Summary
Fokus för denna artikel är att beskriva bästa praxis för att göra media för kräsna anaeroba mikroorganismer som förvärvats från en miljö. Dessa metoder hjälper till att hantera anaeroba kulturer och kan användas för att stödja tillväxten av svårfångade oodlade mikroorganismer, den "mikrobiella mörka materian".
Abstract
Odlingsberoende forskning av anaeroba mikroorganismer vilar på metodologisk kompetens. Dessa metoder måste skapa och upprätthålla lämpliga tillväxtförhållanden (t.ex. pH och kolkällor) för anaeroba mikroorganismer samtidigt som de gör det möjligt att extrahera prover utan att äventyra den artificiella miljön. För detta ändamål kan metoder som är informerade av och simulerar en in situ-miljö vara till stor hjälp för att odla mikroorganismer från den miljön. Här beskriver vi en in situ informerad och simulerad anaerob metod för odling av terrestra mikroorganismer på ytan och under ytan, med betoning på anaerob provtagning med minimal störning. Detta protokoll beskriver produktionen av ett anpassningsbart anaerobt flytande medium och miljöförvärv och in vitro-tillväxt av anaeroba mikroorganismer. Protokollet omfattar också kritiska komponenter i en anaerob bioreaktor som används för miljösimuleringar av sediment och anaeroba flytande medier för miljöförvärvade kulturer. Vi har inkluderat preliminära Next Generation Sequencing-data från ett bibehållet mikrobiom under livslängden för en bioreaktor där den aktiva kulturen dynamiskt justerades som svar på en experimentell kolkälla.
Introduction
De flesta mikroorganismer förblir oodlade; Detta stöds av den stora skillnaden mellan celler som observerats genom mikroskopi i kontrast till de få mikroorganismer som framgångsrikt odlats med hjälp av agarplattor. Staley och Konopka kallade denna skillnad för "Great Plate Count Anomaly"1. Den uppskattade oredovisade diversiteten stöds av metagenomiska och metatranskriptomiska data som visar många nya släkten fördelade i rang abundanskurvor från flera olika miljöer2. Mikroorganismer som har observerats (i allmänhet genom slumpmässig hagelgevärssekvensering av ett mikrobiellt samhälle) men som inte har odlats har kallats "mikrobiell mörk materia"3,4.
I -omikernas tidsålder är det fortfarande absolut nödvändigt att odla mikroorganismer för att fullt ut utvärdera genomiska data och verifiera funktionen/fenotypen hos de gener som finns. Sekvensering av odlade mikroorganismer är fortfarande det enda sättet att med säkerhet få fullständiga genom tills tekniker som hagelgevärsmetagenomik och metagenomsammansatta genom från miljön blir ofelbart5. Genomiska utvärderingar i kombination med odlade mikroorganismer ger starka slutsatser för att förstå "mikrobiell mörk materia". Många medlemmar av den "mikrobiella mörka materian" utför viktiga funktioner som påverkar kretsloppet av näringsämnen och andra element och produktionen av värdefulla naturprodukter, stöder ekologiska system och utför ekologiska tjänster. Ur ett medicinskt perspektiv är ungefär hälften av alla läkemedel som idag marknadsförs produkter och derivat av produkter från bakterier, och profilering av oodlade arter misstänks avslöja framtidens antibiotika. För att få tillgång till denna okultiverade majoritet måste en mängd olika odlingsmetoderutökas. Bland medlemmarna i den "mikrobiella mörka materian" är anaeroba oligotrofa mikroorganismer till stor del underrapporterade och har sannolikt ekologiskt och industriellt värdefulla biokemiska vägar7, vilket gör dem till viktiga mål för odling. Anaeroba oligotrofa mikroorganismer är dock svårare att odla än sina aeroba och kopiotrofa motsvarigheter på grund av ofta nödvändiga längre inkubationstider, krångliga förhållanden (t.ex. särskilda icke-standardiserade in vitro-temperaturer ) och användning av specialiserade medierecept.
Nuvarande utvecklingstekniker för att odla medlemmar av den "mikrobiella mörka materian", inklusive nya anaeroba oligotrofa mikroorganismer, har avsevärt förbättrat vår förståelse och ökat representationen av dessa mikroorganismer i det fylogenetiska trädet. Nuvarande tekniker som använder informerade medier för odling av nya mikroorganismer (dvs. medier som erhålls med hjälp av kunskap om den eller de mikroorganismer som är av intresse) kan delas in i tre olika metoder. Den första av metoderna innebär att man direkt avlägsnar en avgränsad del av miljön för överföring till en in vitro-odlingskammare som redan innehåller de mikroorganismer som är av intresse i ett membran. Den diskreta sektionen (t.ex. havsvatten) verkar för att förse mikroorganismerna av intresse med den geokemiska livsmiljö de använder in situ, medan membranet stoppar cellernas rörelse över (celler av intresse kommer att stanna inuti; främmande celler som anlände med den diskreta sektionen kommer att förbli utan). Genom att inkludera föreningar som är naturligt tillgängliga för målmikroorganismer i deras naturliga livsmiljö kan sådana mikroorganismer odlas8. Den andra metoden använder metatranskriptomik eller genomik för att belysa metaboliska förmågor, vilket ger ledtrådar till smala odlingsparametrar för en riktad mediedesign. Detta tillvägagångssätt ger en ekofysiologisk profil som kan användas för att rikta in sig på anrikning av specifika typer av mikroorganismer ur en miljö. Mediets bestämmelser är anpassade till de identifierade gener som finns och som antas stödja den eller de mikroorganismer som är avsedda för att minska berikningsmångfalden,9,10. En invändning är att genomisk information inte direkt härleder genernas uttryck, medan transkriptomisk information gör det.
Den tredje metoden omfattar miljöinformerade och simulerade medier, till skillnad från den första metoden, som inte simulerar medierna utan snarare använder miljön direkt som mediekälla. Denna tredje metod kräver miljöspaning av geokemin i en fältplats som innehåller mikroorganismer av intresse. Med denna kunskap identifieras primära komponenter och fysiska parametrar för att producera ett miljöinformerat simulerat medium. Mediet får sedan en direkt infusion av mikroorganisminnehållande sediment eller vätska från miljön till mediet. Denna metod är särskilt värdefull i de fall då den odlande mikrobiologen inte har tillgång till tillräckliga mängder källmiljö (som behövs för den första metoden) eller lämpliga metatranskriptomiska eller genomiska data (som behövs för den andra metoden).
Följande protokoll är ett exempel på den tredje metoden; Den är informerad av och syftar till att simulera miljöer av intresse. Tre naiva mediarecept som riktar sig mot olika anaeroba mikroorganismkulturer som förvärvats i fält presenteras parallellt i protokollet. De tre kulturer som representeras är blandkulturer med ursprung i jord (nedan kallad jordblandkultur), blandkulturer med ursprung i ett borrhål (nedan kallad borrhålsblandkultur) och en isolerad metanogen med ursprung i ett borrhål (nedan borrhålsisolerad metanogen). De sammansatta identiteterna och mängderna i de medierecept som delas här är avsedda som en inledande guide; De kan och uppmuntras att anpassas till läsarens miljö och mikroorganismer av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Produktion av anpassningsbart anaerobt flytande medium
- Medium för odlingsflaskor (produktion av 500 ml)
- Mät upp och tillsätt föreningar i en 1 L flaska och justera pH med hjälp av kolumnen i tabell 1 som motsvarar läsarens kultur av intresse (mängderna i tabell 1 registreras för produktion av 1 000 ml, justera därefter). Blanda blandningarna till homogenitet genom att snurra flaskan.
- Värm vätskan till kokning genom att mikrovågsugna flaskan i 5-6 min. Öppna mikrovågsugnen ofta och snurra vätskan försiktigt med en värmebeständig handske. Öppna mikrovågsugnen snabbt om vätskan blir stilla efter att ha bubblat; Annars kan vätskan snabbt expandera och svämma över flaskan.
- Fäst en steril 10 ml glaspipett till ett N2 gasgrenrörsuppställning (baserat på designen av Balch et al.11, men kräver inte en uppvärmd kopparkolonn för N2 renhetsgas; se kompletterande File 1 för mer information om gasgrenrör). Öppna grenröret för att ventilera O2 och låt N2 gas rinna ut.
- Placera pipettspetsen i vätskan och justera gasflödet så att bubblorna är måttligt kraftiga. Spola vätskan med N2 tills flaskan inte längre är för varm att röra vid.
OBS: Detta beror på innehållet i mediet men tar i allmänhet ~20 min. - I väntan på att flaskan ska svalna, ställ ut 10 sterila 100 ml odlingsflaskor; eller, om du förbereder media för uppsamling av jordblandad kultur, ställ ut två sterila 500 ml flaskor.
- När mediaflaskan är sval vid beröring, dra upp pipettspetsen i flaskans huvudutrymme. Tillsätt 0,125 g NaHCO3 och 0,300 g Na2S∙9 H2O och vänta tills resazurin blir färglöst.
VARNING: Na2S∙9 H2O är frätande, giftigt och irriterande. Använd personlig skyddsutrustning vid hantering och skölj metallverktyg noggrant efter kontakt. - I väntan på att resazurin ska ändra färg, fäst metallkanyler på gasgrenröret och placera kanylspetsarna i odlingsflaskor. Justera flödet av N2 in i flaskorna till en måttlig hastighet, så att vätskan som tillsätts i det efterföljande steget inte skvalpar runt på grund av gasflödet.
- När resazurin är färglöst, alikvot 50 ml vätska i varje odlingsflaska eller 250 ml vätska i varje 500 ml flaska.
- Täck varje flaska med en gummipropp i matchande storlek omedelbart efter att du har tagit bort kanylerna. Fäst proppen med en aluminiumförsegling (för odlingsflaskor) eller en GL45 skruvkork med öppen topp (för 500 ml flaskor).
- Placera flaskorna i en autoklaverbar behållare och fyll behållaren med kranvatten tills vattennivåerna matchar dem i flaskorna.
OBS: Detta säkerställer att flaskorna inte går sönder på grund av stress orsakad av temperaturskillnader på glaset under autoklavering. - Autoklavera flaskorna vid 121 °C i 30 minuter.
- Medium för bioreaktor (produktion av 8 L)
- Beredning av carboy
- Öppna ventilen på en 1/4" (6.4 mm) slangkulventil. Fäst två 6 cm långa längder med 1/4" (6.4 mm) innerdiameter (ID) och 1/2" (12.7 mm) ytterdiameter (OD) silikonslang på vardera änden av slangens hullingkulventil.
- Fäst en 5/16"-1/4" (7.9 mm-6.4 mm) slangadapterkoppling i ena änden av enheten. Fäst den andra änden av enheten på slanghullingen på en 8 L carboy.
- Använd ett buntband för att säkra anslutningen mellan carboyens slanghulling och slangen, och anslutningen mellan slangens hullingadapterkoppling och slangen.
- Autoklavera carboyen med montering vid 121 °C i 30 min.
- Medelstor produktion
- Stäng ventilen på slangens hullingkulventil på 8 L carboy-enheten.
- Mät upp och tillsätt föreningar till 8 L carboy och justera pH med hjälp av kolumnen i tabell 1 som motsvarar läsarens kultur av intresse (mängderna i tabell 1 registreras för produktion av 1 000 ml, justera därefter). Tillsätt en omrörningsstång och använd en omrörningsplatta för att blanda föreningarna till homogenitet.
- Värm vätskan till kokning med omrörningsplattan. Låt vätskan koka i 30 min.
OBS: Att värma vätskan till kokning beror på innehållet i mediet men kan ta 2-3 timmar. - Fäst en steril 10 ml glaspipett till ett N2 gasgrenrörsuppställning (baserat på designen av Balch et al.11, men kräver inte en uppvärmd kopparkolonn för N2 renhetsgas; se kompletterande File 1 för mer information om gasgrenrör). Öppna grenröret för att ventilera O2 och låt N2 gas rinna ut.
- Stäng av värmen, placera sedan pipettspetsen i vätskan och justera gasflödet så att bubblorna är måttligt kraftiga men inte svämmar över. Spola vätskan med N2 i 30 min.
- Dra upp pipettspetsen i carboyens huvudutrymme. Tillsätt 2,0 g NaHCO3 och 4,8 g Na2S∙9 H2O och vänta tills resazurin blir färglöst.
VARNING: Na2S∙9 H2O är frätande, giftigt och irriterande. Använd personlig skyddsutrustning vid hantering och skölj metallverktyg noggrant efter kontakt. - När resazurin är färglöst, ta bort glaspipetten och täck omedelbart carboyen med en #10-propp. Vrid en vajer över proppen och runt kanten på carboyen för att säkra proppen.
- Beredning av carboy
2. Förvärv in situ av anaeroba mikroorganismer i miljön
- Insamling av anaeroba prover från ytan (jordblandad kultur)
- Ta med flaskan/flaskorna med odlingsmedia med blandad jord gjorda enligt ovan och en kärnare ut på fältet.
OBS: En Giddings 2 5/8" standard avsmalnande jordbit används av författarna (Materialförteckning). Vilken jordborrare eller murslev som helst som kan provta till önskat djup kan dock användas. - Skjut (pål/påldrivning) urkärnaren i sedimentet tills toppen av sample uppsamlingscylindern är i jämnhöjd med sedimentets yta.
- Vrid borren 90° för att frigöra kärnan och dra uppåt tills provet extraheras från miljön.
- I lösa sediment (t.ex. vad som kan påträffas vid provtagning av våtmarker), täck kärnans bas med en ny nitrilhandske när den extraheras för att förhindra att provet faller ut eller sprids i vattnet vid extraktion.
- Närma dig snabbt med ögat 6-7 cm upp från kärnans bas. Använd en ny handskbeklädd hand för att skära in i kärnan och separera botten 6-7 cm.
- Överför omedelbart botten av kärnan till odlingsflaskan. Om jorden/sedimentet är för stort, forma det snabbt så att det passar in i flaskan lättare, vilket minimerar exponeringen för den aeroba atmosfären så mycket som möjligt.
- När provet har överförts, placera omedelbart proppen och håll den på plats med ett skruvlock.
- Förvara provet svalt. Kyl uppsamlingsflaskan vid 4 °C vid återkomst till laboratoriet.
- Ta med flaskan/flaskorna med odlingsmedia med blandad jord gjorda enligt ovan och en kärnare ut på fältet.
- Anaerob provtagning under ytan (blandkultur av borrhål)
- Ställ ut en steril 1 L flaska vid gasgrenröret. Förslut flaskan med en gummipropp. Droppa 100 % etanol på proppen och tänd eld på den med en tändare.
- Fäst en steril 23 G nål på N2 gasgrenrörsinställningen. Öppna grenröret för att ventilera O2 och låt N2 (eller Ar) gas strömma ut med måttlig hastighet.
- När proppen inte längre brinner, stick in nålen i flaskan. Stick in en andra steril 23 G nål som inte är fäst vid gasgrenröret i flaskan. Spola flaskan i 1-2 min.
- Dra ut nålen som inte är fäst vid gasgrenröret. Trycksätt flaskan i 1 min. Dra ut den återstående nålen.
- Ta med den trycksatta flaskan och en steriliserad 23 G nål till borrhålsstället. Dra upp vätska från borrhålet enligt metoderna i Merino et al.12.
OBS: Beroende på metod, anslutning och flödeshastighet för borrhålet ändrar detta strategin för att ta ett vattenprov. Om det finns ett kontinuerligt flöde av vatten, samla upp vatten enligt beskrivningen i steg 2.2.6. kommer att vara tillräckligt. Om vattenflödet är satsvis uppsamlat eller lågt flöde, kan en alternativ inlopps-/utloppsmetod användas. I alla situationer, minimera kontaminering och försök att se till att sample som samlas in är representativ för den miljö som önskas att provta. Detta är ett brett generaliserat uttalande eftersom det har varit författarnas erfarenhet att varje provinsamlingsevenemang från statliga eller privata webbplatser måste vara mycket anpassningsbart till den tillgängliga tillgängligheten. - Öppna flaskan snabbt, pumpa i vätska för att fylla flaskan helt och stäng flaskan.
- Stick in 23 G-nålen som togs med till platsen i flaskans gummipropp för att lätta på trycket i flaskan. Dra ut nålen.
- Förvara provet svalt. Kyl uppsamlingsflaskan vid 4 °C vid återkomst till laboratoriet.
3. In vitro-tillväxt av anaeroba mikroorganismer som förvärvats i fält
- Odling med odlingsflaska
- Ställ ut en steril flaska med N2 med propp och odlingsflaskorna och uppsamlingsflaskan som förberetts enligt ovan. Droppa 100 % etanol på propparna och tänd eld på dem med en tändare.
- Sätt en 23 G nål på en 1 ml spruta. När propparna inte längre brinner, sätt in nålen i N 2-flaskan och dra upp ~ 1 ml N2. Dra ut nålen.
- Tryck långsamt ned kolven för att frigöra N2. Så snart sprutan är tom, stick in nålen i uppsamlingsflaskan och dra upp 0,5 ml av miljöprovet. Dra ut nålen.
- Stick in nålen i odlingsflaskan och injicera provet. Dra ut nålen.
- Snurra flaskan och placera den i en inkubator vid temperatur, enligt tabell 1 eller läsarens intressanta miljö.
OBS: Odlingsförloppet (antingen flaska eller bioreaktor) övervakas med hjälp av en 0.02 mm djup Petroff-Hauser hemocytometer. Anrikningar av anaeroba eller kräsna mikroorganismer når vanligtvis inte celltätheter där OD600 är användbart, och andra detektionsmetoder är opraktiska för rutinmässig och upprepad övervakning. Detektionsgränser, kvalitetskontroll och statistiska beräkningar är beroende av typen av cellräkningskammare och användarens behov.
- Tillväxt per bioreaktor
- Beredning av en ballong med en modifierad spruta
- Ta bort kolven från tre 10 ml luerlocksprutor (en för varje slutmontering). Skär av flänsen från varje spruta och fila den avskurna änden så att den inte tränger igenom ballongerna. Rengör alla filade spån från den modifierade sprutan.
- Förbered en dubbel ballong genom att placera en ballong inuti en annan.
- Sträck änden av den dubbla ballongen över den modifierade 10 ml sprutan.
- Separera änden av den yttre ballongen något från den inre ballongen. Pressa ut all luft som är instängd mellan ballongerna.
- Dra åt ett buntband runt ballongernas botten för att fästa ballongerna i sprutan.
- Beredning av en modifierad propp
- Ta bort kolvarna från tio 1 ml luer lock-sprutor (två för varje propp som ska modifieras). Skär av flänsen från sprutorna.
- Ställ ut två gummiproppar i storlek #10 (för 8 L carboys) och tre storlekar för flaskor med GL45 gängfinish (för catch-flaskor). Använd en 1/4" (6.4 mm) borr och borra två hål genom toppen av varje gummipropp som är tillräckligt breda för att de modifierade sprutorna ska passa och tillräckligt smala för att passformen ska vara lufttät.
- För in de modifierade sprutorna genom hålen på gummiproppen.
- Rengör och autoklavera den modifierade proppen vid 121 °C i 30 minuter.
- Förberedelse av bioreaktorenheten
- Desinficera med 70 % etanol alla avstängningskranar, luerlåsadapterkontakter och andra icke-autoklaverbara bioreaktormaterial, och autoklav vid 121 °C i 30 minuter alla slangar (efter kapning i längd), proppar, glasull och andra autoklaverbara bioreaktormaterial.
- Ställ en steril bioreaktor (Figur 1 och Figur 2) på ett ringstativ och fäst den med en kedjerem. Ställ också ut ett vattenbad, en peristaltisk pump, den tillslutna 8 L carboyen som innehåller medium (från protokollsteg 1.2), en 3,5 L flaska (icke-provtagningsflaska) och en 500 ml flaska (provtagningsflaska).
- Stoppa carboyen
- Lägg ut en ballong med en modifierad spruta. Anslut en trevägskran till sprutans luerlockspets.
- Ta ballongenheten och anslut trevägskranen till slangen på en tank med N2. Vrid trevägskranen för att blockera änden öppen mot atmosfären.
- Öppna bensintanken och fyll ballongen med N2. När den är full, vrid trevägskranen för att blockera änden på ballongen. Stäng bensintanken och koppla bort tankslangen från trevägskranen.
- Anslut följande i följd: en trevägskran (på ballongen med den modifierade sprutan), en tvåvägskran, en luerlockadapterkoppling av honkön och luerlockspetsen på en av sprutorna på den modifierade proppen.
- Anslut en tvåvägskran till den andra sprutans luerlockspets. Stäng båda ventilerna på tvåvägskranarna på den modifierade proppenheten.
- Lossa vajern som håller fast carboyens omodifierade propp i storlek #10. Byt snabbt ut den omodifierade proppen mot den modifierade proppenheten och vrid tråden som tidigare för att fästa den modifierade proppenheten på carboyen.
ANM.: Om den modifierade proppenheten är säker och förberedd kan den användas för att stoppa carboyen i det sista steget av mediumberedningen (steg 1.2.2.7). - Vrid trevägskranen för att blockera änden öppen mot atmosfären. Öppna den efterföljande tvåvägskranen. Gasen i ballongen och huvudutrymmet i 8 L carboy är nu anslutna.
- Tillslutning av flaskor för icke-provtagning och provtagning av fångstflaskor
- Proppa till 3,5 L icke-provtagningsflaskan med en modifierad propp dimensionerad för flaskor med GL45-gänga, applicera 70 % etanol på botten av proppen för att hjälpa till att passa in den i flaskan. Förslut flaskan med ett GL45 skruvlock med öppen topp.
- Anslut följande i följd: en ballong med den modifierade sprutans luerlockspets, en trevägskran, en luerlockadapterkoppling av hona och luerlockspetsen på en av sprutorna på den modifierade proppen. Vrid trevägskranen för att blockera änden direkt mot atmosfären.
- Anslut en luerlock-adapterkoppling till den andra sprutans luerlock-spets.
- Upprepa ovanstående tre steg för 500 ml provtagningsflaska.
- Inställning av slang
- Mät avståndet mellan bioreaktorns vattenmantelportar och vattenbadsslangens hullingar. Kapa två längder av 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD silikonslang för att spänna över detta avstånd.
- Montera två raka slangkopplingar med GL14 öppna skruvlock. Fäst var och en i ena änden av de två slangdelarna.
- Vrid skruvlocken på portarna på bioreaktorns vattenmantel. Fäst de andra ändarna av slangen på vattenbadsslangens hullingar så att vattnet rinner ut ur vattenbadet, gå in i botten av bioreaktorns vattenmantel, gå ut högst upp på vattenmanteln och återgå till vattenbadet. Dra åt dragkedjorna runt ändarna på slangen för att fästa slangen vid vattenbadsslangens hullingar.
- För pumpar som liknar VWR:s minipump med variabelt flöde med ultralågt flöde ska du trä den medföljande 3/16" (4,8 mm) OD slitsade slangenheten genom pumpen.
- Mät avståndet mellan carboy-slangenheten och den peristaltiska pumpslangenheten. Skär en längd på 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD silikonslang för att spänna över detta avstånd.
- Fäst ena änden av slangen till slanghullingen på carboy-slangenheten och den andra till slanghullingen på den peristaltiska pumpslangenheten, orienterad så att mediet kommer att flöda från carboyen och genom den peristaltiska pumpen.
- Mät avståndet mellan den peristaltiska pumpslangen och bioreaktorns nedre port. Skär en längd på 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD silikonslang för att spänna över detta avstånd.
- Fäst ena änden av denna slang på slanghullingen på den peristaltiska pumpslangenheten och fäst försiktigt den andra på bioreaktorns nedre port. Var noga med att inte spricka glaset men också för att säkra anslutningen, dra åt ett dragkedjeband runt änden av slangen för att fästa slangen vid bioreaktorns nedre port.
- Mät och skär cirka 5 tum (127 mm) längd på 3/16 tum (4.8 mm) ID, 3/8 tum (9.5 mm) OD silikonslang.
- Fäst en luerlåsadapterkontakt (hona) till en trevägskran. Fäst valfri ände av trevägskranen på slangen.
- Montera en vinklad slangkoppling med GL14 öppet skruvlock. Fäst den i den andra änden av slangen.
- Vrid skruvlocket på den översta vertikala porten på bioreaktorn. Vrid trevägskranen för att blockera änden som pekar mot bioreaktorn.
- Mät avståndet mellan den översta vertikala portenheten och den icke-provtagningsflaskan. Skär en längd på 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD silikonslang för att spänna över detta avstånd. Skär av flänsarna från två 1 ml luerlocksprutor och sätt in dem i ändarna på slangen.
- Fäst ena änden av denna slangenhet till trevägskranen på den översta vertikala portenheten och fäst den andra änden till luerlåsadapterns honkontakt på icke-provtagningsflaskan.
- Mät avståndet mellan den översta vertikala portenheten och provtagningsflaskan. Skär en längd på 3/16" (4.8 mm) ID, 3/8" (9.5 mm) OD silikonslang för att spänna över detta avstånd. Skär av flänsarna från två 1 ml luerlocksprutor och sätt in dem i ändarna på slangen.
- Fäst ena änden av denna slangenhet till trevägskranen på den översta vertikala portenheten och fäst den andra till luerlockadapterns honkontakt på provtagningsflaskan.
- Påfyllning av bioreaktorn
- Täck en av bioreaktorns GL18-portar med en vit gummiseptum. Täck den andra GL18-porten och återstående vertikalt exponerade GL14-portar med PTFE-belagd silikonsepta i GL18/GL14-storlek (PTFE vänd mot glaset) och öppna övre skruvlock.
- Med en 50 cm lång stav packar du 0,9 g glasull i bioreaktorns botten.
- Autoklav 1,3 l sand vid 121 °C i 30 min. Fyll bioreaktorn med sanden med hjälp av en tratt.
OBS: Andra sedimenttyper som är informerade av läsarens miljö och mikroorganismer av intresse kan ersättas här. - Placera slangen till en tank med N2 i toppen av bioreaktorn och spola bioreaktorns huvudutrymme med N2 i 2 minuter. Täck omedelbart bioreaktorn med en propp i storlek #7 och ett GL45 skruvlock med öppen topp.
- Från icke-provtagningsflaskan, koppla loss slangen och vrid trevägskranen för att blockera änden som pekar mot ballongen. Anslut slangen till en tank på N2 till luerlåsadapterns honkontakt och spola bioreaktorns huvudutrymme med N2 i 2 minuter. Anslut omedelbart slangen igen och sätt tillbaka trevägskranen för att blockera änden som är öppen mot atmosfären.
- Upprepa ovanstående steg för provtagningsflaskan.
- Vrid trevägskranen på bioreaktorns översta vertikala port för att blockera änden som pekar mot provtagningsflaskan. Pumpa vätska från carboyen in i bioreaktorn. Pausa pumpen och lufta provtagningsflaskans ballong och fyll carboyens ballong med N2 efter behov.
- När bioreaktorn har fyllts med mediet, ställ in pumpflödet på 0.6 ml/min (digitalt värde på 40 på minipumpen).
OBS: Andra läsarönskade flödeshastigheter kan ersättas här. - Ställ in vattenbadstemperaturen, enligt tabell 1 eller läsarens intressanta miljö.
OBS: Inoculum kan läggas till vid denna tidpunkt eller senare, beroende på studiens detaljer. Om du inokulerar vid denna tidpunkt, fortsätt till steg 3.2.4.10. Om du inokulerar senare, fortsätt till steg 3.2.5. - Ställ ut en uppsamlingsflaska eller inokulerad odlingsflaska och en steril flaska med propp av N2. Droppa 100 % etanol på propparna och tänd eld på dem med en tändare.
- Sätt en 23 G nål på en 60 ml spruta. När propparna inte längre brinner, stick in nålen i N 2-flaskan och dra upp ~ 50 ml N2. Dra ut nålen.
- Tryck långsamt ned kolven för att frigöra N2. Så snart sprutan är tom, stick in nålen i uppsamlingsflaskan och dra upp 50 ml av miljöprovet. Dra ut nålen.
- Byt ut 23 G-nålen mot en steril lång metallnål (kanyl, längd 31,5 cm). För in den långa metallnålen genom den vita gummiseptumet på bioreaktorns GL18-port.
- Tryck in nålen i sedimentet och injicera inokulatet. Dra ut nålen.
- Löpande underhåll av bioreaktorer
- Varje dag som bioreaktorn är igång, utför följande:
- Kontrollera vattenbadsnivån. Om det är lågt, tillsätt mer vatten (använd destillerat vatten för utrustningens livslängd genom att minska korrosion och mineraluppbyggnad).
- Kontrollera ballongen på fångstflaskan som inte är provtagning; En full ballong kommer att hämma mediets flöde. När den är full, vrid trevägskranen för att blockera änden som pekar mot uppsamlingsflaskan. Kläm på ballongen för att tömma den; Sätt sedan tillbaka trevägskranen för att blockera änden som är öppen mot atmosfären; Upprepa tills ballongen är tom.
- Kontrollera ballongen på 8 L carboy. Om den är låg, stäng tvåvägskranen i följd och koppla bort trevägskranen från tvåvägskranen. Fyll på och sätt tillbaka ballongenheten enligt steg 3.2.3.3.2, 3.2.3.3.3 och 3.2.3.3.7.
- Kontrollera nivån på mediet i 8 L carboy. Om det är lågt, montera ytterligare en 8 L carboy och förbered mer medium enligt protokoll steg 1.2. och 3.2.3.3. Pausa pumpen, stäng slangens hullingkulventil, koppla snabbt bort den gamla carboyen och anslut den nya carboyen.
OBS: För en flödeshastighet på 0.6 ml/min kommer nytt medium att behövas var 9:e dag. - Kontrollera nivån på mediet i fångstflaskan som inte är provtagning. Om flaskan är full, montera en annan fångstflaska som inte är provtagning enligt steg 3.2.3.4.1. Spola den nya flaskan med N2, koppla snabbt bort ballongen med den modifierade sprutan och slangen från den gamla flaskan och anslut till den nya flaskan.
- Ta bort den modifierade proppen från en full fångstflaska som inte är provtagning. Autoklavera vätskan vid 121 °C i 30 minuter. Kassera sedan vätskan i enlighet med läsarens institutionella policy. Rengör och autoklavera alla delar av icke-provtagningsflaskan för att förbereda dem för nästa användning.
- Utför provtagning var 7:e (eller läsarönskat antal) dagar genom att göra följande:
- Vrid trevägskranen på bioreaktorns översta vertikala port för att blockera änden som pekar mot den icke-samplande fångstflaskan. Samla upp 250 ml vätska.
OBS: För en flödeshastighet på 0.6 ml/min tar det ~7 timmar att samla upp 250 ml. - Sätt tillbaka trevägskranen på bioreaktorns översta vertikala port för att blockera änden som pekar på provtagningsflaskan. Koppla bort slangen och provtagningsflaskan från trevägskranen på bioreaktorns översta vertikala port.
- Efter testning, förvaring och/eller korrekt bortskaffande av provtagningsvätskan, rengör alla delar av provtagningsflaskan utom ballongen med den modifierade sprutan. Autoklavera alla delar vid 121 °C i 30 minuter utom ballongen med den modifierade sprutan och luerlockadapterns honkontakter. Återmontera för nästa provtagningsdag.
OBS: Det rekommenderas starkt att ha duplicerad eller tredubbel redundans av delar, lock, slangar och septa för snabb reparation och utbyte vid behov.
- Vrid trevägskranen på bioreaktorns översta vertikala port för att blockera änden som pekar mot den icke-samplande fångstflaskan. Samla upp 250 ml vätska.
- Varje dag som bioreaktorn är igång, utför följande:
- Beredning av en ballong med en modifierad spruta
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här visar vi resultat från en bioreaktorstudie med hjälp av en borrhålsmetod för beredning av blandade odlingsmedier och en installationsmetod för bioreaktorer som beskrivs här. Borrhålsblandningsmediet modifierades för att som kolkälla innehålla en slurry av majskolvar som bearbetats genom oxidativ hydrotermisk upplösning (OHD)13,14. Modifierat borrhålsblandat odlingsmedium pumpades in i bioreaktorn under 44 dagar med en hastighet av 0,4 ml/min. På dag 23 tillsattes ett inokulum från borrhål BLM-1 i Death Valley-regionen i Nevada, USA,15. Vätskeprover från bioreaktorn samlades in i en provtagningsflaska dag 1, 8, 15, 22, 23 (efter vaccination), 30, 37 och 44.
För att spåra den allmänna statusen för inokulatkulturen (och pre-inoculum autoklavöverlevande invånare i bioreaktorsedimentet) observerades vätskeprover från bioreaktorer genom direkta cellräkningar. Direkta cellräkningar av provtagen vätska gjordes med en Petroff-Hauser hemocytometer. För att ta reda på identiteten hos mikrobiella medlemmar i bioreaktorn extraherades DNA från vätskeprover från bioreaktorn, och 16S rRNA-generna analyserades med Next Generation Sequencing (NGS). NGS-data bearbetades internt med hjälp av mothur efter MiSeq SOP16.
Före inokuleringen låg det direkta cellantalet ofta under detektionsgränsen (b.d.l.) på 1,0 × 106 celler/ml. Dag 23 (efter inokulering) hade ett lågt celltal på 2,6 × 106 celler/ml, medan de följande dagarna 30, 37 och 44 hade celltal över 1,0 × 107 celler/ml (Figur 3). Även om cellantalet var b.d.l. på dag 1, 8 och 22, extraherades DNA för NGS från varje tidpunkt, vilket indikerar en basal närvaro av pre-inokulatmikroorganismer i sedimentet även efter autoklavering. Det huvudsakliga släktet som fanns (bestäms av antalet läsningar i varje Operational Taxonomic Unit (OTU)) var stabilt på dag 8, 15 och 22 och identifierades som Geobacillus. Efter inokulering med BLM-1-inokulum på dag 23 dominerade Geobacillus inte längre, och nya större släkten uppstod tillsammans med en mängd mindre närvarande släkten, som för det mesta bibehöll sin närvaro till slutet av studien (Figur 4). Utifrån dessa drar vi slutsatsen att BLM-1-inokulatet var en aktiv och dynamiskt skiftande kultur inom bioreaktorn.
En ytterligare studie av NGS-data avslöjade medlemmar av den "mikrobiella mörka materian". OTU:er med tilldelade taxonomiska namn som innehöll orden "oklassificerad" eller "okultiverad" användes som en proxy för OTU:er som innehöll medlemmar av den "mikrobiella mörka materian". NGS-data samlades in för dag 44 (den sista dagen efter inokulering med mikroorganismer från borrhål BLM-1) och filtrerades för att inte innehålla OTU:er som hade avläsningar i data före inokulering (dag 1, 8, 15 eller 22) eftersom dessa OTU:er sannolikt inte hade varit i inokulatet. Den filtrerade NGS-datan dag 44 innehöll 1 844 OTU:er och 3 396 läsningar. Av dessa var 366 OTU:er (20 %) och 925 läsningar (27 %) oklassificerade på fylumnivå, och 1252 OTU:er (68 %) och 2357 läsningar (69 %) var oklassificerade eller oodlade på genusnivå. Även om det är kortvarigt, stöder denna pilotstudie potentialen hos en bioreaktor med miljöinformerade medier för att odla medlemmar av den "mikrobiella mörka materian".
Figur 1: Schematisk bild av specialkonstruerad bioreaktor av borosilikat som används för anaerob odling. (A) Bioreaktorn sedd från ena sidan. (B) Att rotera A 90° (medurs) runt z-axeln ger vyn). (C) En vy ovanifrån av bioreaktorn. Den mantlade designen möjliggör temperaturkontroll med vatten eller olja. De två jackportarna kan ses på höger sida av vyn i B. Den inre kammaren kan fyllas med sediment av vilken typ som helst eller kan lämnas tom på sediment för planktonodling. Tre provtagningsportar (ses till höger i vyn i A) gör det möjligt att avlägsna material på olika djup i bioreaktorkolonnen. Standard 45, 18 och 14 GL-öppningar kan tätas med teflon- eller butylsepta som håller en gastät tätning i 1-6 månader. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Montering av aktiv bioreaktor. Glasvaror som presenteras på bilden från vänster till höger är (A) 8 L carboy, (B) bioreaktor (se figur 1) och (C) icke-provtagningsflaska. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Direkt cellräkning från bioreaktorstudie. Mikrobiella populationer i bioreaktorn övervakades med hjälp av en 0,02 mm Petroff-Hauser hemocytometercellräkningskammare. Inoculum lades till i början av dag 23. Cellantalet för dag 1, 8 och 22 låg under detektionsgränsen. Den effektiva detektionsgränsen för direkt cellräkning är 1 × 106 celler/ml. Förkortning: b.d.l. = under detektionsgränsen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Nästa generations sekvensering av bioreaktorer. OTU:er representeras i staplade stapeldiagram som anger procentandelen avläsningar som tillhör unika OTU:er från varje tidpunkt i bioreaktorstudien. Unika OTU:er tilldelades sin associerade taxonomi vid en genusgräns. Släktet "Other" definieras som alla släkten som är mindre än 10 % av läsningarna vid varje tidpunkt. Det totala antalet DNA-avläsningar som representeras är 506 358. Antalet läsningar för varje tidpunkt visas överst i diagrammet. Inoculum lades till i början av dag 23. Förkortning: OTU = Operational Taxonomic Unit. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Förening | Mängd för jordblandad kultur | Mängd för borrhålsblandkultur | Mängd för borrhålsisolerad metanogen |
| Destillerat vatten | 1000,0 ml | 1000,0 ml | 1000,0 ml |
| HEPES | 3.600 g | - | - |
| MOPPAR | - | - | 2.000 g |
| MgCl2 ∙6 H2O | 0.400 g | 0.400 g | 0.400 g |
| KCl | 0.500 g | 0.250 gr | 0.500 g |
| NH4Cl | 0,268 gr | 0,268 gr | 0,268 gr |
| Na2SO4 | - | 0,284 gr | 1.500 gr |
| Na2HPO4 ∙2 H2O | - | - | 0,356 gr |
| 1 M KH2PO4 vid pH 6 | 1,0 ml | 1,0 ml | - |
| 1 M H3BO3 vid pH 9,4 | 1,0 ml | 1,0 ml | 1,0 ml |
| Spårmineraler | 1,0 ml | - | 1,0 ml |
| Vitaminer | - | - | 1,0 ml |
| 1 mg/ml natriumresazurin | 0,4 ml | 0,3 ml | 0,4 ml |
| pH-justering till | - | 7.0 | 7.0 |
| pH-justering med | - | NaOH | KOH |
| Inkubationstemperatur | 25 °C | 60 °C | 47 °C |
Tabell 1: Mediesammansättning. Förteckning över föreningar och fysikaliska parametrar för varje medium. De medier som presenteras är naiva; De innehåller inte kol och energikällor eftersom dessa kan vara specifika för och bör informeras av läsarens mikroorganismer och miljö av intresse. Se diskussionsavsnittet för idéer om möjliga tillägg av kol och energikällor.
Kompletterande File 1: Inställning av gasgrenrör. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Avsnittet om medelstor produktion i detta protokoll (avsnitt 1) har sin struktur att tacka för den modifierade ungerska tekniken av Miller och Wolin17, som har använts i stor utsträckning sedan den publicerades. Det praktiska med detta utvidgade protokoll kommer från dess beskrivande karaktär och parning med in situ-förvärv av mikroorganismer. Odlingsflaskor som innehåller miljöinformerade och simulerade medier har använts för att framgångsrikt odla följande in situ-förvärvade före detta medlemmar av den "mikrobiella mörka materian": anaeroba underjordiska bakterier Thermoanaerosceptrum fracticalcis stam DRI1318, Caldiatribacterium inferamans stam SIUC1 (accessionsnummer MT023787; manuskript under utarbetande) och Anaerothermus hephaesti stam SIUC3 (accessionsnummer MK618647; manuskript under utarbetande) och anaerob underjordisk bakterie okarakteriserad stam DRI14 (accessionsnummer KR708540).
Ett fokus för detta protokoll är att det är gjort för att vara mycket anpassningsbart till anaeroba miljöer och mikroorganismer på ytan och under ytan. För det första uppmuntras mediets sammansättning att ändras för att återspegla sammansättningen av den miljö som är av intresse. Till exempel kan 3 000 mg/L NaCl läggas till receptet vid simulering av en miljö med jonkoncentrationer på 3 000 mg/L för både Na+ och Cl-; eller 650 ml sand och 650 ml skiffer kan placeras i bioreaktorn när man simulerar en miljö med ett volymförhållande på 1:1 mellan sandsten och skiffer. För det andra kan mediets sammansättning modifieras för att uppmuntra tillväxten av specifika mikroorganismer av intresse. I synnerhet är naiva medier som de tre medierna i denna uppsats förberedda för och beroende av sådana modifieringar. Exempel på kol- och energikällor är fumarat18, pepton18, cellulosahaltigt organiskt material19, acetat20, jästextrakt19,20, xylitol (stam SIUC1), formiat (stam SIUC3) och andra potentiella källor somH2/CO2, citrat och glukos. Slutligen kan mediesammansättningen ändras beroende på önskad studie. Till exempel var huvudintresset för studien som beskrivs i avsnittet med representativa resultat att upptäcka hur representativa underjordiska anaeroba mikroorganismer skulle reagera på en unik blandad organisk slurry (en slurry av majskolvar bearbetade med OHD13,14); Receptet innehöll alltså denna kolkälla i stället för mer konventionella alternativ. Andra potentiella ändringar för specifika studier inkluderar tillägg av plast, syror och tungmetaller eller andra xenobiotika för bioremedieringsstudier; tillsats av motsträviga kolpolymerer såsom cellulosa och plast för depolymeriserade produktstudier med mervärde; och tillsats av gödsel och växtavfall för småskalig kompost och andra jordbruksstudier.
Om postreduktantanalys av ett medium önskas, såsom mätningar av pH, oxidationsreduktionspotential (ORP) och upplöst syre (DO), kan detta åstadkommas indirekt genom att offra ett representativt antal medelstora flaskor för att med säkerhet förstå karaktären hos den satsen. När du utsätter en förseglad mediumflaska för luft, rekommenderas det starkt att ORP- och DO-avläsningar tas under 1 minut efter öppnandet. Icke-syreberoende mätningar (t.ex. pH) kan göras icke-brådskande efter den första öppningen. Kräsna anaeroba mikroorganismer kräver vanligtvis ORP-värden < -200 mV för tillväxt. Om mediet resulterar i ett ORP-värde på > -200 mV och/eller DO-värden >0,40 mg/L, kan ytterligare Na2S (0,1-0,2 g/L) eller annat reduktionsmedel (t.ex. titancitrat, L-cystein, askorbinsyra) användas för att reducera mediet ytterligare.
Resazurin används ofta som en syreindikator (som i detta protokoll); Det är dock mer exakt en redoxindikator21, som indikerar närvaron av syre indirekt när syret förändrar redoxpotentialen hos en lösning. Resazurin i lösning är till en början blått. Vid exponering för reduktionsmedel skiftar lösningen irreversibelt till en rosa färg. När lösningen reduceras ytterligare skiftar den reversibelt till färglös och återgår till rosa vid oxidation. Författarna har observerat fall där reducerade medier som innehåller resazurin skiftade från blått till rosa men misslyckades med att skifta till färglöst. Författarna har dock också observerat att sådana medier ofta övergår till färglösa efter autoklavering, och att ökad tid som ägnas åt att koka och spola mediet i allmänhet gör att resazurin kan övergå till sin färglösa form efter tillsats av reduktionsmedel. Om så önskas kan koncentrationen av syre i mediet verifieras med en sond av upplöst syre.
Allt material som behövdes för att driva dessa bioreaktorer och de specialtillverkade glasbioreaktorerna översteg inte ~$5K (detta förutsätter att stödutrustning redan finns tillgänglig, t.ex. vattenbad, pumpar och inkubatorer). Dessa anaeroba odlingstekniker är ekonomiskt vänliga, jämfört med kommersiella automatiserade bioreaktorer som kan börja på >$10K. Dessutom håller många kommersiella bioreaktorer på att byta till engångsreaktorbehållare, vilket förändrar dynamiken i jämförelsen och inte är kostnadseffektivt för mindre forskningslaboratorier/universitet att kontinuerligt byta ut. Dessutom kan kommersiella system ha kemiska fördomar vid tillverkning (från den plast som används, fett på packningar/kopplingar eller kemiskt behandlat vatten) som kommer att påverka framgången för att odla kräsna mikroorganismer. Den låga kostnaden, anpassningsbarheten och mångsidigheten för att samla in ett anaerobt miljöprov, i kombination med ett informerat medium som kan inokuleras, vilket resulterar i att generera anrikningar för studier, ökar avsevärt chanserna att förvärva unika mikroorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna vill uppmärksamma den information och det mentorskap som har påverkat/utvecklat dessa tekniker genom åren. Dr. Hamilton-Brehm som tidigare doktorand, postdoktor och nuvarande professor står i tacksamhetsskuld till dem som tog sig tid att lära ut anaeroba tekniker: Dr. Mike Adams, Dr. Gerti Schut, Dr. Jim Elkins, Dr. Mircea Podar, Dr. Duane Moser och Dr. Brian Hedlund. Nature Conservancy och American Rivers stödde detta arbete genom anslagen G21-026-CON-P respektive AR-CE21GOS373. Alla åsikter, resultat, slutsatser eller rekommendationer som uttrycks i detta dokument är författarnas egna och återspeglar inte nödvändigtvis åsikterna hos Nature Conservancy eller American Rivers. Detta arbete stöddes av ett bidrag från SIU Advanced Energy Institute, som tacksamt erkänner finansiering som tilldelats genom Advanced Energy Resource Board. NGS utfördes av LC Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Materials | |||
| 1 L borosillicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 1 mL syringe with slip tip | Fisher Scientific | ||
| 10 mL glass pipette | Fisher Scientific | ||
| 100 mL culture bottle | Fisher Scientifc | ||
| 20 mm hand crimper | Fisher Scientifc | ||
| 23 G needle | Fisher Scientifc | ||
| 500 mL borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| Aluminum seal | Fisher Scientifc | ||
| Cannula, 31.5 cm length | Fisher Scientific | ||
| Cannula, 6 cm length | Fisher Scientifc | ||
| Corer | Giddings Machine Company | Assembled from company parts | |
| Gas manifold | Swagelok | Assembled from many different parts | |
| Lighter | Lowe's | ||
| N2 gas | Airgas | ||
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | ||
| Rubber stopper (for GL45 bottles) | Glasgeratebau OCHS | ||
| Rubber stopper (for culture bottles) | Ace Glass | ||
| Stirring hot plate | Corning | ||
| Trace minerals | ATCC | ||
| Vitamins | ATCC | ||
| Bioreactor-specific Materials | |||
| #10 rubber stopper | Ace Glass | ||
| #7 rubber stopper | Fisher Scientifc | ||
| 1 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 1/4" hose barb ball valve | Amazon | ||
| 10 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 3.5 L borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 5/16" - 1/4" hose barb adapter fitting | Amazon | ||
| 60 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 8 L borosillicate carboy | Allen Glass | ||
| Angled hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-20 | |
| Balloon | Party City | ||
| Borosillicate bioreactor | Allen Scientific Glass | Custom made upon request | |
| Drill | Lowe's | ||
| Female luer lock adapter coupler | Amazon | ||
| GL14 open top cap | Ace Glass | 7621-04 | |
| GL18 open top cap | Ace Glass | 7621-08 | |
| GL45 open top cap | Ace Glass | ||
| PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap | Ace Glass | 7625-06 | |
| PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap | Ace Glass | 7625-07 | |
| Ring stand | Fisher Scientific | ||
| Ring stand chain clamp | Amazon | ||
| Ring stand clamp | Fisher Scientific | ||
| Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od | Grainger | 55YG13 | |
| Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od | Grainger | ||
| Straight hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-22 | |
| Three-way stopcock | Amazon | ||
| Two-way stopcock | Amazon | ||
| Ultra low flow variable flow mini-pump | VWR | ||
| Water bath | Fisher Scientifc | ||
| White rubber septum for 13-18 mm od tubes | Ace Glass | 9096-49 | |
| Wire | Lowe's | ||
| Zip tie | Lowe's |
References
- Staley, J. T., Konopka, A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).
- Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes. MSystems. 3 (5), e00055 (2018).
- Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
- Marcy, Y., et al. Dissecting biological "dark matter" with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).
- Giovannoni, S., Stingl, U. The importance of culturing bacterioplankton in the'omics' age. Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).
- Stewart, E. J.
- Dedysh, S. N. Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps. Front. Microbiol. 2, 184 (2011).
- Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. Isolating" uncultivable" microorganisms in pure culture in a simulated natural environment. Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).
- Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012 (2011).
- Tyson, G. W., et al. Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community. Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).
- Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).
- Merino, N., et al. Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow. Sci. Total Environ. 842, 156768 (2022).
- Anderson, K. B., Creeping, J. C., Huggett, W. W. Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791. , Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf (2013).
- Anderson, K. B., Crelling, J. C., Huggett, W. W., Perry, D. M. Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512. , Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf (2018).
- Mullin, S. W., et al. Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer. Front. Microbiol. 11, 536535 (2020).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Miller, T. L., Wolin, M. A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes. Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin. Front. Microbiol. 10, 2224 (2019).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).
- Twigg, R. S.
