀门。
- 测量化合物并将其添加到 8 L 细口大瓶中，并使用 表 1 中与读者感兴趣的培养物相对应的色谱柱调节 pH 值（ 表 1 中的量记录为 1,000 mL 的产量，相应调整）。加入搅拌棒并使用搅拌热板将化合物混合至均匀。
- 用搅拌热板将液体加热至沸腾。让液体沸腾 30 分钟。
注意：将液体加热至沸腾取决于介质的内容，但可能需要 2-3 小时。 - 将无菌的 10 mL 玻璃移液器连接到 N2 气体歧管装置上（基于 Balch 等人 11 的设计，但不需要加热铜柱来加热纯度的 N2 气体;有关气体歧管的更多信息，请参阅 补充文件 1 ）。打开歧管排出 O2 并让 N2 气体流出。
- 关火，然后将移液器吸头放入液体中，并调节气体流量，使气泡适度活跃但不溢出。用N2 冲洗液体30分钟。
- 将移液器吸头向上拉入细口大瓶的顶部空间。加入 2.0 g NaHCO3 和 4.8 g Na2S∙9 H2O，等待刃天青变无色。
注意： Na2S∙9 H2O 具有腐蚀性、毒性和刺激性。搬运时使用个人防护设备，接触金属工具后彻底冲洗干净。 - 一旦刃天青无色，取出玻璃移液管并立即用 #10 塞子盖住细口大瓶。将一根电线缠绕在塞子上并绕在大瓶的边缘以固定塞子。
- 细口大瓶的制备
2. 环境厌氧微生物 的原位 采集
- 表面厌氧样品采集（土壤混合培养）
- 将上述混合土壤培养基的瓶子和取芯器带入田间。
注：作者使用了 Giddings 2 5/8“ 标准锥形土壤钻头（材料表）。但是，可以使用任何可以采样到所需深度的土壤取芯器或抹子。 - 将取芯器推入沉积物中，直到样品收集滚筒的顶部与沉积物表面齐平。
- 将取芯器旋转 90° 以释放芯材并向上拉，直到样品从环境中提取。
- 在松散的沉积物中（例如在湿地取样时可能遇到的情况），在提取时用新的丁腈手套手覆盖岩芯的底部，以防止样品在提取时掉落或扩散到水中。
- 用肉眼快速接近距核心底部 6-7 厘米处。用新的丁腈手套手切入芯中，将底部分开 6-7 厘米。
- 立即将芯底转移到培养瓶中。如果土壤/沉积物太大，请迅速将其成型以使其更容易放入瓶子中，尽可能减少暴露在好氧环境中。
- 转移样品后，立即重新定位塞子并用螺旋盖将其固定到位。
- 保持样品凉爽。返回实验室后，将收集瓶在4°C冷藏。
- 将上述混合土壤培养基的瓶子和取芯器带入田间。
- 地下厌氧样品采集（钻孔混合培养）
- 在气体歧管旁放置一个无菌的 1 L 瓶。用橡胶塞盖住瓶子。将 100% 乙醇滴在塞子上，然后用打火机将其点燃。
- 将无菌 23 G 针头连接到 N2 气体歧管装置。打开歧管排出 O2 ，让 N2 （或 Ar）气体以适度的速度流出。
- 一旦塞子不再着火，将针头插入瓶子中。将第二根未连接到气体歧管的无菌 23 G 针头插入瓶中。冲洗瓶子 1-2 分钟。
- 拔出未连接到气体歧管的针头。给瓶子加压1分钟。拔出剩余的针头。
- 将加压瓶和灭菌的 23 G 针头带到钻孔现场。按照Merino等人的方法从钻孔中抽取液体12。
注意：根据钻孔的方法、连接和流速，这会改变获取水样的策略。如果有连续的水流，请按照步骤 2.2.6 中概述的收集水。就足够了。如果水流是批量收集或低流量，则可以使用替代的进水/出水方法。在所有情况下，尽量减少污染，并尝试确保收集的样品代表所需的采样环境。这是一个广义的概括性陈述，因为根据作者的经验，来自政府或私人站点的每个样本采集事件都必须高度适应可用的可访问性。 - 快速打开瓶子，泵入液体以将瓶子完全装满，然后关闭瓶子。
- 将带到该部位的 23 G 针头插入瓶子的橡胶塞中，以减轻瓶子中的压力。拔出针头。
- 保持样品凉爽。返回实验室后，将收集瓶在4°C冷藏。
3.野外采集的厌氧微生物 体外 生长
- 培养瓶生长
- 摆出一个塞好的N2 无菌瓶和如上所述的培养瓶和收集瓶。将 100% 乙醇滴在塞子上，然后用打火机点燃它们。
- 将 23 G 针头组装到 1 mL 注射器上。一旦塞子不再着火，将针头插入 N2 瓶中并抽出 ~1 mL N2。拔出针头。
- 慢慢按下柱塞以释放 N2。注射器为空后，将针头插入收集瓶并抽取 0.5 mL 环境样品。拔出针头。
- 将针头插入培养瓶并注射样品。拔出针头。
- 旋转瓶子并将其置于温度下的培养箱中，如 表1 或读者感兴趣的环境所示。
注意：使用0.02mm深的Petroff-Hauser血细胞计数器监测培养进展（瓶或生物反应器）。厌氧或挑剔微生物的富集通常无法达到 OD600 可用的细胞密度，其他检测方法对于常规和重复监测是不切实际的。检测限、质量控制和统计计算取决于细胞计数室的类型和用户的需求。
- 生物反应器的增长
- 用改进的注射器制备球囊
- 从三个 10 mL 鲁尔锁注射器（每个最终组件一个）上取下柱塞。从每个注射器上切下法兰并锉削切断的一端，以免刺穿球囊。从改进的注射器中清除所有归档的芯片。
- 通过将一个气球放入另一个气球中来准备一个双倍气球。
- 将双球囊的末端拉伸到改进的 10 mL 注射器上。
- 将外气球的末端与内球囊稍微分开。挤出所有被困在气球之间的空气。
- 在球囊底部拧紧扎带，将球囊固定到注射器上。
- 改性瓶塞的制备
- 从十个 1 mL 鲁尔锁注射器（每个要修改的塞子两个）中取出柱塞。从注射器上切断法兰。
- 摆出两个尺寸为 #10 的橡胶塞（用于 8 升细口大瓶）和三个尺寸的橡胶塞，用于带有 GL45 螺纹饰面的瓶子（用于集水瓶）。使用 1/4 英寸（6.4 毫米）钻头，在每个橡胶塞的顶部钻两个孔，宽度足以使改进的注射器适合，并且足够窄，以便配合气密。
- 将改进的注射器插入橡胶塞的孔中。
- 清洁并在121°C下将改性塞子高压灭菌30分钟。
- 生物反应器组件的准备
- 用70%乙醇对所有旋塞阀，母鲁尔锁适配器连接器和其他不可高压灭菌的生物反应器材料进行消毒，并在121°C下对所有管路（切割成一定长度后），塞子，玻璃棉和其他可高压灭菌的生物反应器材料进行30分钟。
- 将无菌生物反应器（图1 和 图2）放在环架上，并用链带固定。还设置了一个水浴、一个蠕动泵、塞住的 8 L 大瓶装介质（来自协议步骤 1.2）、一个 3.5 L 瓶（非取样集水瓶）和一个 500 mL 瓶（取样集水瓶）。
- 塞住大瓶
- 用改进的注射器放一个气球。将三通旋塞阀连接到注射器的鲁尔锁头。
- 取球囊组件并将三通旋塞阀连接到N2水箱的管道上。转动三向旋塞阀以阻挡向大气打开的一端。
- 打开油箱并用 N2 填充气球。装满后，转动三向旋塞阀以挡住气球的末端。关闭油箱并断开油箱管与三通旋塞阀的连接。
- 依次连接以下内容：三通旋塞阀（带有改进注射器的球囊）、双向旋塞阀、内螺纹鲁尔锁适配器耦合器和改进的塞子之一的鲁尔锁尖端。
- 连接到另一个注射器的鲁尔锁头，连接一个双向旋塞阀。关闭改进的止动器组件上双向旋塞阀的两个阀门。
- 松开固定大瓶未修改尺寸 #10 塞子的电线。快速将未改装的塞子更换为改装的塞子组件，并像以前一样扭动电线，将改装的塞子组件固定到大瓶上。
注意：如果有信心并做好准备，改进的塞子组件可用于在培养基制备的最后一步（步骤 1.2.2.7）塞住大瓶。 - 转动三向旋塞阀以阻挡向大气打开的一端。按顺序打开双向旋塞阀。气球的气体和 8 升大瓶的顶部空间现在已连接。
- 塞住非取样瓶和取样集水瓶
- 用改进的塞子塞住 3.5 L 非取样收集瓶，塞子尺寸适合 GL45 螺纹饰面的瓶子，在塞子底部涂上 70% 乙醇以帮助将其放入瓶中。用 GL45 开顶螺旋盖盖住瓶子。
- 按顺序连接以下内容：带有改进注射器鲁尔锁尖端的球囊、三通旋塞阀、内螺纹鲁尔锁适配器耦合器和改进的塞子注射器之一的鲁尔锁尖端。转动三通旋塞阀以阻挡直接通向大气的一端。
- 连接到另一个注射器的鲁尔锁头，连接一个母鲁尔锁适配器耦合器。
- 对 500 mL 采样集水瓶重复上述三个步骤。
- 管路设置
- 测量生物反应器水套端口与水浴软管倒钩之间的距离。切割两根内径为 3/16 英寸（4.8 毫米）、外径为 3/8 英寸（9.5 毫米）的硅胶管以跨越此距离。
- 将两个带有 GL14 开顶螺旋盖的直软管接头组装在一起。将每个连接到两个管件的一端。
- 将螺旋盖拧到生物反应器水套的端口上。将管子的另一端连接到水浴软管倒钩上，使水从水浴中流出，从生物反应器水套底部进入，从水套顶部退出，然后返回水浴。拧紧管子末端的扎带，将管子固定到水浴软管倒钩上。
- 对于类似于 VWR 超低流量变流量微型泵的泵，将随附的 3/16“ （4.8 mm） 外径开槽管组件穿过泵。
- 测量细口大瓶管组件和蠕动泵管组件之间的距离。切割内径为 3/16 英寸（4.8 毫米）、外径为 3/8 英寸（9.5 毫米）的硅胶管以跨越此距离。
- 将管子的一端连接到细口大瓶管组件的软管倒钩上，另一端连接到蠕动泵管组件的软管倒钩上，定向使介质从细口大瓶流出并流经蠕动泵。
- 测量蠕动泵管组件与生物反应器底部端口之间的距离。切割内径为 3/16 英寸（4.8 毫米）、外径为 3/8 英寸（9.5 毫米）的硅胶管以跨越此距离。
- 将该管的一端连接到蠕动泵管组件的软管倒钩上，然后小心地将另一端连接到生物反应器的底部端口。注意不要使玻璃破裂，但也要确保连接，在管子末端拧紧扎带，将管子固定到生物反应器的底部端口。
- 测量并切割大约 5 英寸（127 毫米）长的 3/16 英寸（4.8 毫米）内径、3/8 英寸（9.5 毫米）外径的硅胶管。
- 将母鲁尔锁适配器连接器连接到三通旋塞阀。将三通旋塞阀的任何一端连接到管道上。
- 组装一个带有 GL14 开顶螺旋盖的弯头软管接头。将其连接到管道的另一端。
- 将螺旋盖拧到生物反应器最顶部的垂直端口上。转动三通旋塞阀以阻挡指向生物反应器的一端。
- 测量最顶部的垂直端口组件与非采样集水瓶组件之间的距离。切割内径为 3/16 英寸（4.8 毫米）、外径为 3/8 英寸（9.5 毫米）的硅胶管以跨越此距离。从两个 1 mL 鲁尔锁注射器上切下法兰，并将它们插入管子的末端。
- 将此管组件的一端连接到最顶部垂直端口组件的三通旋塞阀，并将另一端连接到非采样集瓶组件上的母鲁尔锁适配器连接器。
- 测量最顶部的垂直端口组件和采样集水瓶组件之间的距离。切割内径为 3/16 英寸（4.8 毫米）、外径为 3/8 英寸（9.5 毫米）的硅胶管以跨越此距离。从两个 1 mL 鲁尔锁注射器上切下法兰，并将它们插入管子的末端。
- 将此管组件的一端连接到最顶部垂直端口组件的三通旋塞阀，另一端连接到采样集水瓶组件上的母鲁尔锁适配器连接器。
- 填充生物反应器
- 用白色橡胶隔膜盖住生物反应器的 GL18 端口之一。用 GL18/GL14 尺寸的 PTFE 饰面硅胶隔垫（PTFE 面向玻璃）和开顶螺旋盖盖住另一个 GL18 端口和剩余的垂直裸露的 GL14 端口。
- 用一根 50 厘米长的棒，将 0.9 克玻璃棉装入生物反应器的底部。
- 在121°C下将1.3L沙子高压灭菌30分钟。使用漏斗用沙子填充生物反应器。
注意：根据读者的环境和感兴趣的微生物，其他沉积物类型可以在这里替代。 - 将管子放入生物反应器顶部的N2 罐中，并用N2 冲洗生物反应器顶部空间2分钟。立即用 #7 尺寸的塞子和 GL45 开顶螺旋盖盖住生物反应器。
- 从非取样收集瓶中，断开管道并转动三向旋塞阀以阻挡指向气球的一端。将管子连接到 N2 的储罐到母鲁尔锁适配器连接器，并用 N2 冲洗生物反应器顶部空间 2 分钟。立即重新连接管道并返回三通旋塞阀以阻挡向大气打开的一端。
- 对取样集水瓶重复上述步骤。
- 转动生物反应器最顶部垂直端口的三通旋塞阀，以阻挡指向采样收集瓶的一端。将细口大瓶中的液体泵入生物反应器。暂停泵，排空取样瓶的气球，并根据需要用 N2 填充大瓶的气球。
- 生物反应器充满培养基后，将泵流速设置为 0.6 mL/min（微型泵上的数字值为 40）。
注意：其他读者所需的流速可以在这里替换。 - 设置水浴温度，如 表1 或读者感兴趣的环境所示。
注意：接种物可以在此时或以后添加，具体取决于研究具体情况。如果此时接种，请继续执行步骤 3.2.4.10。如果稍后接种，请继续执行步骤 3.2.5。 - 放置一个收集瓶或接种的培养瓶和一个塞住的 N2 无菌瓶。将 100% 乙醇滴在塞子上，然后用打火机点燃它们。
- 将 23 G 针头组装到 60 mL 注射器上。一旦塞子不再着火，将针头插入 N2 瓶中并抽取 ~50 mL N2。拔出针头。
- 慢慢按下柱塞以释放 N2。注射器空后，将针头插入收集瓶并抽取 50 mL 环境样品。拔出针头。
- 将 23 G 针头换成无菌长金属针头（套管，长度 31.5 厘米）。将长金属针插入生物反应器 GL18 端口上的白色橡胶隔膜。
- 将针头推入沉积物并注射接种物。拔出针头。
- 运行生物反应器维护
- 在生物反应器运行的每一天，执行以下操作：
- 检查水浴液位。如果水量低，请添加更多水（使用蒸馏水通过减少腐蚀和矿物质堆积来延长设备的使用寿命）。
- 检查非取样集水瓶的球囊;满球囊会抑制介质的流动。装满后，转动三向旋塞阀以挡住指向集水瓶的一端。挤压气球将其清空;然后，返回三向旋塞阀以阻挡向大气打开的一端;重复直到气球为空。
- 检查 8 升大瓶的气球。如果电平低，请按顺序关闭双向旋塞阀并断开三通旋塞阀与双向旋塞阀的连接。按照步骤 3.2.3.3.2、3.2.3.3.3 和 3.2.3.3.7 重新填充并重新连接球标组件。
- 检查 8 升大瓶中的介质液位。如果低，组装另一个 8 升大瓶并按照协议步骤 1.2 准备更多培养基。和 3.2.3.3.暂停泵，关闭软管倒钩球阀，快速断开旧大瓶，连接新大瓶。
注意：对于 0.6 mL/min 的流速，每 9 天需要更换一次新培养基。 - 检查非取样集水瓶中的培养基液位。如果已满，请根据步骤 3.2.3.4.1 组装另一个非取样收集瓶。用 N2 冲洗新瓶，用改装的注射器和管子快速断开球囊与旧瓶的连接，然后连接到新瓶。
- 从装满的非取样集水瓶中取出改良的塞子。将液体在121°C高压灭菌30分钟;然后，根据读者的机构政策处理液体。清洁并高压灭菌非取样集水瓶组件的所有部件，以准备下次使用。
- 通过执行以下操作，每 7 天（或读者所需的天数）执行一次采样：
- 转动生物反应器最顶部垂直端口的三通旋塞阀，以阻挡指向非采样集水瓶的一端。收集 250 mL 液体。
注意：对于0.6 mL / min的流速，收集250 mL将需要~7小时。 - 返回生物反应器最顶部垂直端口的三通旋塞阀，以阻挡指向采样集水瓶的一端。断开管路和采样集水瓶与生物反应器最顶部垂直端口的三通旋塞阀的连接。
- 在测试、储存和/或妥善处置采样液后，用改装的注射器清洁采样集瓶组件的所有部件，但球囊除外。将所有部件在121°C下高压灭菌30分钟，但带有改进的注射器和母鲁尔锁适配器连接器的球囊除外。为下一个采样日重新组装。
注意： 强烈建议对零件、盖子、管道和隔垫进行重复或三份冗余，以便在必要时快速维修和更换。
- 转动生物反应器最顶部垂直端口的三通旋塞阀，以阻挡指向非采样集水瓶的一端。收集 250 mL 液体。
- 在生物反应器运行的每一天，执行以下操作：
- 用改进的注射器制备球囊
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Representative Results
在这里，我们显示了使用钻孔混合培养基制备方法和生物反应器设置方法的生物反应器研究的结果，如本文所述。对钻孔混合培养基进行改性，以含有通过氧化水热溶解（OHD）处理的玉米芯浆作为碳源13,14。将改良的钻孔混合培养基以 0.4 mL/min 的速率泵入生物反应器 44 天。在第 23 天，添加了来自美国内华达州死亡谷地区钻孔 BLM-1 的接种物15.在第 1、8、15、22、23 天（接种后）、30、37 和 44 天将来自生物反应器的液体样品收集在采样收集瓶中。
为了跟踪接种物培养物（以及生物反应器沉积物的接种前高压灭菌器存活的居民）的一般状态，通过直接细胞计数观察生物反应器液体样品。使用Petroff-Hauser血细胞计数器对取样液体进行直接细胞计数。为了了解生物反应器微生物成员的身份，从生物反应器液体样品中提取DNA，并通过下一代测序（NGS）分析16S rRNA基因。NGS数据按照MiSeq SOP16在内部使用摩斯进行处理。
接种前，直接细胞计数通常低于 1.0 × 106 个细胞/mL 的检测限 （b.d.l.）。第 23 天（接种后）的细胞计数较低，为 2.6 × 106 个细胞/mL，而接下来的第 30、37 和 44 天的细胞计数超过 1.0 × 107 个细胞/mL（图 3）。尽管在第 1、8 和 22 天的细胞计数为 b.d.l.，但从每个时间点提取 DNA 进行 NGS，表明即使在高压灭菌后，沉积物中也存在接种前微生物的基础存在。存在的主要属（由每个操作分类单元 （OTU） 中的读长数决定）在第 8、15 和 22 天保持稳定，并被鉴定为 Geobacillus。在第 23 天接种 BLM-1 接种物后， Geobacillus 不再占主导地位，并且出现了新的主要属以及许多次要存在的属，这些属在大多数情况下一直保持存在到研究结束（图 4）。由此，我们得出结论，BLM-1接种物是生物反应器内一种活跃且动态变化的培养物。
对NGS数据的另一项研究揭示了“微生物暗物质”的成员。具有包含“未分类”或“未培养”字样的指定分类名称的 OTU 被用作包含“微生物暗物质”成员的 OTU 的代理。收集第 44 天（接种后的最后一天，来自钻孔 BLM-1 的微生物）的 NGS 数据，并过滤以不含在接种前数据中读取的 OTU（第 1、8、15 或 22 天），因为这些 OTU 不太可能存在于接种物中。过滤后的第 44 天 NGS 数据包含 1,844 个 OTU 和 3,396 个读长。其中，366个OTU（20%）和925个reads（27%）在门水平上未分类，1252个OTU（68%）和2357个reads（69%）在属水平上未分类或未培养。虽然是短期的，但通过这个代理，这项试点研究支持了具有环境知情介质的生物反应器培养“微生物暗物质”成员的潜力。
图1：用于厌氧培养的定制设计的硼硅酸盐生物反应器示意图。 （A） 从一侧看生物反应器。（B） 绕 z 轴旋转 A 90°（顺时针）可显示视图）。（C） 生物反应器的俯视图。夹套设计允许用水或油进行温度控制。在 B 视图的右侧可以看到两个护套端口。内室可以充满任何类型的沉积物，也可以留空沉积物进行浮游生物培养。三个采样口（见 视图右侧A）可以去除生物反应器柱不同深度的材料。标准的 45、18 和 14 GL 开口可以使用聚四氟乙烯或丁基隔垫密封，该隔膜可保持气密密封 1-6 个月。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：活性生物反应器组件。 照片中从左到右的玻璃器皿是（A）8升大瓶，（B）生物反应器（见 图1）和（C）非取样集水瓶。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：来自生物反应器研究的直接细胞计数。 使用0.02 mm Petroff-Hauser血细胞计数室监测生物反应器内的微生物种群。在第 23 天开始时添加接种物。第 1、8 和 22 天的细胞计数低于检测限。直接细胞计数的有效检测限为1×106 个细胞/mL。缩写：b.d.l. = 低于检测限。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：生物反应器下一代测序。 OTU 以堆叠条形图表示，表示从生物反应器研究的每个时间点开始属于唯一 OTU 的读数百分比。在属截止处将独特的 OTU 分配给其相关分类。属“其他”被定义为每个时间点读数少于 10% 的所有属。所代表的 DNA reads 总数为 506,358。每个时间点的读取次数列在图表顶部。在第 23 天开始时添加接种物。缩写：OTU = Operational Taxonomic Unit。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 复合 | 土壤混合培养量 | 钻孔混合培养量 | 钻孔分离的产甲烷量 |
| 蒸馏水 | 1000.0毫升 | 1000.0毫升 | 1000.0毫升 |
| 赫佩斯 | 3.600 克 | - | - |
| 拖把 | - | - | 2.000 克 |
| 氯化镁2 ∙6 H2O | 0.400克 | 0.400克 | 0.400克 |
| 氯化钾 | 0.500克 | 0.250 克 | 0.500克 |
| NH4厘升 | 0.268 克 | 0.268 克 | 0.268 克 |
| 钠2SO4 | - | 0.284 克 | 1.500 克 |
| Na2HPO4 ∙2 H2O | - | - | 0.356克 |
| pH 6 时为 1 M KH2PO4 | 1.0毫升 | 1.0毫升 | - |
| pH 9.4 时为 1 M H3BO3 | 1.0毫升 | 1.0毫升 | 1.0毫升 |
| 微量矿物质 | 1.0毫升 | - | 1.0毫升 |
| 维生素 | - | - | 1.0毫升 |
| 1 mg/mL刃天青钠 | 0.4毫升 | 0.3毫升 | 0.4毫升 |
| pH调节至 | - | 7.0 | 7.0 |
| pH调节方式 | - | 二氧化钠 | KOH岛 |
| 孵育温度 | 25 摄氏度 | 60 摄氏度 | 47 摄氏度 |
表 1：媒体组成。 每种介质的化合物和物理参数列表。呈现的媒体是幼稚的;它们不含碳和能源，因为它们可能是特定于读者感兴趣的微生物和环境的，并且应该由读者感兴趣的微生物和环境来告知。有关可能的碳和能源添加的想法，请参阅讨论部分。
补充文件 1：气体歧管设置。请点击此处下载此文件。
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Discussion
该协议的培养基生产部分（第 1 节）的结构归功于 Miller 和 Wolin17 的改进的 Hungate 技术，该技术自发布以来一直被广泛使用。这种扩展方案的实用性来自其描述性以及与微生物 的原位 采集的配对。含有环境知情和模拟培养基的培养瓶已被用于 在原位获得的“微生物暗物质”的前成员中成功培养以下：厌氧地下细菌 Thermoanaerosceptrum fracticalcis 菌株 DRI1318、 Caldiatribacterium inferamans 菌株 SIUC1（登录号 MT023787;手稿正在准备中）和 Anaerothermus hephaesti 菌株 SIUC3（登录号 MK618647;手稿正在准备中）和厌氧地下细菌未表征菌株 DRI14（登录号 KR708540）。
该协议的一个重点是它对地表和地下厌氧环境和微生物具有高度的适应性。首先，鼓励改变介质成分以反映感兴趣环境的成分。例如，当模拟Na+和Cl-离子浓度均为3,000 mg/L的环境时，可以将3,000 mg/L的NaCl添加到配方中;或 650 mL 沙子和 650 mL 页岩可以放置在生物反应器中，当模拟砂岩与页岩体积比为 1：1 的环境时。其次，可以修改培养基组成以促进特定目标微生物的生长。特别是，像本文中的三种媒体这样的幼稚媒体已经准备好并依赖于这种修改。碳和能量来源的例子包括富马酸盐18、蛋白胨18、含纤维素的有机物19、乙酸盐20、酵母提取物19、20、木糖醇（菌株 SIUC1）、甲酸酯（菌株 SIUC3）和其他潜在来源，如 H2/CO2、柠檬酸盐和葡萄糖。最后，培养基组成可以根据所需的研究进行更改。例如，代表性结果部分描述的研究的主要兴趣是发现具有代表性的地下厌氧微生物如何对独特的混合有机浆液（由 OHD13,14 加工的玉米芯浆）做出反应;因此，它的配方包含这种碳源，而不是更传统的选择。针对特定研究的其他潜在修订包括添加塑料、酸和重金属，或其他用于生物修复研究的外源性物质;添加顽固的碳聚合物，如纤维素和塑料，用于增值解聚产品研究;以及添加粪便和植物废物，用于小规模堆肥和其他农业研究。
如果需要对培养基进行还原后分析，例如测量 pH 值、氧化还原电位 （ORP） 和溶解氧 （DO），则可以通过牺牲具有代表性的培养基瓶数量来间接完成，以自信地了解该批次的特性。将密封的培养基瓶暴露在空气中后，强烈建议在打开后 1 分钟内测量 ORP 和 DO 读数。非氧依赖性测量（例如 pH 值）可在初次打开后非紧急进行。挑剔的厌氧微生物通常需要 < -200 mV 的 ORP 值才能生长。如果培养基的ORP值为>-200 mV和/或DO值>0.40 mg/L，则可以使用额外的Na2S（0.1-0.2 g/L）或其他还原剂（例如柠檬酸钛，L-半胱氨酸，抗坏血酸）进一步还原培养基。
刃天青通常用作氧指示剂（如本方案）;然而，它更准确地说是氧化还原指示剂21，当氧气改变溶液的氧化还原电位时，间接地指示氧气的存在。溶液中的刃天青最初呈蓝色。暴露于还原剂后，溶液不可逆地转变为粉红色。当溶液进一步还原时，它可逆地转变为无色，并在氧化后恢复为粉红色。作者观察到含有刃天青的还原培养基从蓝色变为粉红色但未能变为无色的情况。然而，作者还观察到，这种培养基在高压灭菌后经常变成无色，并且煮沸和冲洗培养基所花费的时间增加通常允许刃天青在添加还原剂后转变为无色形式。如果需要，可以使用溶解氧探头验证介质中的氧浓度。
运行这些生物反应器和定制的玻璃生物反应器本身所需的所有材料不超过 ~$5K（这假设支持设备已经可用，例如水浴、泵和培养箱）。与起价>为 10 美元的商业自动化生物反应器相比，这些厌氧培养技术在经济上是友好的。此外，许多商业生物反应器正在转向一次性使用的反应器容器，这改变了比较的动态，并且对于较小的研究实验室/大学来说，不断更换并不划算。此外，商业系统可能存在制造化学偏差（来自使用的塑料、垫圈/配件上的油脂或经过化学处理的水），这将影响培养挑剔微生物的成功。收集厌氧环境样品的低成本、可定制性和多功能性，结合可接种的知情培养基，从而产生用于研究的富集物，大大增加了获得独特微生物的机会。
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Disclosures
作者声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
作者要感谢多年来影响/发展这些技术的信息和指导的传承。Hamilton-Brehm 博士作为前研究生、博士后和现任教授，感谢那些花时间教授厌氧技术的人：Mike Adams 博士、Gerti Schut 博士、Jim Elkins 博士、Mircea Podar 博士、Duane Moser 博士和 Brian Hedlund 博士。大自然保护协会和美国河流协会分别通过赠款 G21-026-CON-P 和 AR-CE21GOS373 支持这项工作。本文中表达的任何意见、发现、结论或建议均为作者的观点，并不一定反映大自然保护协会或美国河流协会的观点。这项工作得到了SIU先进能源研究所的资助，该研究所感谢通过先进能源委员会授予的资金。NGS由LC Sciences进行。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Materials | |||
| 1 L borosillicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 1 mL syringe with slip tip | Fisher Scientific | ||
| 10 mL glass pipette | Fisher Scientific | ||
| 100 mL culture bottle | Fisher Scientifc | ||
| 20 mm hand crimper | Fisher Scientifc | ||
| 23 G needle | Fisher Scientifc | ||
| 500 mL borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| Aluminum seal | Fisher Scientifc | ||
| Cannula, 31.5 cm length | Fisher Scientific | ||
| Cannula, 6 cm length | Fisher Scientifc | ||
| Corer | Giddings Machine Company | Assembled from company parts | |
| Gas manifold | Swagelok | Assembled from many different parts | |
| Lighter | Lowe's | ||
| N2 gas | Airgas | ||
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | ||
| Rubber stopper (for GL45 bottles) | Glasgeratebau OCHS | ||
| Rubber stopper (for culture bottles) | Ace Glass | ||
| Stirring hot plate | Corning | ||
| Trace minerals | ATCC | ||
| Vitamins | ATCC | ||
| Bioreactor-specific Materials | |||
| #10 rubber stopper | Ace Glass | ||
| #7 rubber stopper | Fisher Scientifc | ||
| 1 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 1/4" hose barb ball valve | Amazon | ||
| 10 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 3.5 L borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 5/16" - 1/4" hose barb adapter fitting | Amazon | ||
| 60 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 8 L borosillicate carboy | Allen Glass | ||
| Angled hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-20 | |
| Balloon | Party City | ||
| Borosillicate bioreactor | Allen Scientific Glass | Custom made upon request | |
| Drill | Lowe's | ||
| Female luer lock adapter coupler | Amazon | ||
| GL14 open top cap | Ace Glass | 7621-04 | |
| GL18 open top cap | Ace Glass | 7621-08 | |
| GL45 open top cap | Ace Glass | ||
| PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap | Ace Glass | 7625-06 | |
| PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap | Ace Glass | 7625-07 | |
| Ring stand | Fisher Scientific | ||
| Ring stand chain clamp | Amazon | ||
| Ring stand clamp | Fisher Scientific | ||
| Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od | Grainger | 55YG13 | |
| Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od | Grainger | ||
| Straight hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-22 | |
| Three-way stopcock | Amazon | ||
| Two-way stopcock | Amazon | ||
| Ultra low flow variable flow mini-pump | VWR | ||
| Water bath | Fisher Scientifc | ||
| White rubber septum for 13-18 mm od tubes | Ace Glass | 9096-49 | |
| Wire | Lowe's | ||
| Zip tie | Lowe's |
References
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