Summary
この論文の焦点は、環境から獲得した気難しい嫌気性微生物の培地を作るためのベストプラクティスを詳述することです。これらの方法は、嫌気性培養の管理に役立ち、とらえどころのない未培養微生物である「微生物暗黒物質」の増殖をサポートするために適用できます。
Abstract
嫌気性微生物の培養依存研究は、方法論的能力にかかっています。これらの分析法は、嫌気性微生物に適した増殖条件(pHや炭素源など)を作成および維持すると同時に、人工環境を損なうことなくサンプルを抽出できるようにする必要があります。この目的のために、 その場 環境から情報を得てシミュレートする方法は、その環境から微生物を培養するのに非常に役立ちます。ここでは、摂動を最小限に抑えた嫌気性サンプルの収集に重点を置いた、陸表および地下微生物を培養するための in situ 情報に基づいたシミュレーション嫌気性法の概要を説明します。このプロトコルはカスタマイズ可能な嫌気性液体媒体の生産、および嫌気性微生物の環境の獲得そして 生体外で の成長を詳述する。このプロトコルは、堆積物の環境シミュレーションに使用される嫌気性バイオリアクターの重要なコンポーネントと、環境的に取得された培養物の嫌気性液体媒体もカバーしています。バイオリアクターの寿命にわたって維持されたマイクロバイオームから得られた予備的な次世代シーケンシングデータを含め、実験的な炭素源に応じて活性培養物が動的に調整されました。
Introduction
ほとんどの微生物は培養されていないままです。これは、顕微鏡で観察された細胞間の大きな格差と、寒天プレートを使用して培養に成功した少数の微生物と対照的なことによって裏付けられています。ステイリーとコノプカは、この格差を「グレート・プレート・カウント・アノマリー」1と名付けました。推定された未解明の多様性は、いくつかの異なる環境からのランク存在量曲線に分布する多くの新しい属を示すメタゲノムおよびメタトランスクリプトームデータによって裏付けられています2。観察された(一般的には微生物群集のランダムショットガンシーケンシングによって)が培養されていない微生物は、「微生物暗黒物質」と呼ばれています3,4。
オミクスの時代において、微生物の培養は、ゲノムデータを十分に評価し、存在する遺伝子の機能/表現型を検証することが不可欠であり続けています。培養微生物のシーケンシングは、ショットガンメタゲノミクスや環境からのメタゲノムアセンブルゲノムなどの技術が許容できるほど間違いのないものになるまで、完全なゲノムを自信を持って取得する唯一の方法です5。培養微生物と組み合わせたゲノム評価は、「微生物暗黒物質」を理解するための強力な推論を提供します。「微生物暗黒物質」の多くのメンバーは、栄養素やその他の元素の循環や貴重な天然物の生産に影響を与え、生態系をサポートし、生態学的サービスを実行する重要な機能を果たしています。医学的には、現在市出されている医薬品の約半数は細菌由来の製品やその誘導体であり、未培養種のプロファイリングは将来の抗生物質を明らかにするのではないかと疑われています。この未熟な多数派に近づくためには、さまざまな培養方法を増やす必要があります6。「微生物暗黒物質」のメンバーの中で、嫌気性貧栄養微生物は大部分が過小報告されており、生態学的にも工業的にも貴重な生化学的経路を保持している可能性が高く7、培養の重要な標的となっています。しかし、嫌気性貧栄養微生物は、より長いインキュベーション時間、厳格な条件(例えば、特定の非標準in vitro 温度)、および特殊な培地レシピの使用により、好気性およびコピオトロフィック微生物よりも培養が困難です。
新しい嫌気性貧栄養微生物を含む「微生物暗黒物質」のメンバーを培養するための現在の開発技術は、私たちの理解を大幅に改善し、系統樹内のこれらの微生物の表現を増やしました。新規微生物を培養するための情報培地(すなわち、目的の微生物の知識を用いて得られた培地)を使用する現在の技術は、3つの異なる方法に分けることができます。最初の方法は、膜内に目的の微生物をすでに含んでいるin vitro増殖チャンバーに移すために、環境の個別のセクションを直接除去することを伴います。離散的なセクション(海水など)は、目的の微生物にその場で使用する地球化学的生息地を提供するように機能し、膜は細胞の移動を阻止します(目的の細胞は内部に残り、離散セクションとともに到着した外部の細胞は外に残ります)。標的微生物を自然の生息地に自然に利用できる化合物を含めることによって、そのような微生物を培養することができる8。2つ目の方法は、メタトランスクリプトミクスまたはゲノミクスを利用して代謝能力を解明し、標的培地設計のための狭い培養パラメータの手がかりを提供します。このアプローチは、環境外に特定の種類の微生物を濃縮するために使用できる生態生理学的プロファイルを提供します。培地の規定は、エンリッチメントの多様性を低下させるために標的微生物をサポートすると推定される、存在する同定された遺伝子に対応しています9,10。注意点として、ゲノム情報は遺伝子の発現を直接推測するものではありませんが、トランスクリプトーム情報は推測します。
第3の方法は、メディアをシミュレートせず、むしろ環境をメディアのソースとして直接使用する第1の方法とは異なり、環境情報とシミュレートされたメディアを包含します。この第3の方法は、対象微生物を含むフィールドサイトの地球化学の環境偵察を必要とします。この知識により、主要なコンポーネントと物理的パラメータが特定され、環境情報に基づいたシミュレートされた媒体が生成されます。次に、培地は、微生物含有堆積物または液体を環境から培地に直接注入します。この方法は、培養微生物学者が十分な量のソース環境(最初の方法に必要な)や適切なメタトランスクリプトームまたはゲノムデータ(2番目の方法に必要な)にアクセスできない場合に特に価値があります。
次のプロトコルは、3 番目の方法の例です。これは、関心のある環境から通知され、シミュレートすることを目的としています。現場で得られた異なる嫌気性微生物培養を標的とする3つのナイーブ培地レシピが、プロトコル内で並行して提示されています。表される3つの培養は、土壌由来の混合培養(以下、土壌混合培養)、ボアホール内を起源とする混合培養(以下、ボアホール混合培養)、ボアホール内を起源とする単離メタン生成物質(以下、ボアホール単離メタン生成物質)である。ここで紹介するメディアレシピの化合物の同一性と量は、入門ガイドとして意図されています。それらは、読者の環境や関心のある微生物に合わせてカスタマイズすることができ、奨励されています。
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Protocol
1.カスタマイズ可能な嫌気性液体培地の製造
- 培養ボトル用培地(500mL製造)
- 化合物を測定して 1 L ボトルに添加し、リーダーの目的の培養物に対応する 表 1 のカラムを使用して pH を調整します( 表 1 の含有量は 1,000 mL の製造に記録されており、それに応じて調整します)。ボトルを渦巻かせてコンパウンドを均一に混合します。
- ボトルを5〜6分間電子レンジで加熱して、液体を沸騰させます。電子レンジを頻繁に開き、耐熱手袋を使用して液体を静かに渦巻きます。泡立った後、液体が静止している場合は、電子レンジをすばやく開きます。そうしないと、液体が急速に膨張してボトルからオーバーフローする可能性があります。
- 滅菌済みの 10 mL ガラスピペットを N2 ガスマニホールドセットアップに取り付けます(Balch et al.11 の設計に基づくが、純度の N2 ガス用に加熱された銅カラムは必要ない;ガスマニホールドの詳細については補足 ファイル 1 を参照)。マニホールドを開いてO2 をベントし、N2 ガスを流出させます。
- ピペットチップを液体に入れ、気泡が適度に活発になるように気体の流れを調整します。ボトルが触れるには熱くなりすぎなくなるまで、液体をN2 で洗い流します。
注: これはメディアの内容によって異なりますが、通常は ~20 分かかります。 - ボトルが冷えるのを待っている間に、滅菌済みの100 mL培養ボトルを10本用意します。または、土壌混合培養の収集用の培地を調製する場合は、滅菌済みの500 mLボトルを2本用意します。
- 培地ボトルが冷めたら、ピペットチップをボトルのヘッドスペースに引き上げます。0.125gのNaHCO3と0.300gのNa2S∙9H2Oを加え、レサズリンが無色になるまで待ちます。
注意: Na2S∙9 H2Oは腐食性、毒性、および刺激性です。取り扱いの際は個人用保護具を使用し、接触後は金属工具をよくすすいでください。 - レサズリンの色が変わるのを待っている間に、金属製のカニューレをガスマニホールドのセットアップに取り付け、カニューレの先端を培養ボトルに入れます。ボトルへのN2 の流量を適度な速度に調整して、後続のステップで追加された液体がガスの流れによって波打たないようにします。
- レサズリンが無色になったら、各培養ボトルに50 mLの液体を分注するか、各500 mLボトルに250 mLの液体を分注します。
- カニューレを取り外した直後に、各ボトルに同じサイズのゴム栓をかぶせます。ストッパーをアルミシール(培養ボトル用)またはGL45オープントップスクリューキャップ(500 mLボトル用)で固定します。
- ボトルをオートクレーブ可能なビンに入れ、水位がボトル内の水位と一致するまでビンに水道水を入れます。
注意: これにより、オートクレーブ中にガラスの温度差によって引き起こされる応力によってボトルが破裂することがなくなります。 - ボトルを121°Cで30分間オートクレーブします。
- バイオリアクター用培地(8L製造)
- カーボーイの準備
- 1/4インチ(6.4 mm)ホースバーブボールバルブのバルブを開きます。ホースバーブボールバルブの両端に、内径(ID)1/4インチ(6.4 mm)と外径(OD)1/2インチ(12.7 mm)の6cmの長さのシリコンチューブを2本取り付けます。
- アセンブリの一端に、5/16 "-1/4"(7.9 mm-6.4 mm)ホースバーブアダプターフィッティングを取り付けます。アセンブリのもう一方の端を8Lカーボーイのホースバーブに取り付けます。
- 結束バンドを使用して、カーボーイのホースバーブとチューブの間の接続、およびホースバーブアダプターフィッティングとチューブ間の接続を固定します。
- カーボーイをアセンブリ付きで121°Cで30分間オートクレーブします。
- 中規模生産
- 8Lカーボーイアセンブリのホースバーブボールバルブのバルブを閉じます。
- 化合物を測定して 8 L カーボーイに添加し、リーダーの目的の培養に対応する 表 1 のカラムを使用して pH を調整します( 表 1 の含有量は 1,000 mL の生産について記録されており、適宜調整します)。攪拌子を加え、攪拌ホットプレートを使用して化合物を均一に混合します。
- 攪拌ホットプレートで液体を沸騰するまで加熱します。液体を30分間沸騰させます。
注意: 液体を沸騰させるまで加熱するには、メディアの内容によって異なりますが、2〜3時間かかる場合があります。 - 滅菌済みの 10 mL ガラスピペットを N2 ガスマニホールドセットアップに取り付けます(Balch et al.11 の設計に基づくが、純度の N2 ガス用に加熱された銅カラムは必要ない;ガスマニホールドの詳細については補足 ファイル 1 を参照)。マニホールドを開いてO2 をベントし、N2 ガスを流出させます。
- 火を止め、ピペットチップを液体に入れ、気泡が適度に勢いよく、あふれないように気体の流れを調整します。液体をN2 で30分間洗い流します。
- ピペットチップをカーボーイのヘッドスペースに引き上げます。NaHCO3を2.0g、Na2S・9H2Oを4.8g加え、レサズリンが無色になるまで待つ。
注意: Na2S∙9 H2Oは腐食性、毒性、および刺激性です。取り扱いの際は個人用保護具を使用し、接触後は金属工具をよくすすいでください。 - レサズリンが無色になったら、ガラスピペットを取り外し、すぐにカーボーイに#10ストッパーをかぶせます。ストッパーの上とカーボーイの唇の周りにワイヤーをねじって、ストッパーを固定します。
- カーボーイの準備
2. 環境嫌気性微生物の その場 捕捉
- 表面嫌気性サンプル採取(土壌混合培養)
- 上記のようにした混合土壌培地のボトルとコアラーを圃場に持参します。
注:Giddings 2 5/8"標準テーパーソイルビットは、著者によって使用されています(材料表)。ただし、所望の深さまでサンプリングできる土壌コアラーまたはこてを使用できます。 - サンプル収集シリンダーの上部が堆積物の表面と同じ高さになるまで、コアラーを沈殿物に押し込みます(パイル/ステークドライブ)。
- コアラーを90°ひねってコアを解放し、サンプルが環境から抽出されるまで上に引っ張ります。
- 緩い堆積物(湿地のサンプリング時に遭遇する可能性のあるものなど)では、抽出時にサンプルが脱落したり水中に拡散したりしないように、抽出中にコアのベースを新しいニトリル手袋をはめた手で覆います。
- コアの基部から6〜7cm上の目ですばやく近似します。新しいニトリル手袋をはめた手を使用してコアにスライスし、底を6〜7cm分離します。
- すぐにコアの底を培養ボトルに移します。土/堆積物が大きすぎる場合は、ボトルに収まりやすいようにすばやく成形し、好気性雰囲気への暴露を可能な限り最小限に抑えます。
- サンプルが移されたら、すぐにストッパーの位置を変え、スクリューキャップで所定の位置に保持します。
- サンプルを冷やしてください。ラボに戻ったら、コレクションボトルを4°Cで冷蔵します。
- 上記のようにした混合土壌培地のボトルとコアラーを圃場に持参します。
- 地下嫌気性サンプル取得(ボアホール混合培養)
- ガスマニホールドのそばに滅菌済みの1Lボトルをセットします。ボトルにゴム栓をします。栓にエタノール100%を垂らし、ライターで火をつけます。
- 滅菌済みの23GニードルをN2 ガスマニホールドのセットアップに取り付けます。マニホールドを開いてO2 をベントし、N2 (またはAr)ガスを適度な速度で流出させます。
- 栓の火がつかなくなったら、針をボトルに挿入します。ガスマニホールドに取り付けられていない2本目の滅菌済み23Gニードルをボトルに挿入します。ボトルを1〜2分間洗い流します。
- ガスマニホールドに取り付けられていない針を抜きます。ボトルを1分間加圧します。残りの針を取り出します。
- 加圧ボトルと滅菌した23Gの針をボアホールの現場に持って行きます。メリノらの方法に従ってボアホールから液体を吸い上げます12。
注:ボアホールの方法、接続、および流量に応じて、水サンプルを取得する方法が変わります。水が連続して流れている場合は、手順2.2.6で概説されているように水を集めます。で十分です。水の流れがバッチ収集または低流量の場合は、別の入口/出口方法を使用できます。すべての状況において、汚染を最小限に抑え、収集されたサンプルがサンプリングを希望する環境を代表するものであることを確認してください。これは、政府または民間のサイトからのすべてのサンプル収集イベントが利用可能なアクセシビリティに高度に適応するものでなければならないという著者の経験であるため、これは大まかに一般化された声明です。 - ボトルをすばやく開き、液体をポンプで送り込んでボトルを完全に満たし、ボトルを閉じます。
- 現場に持参した23Gの針をボトルのゴム栓に挿入して、ボトル内の圧力を緩和します。針を抜きます。
- サンプルを冷やしてください。ラボに戻ったら、コレクションボトルを4°Cで冷蔵します。
3. 野外で獲得した嫌気性微生物の in vitro 増殖
- 培養ボトルによる成長
- N2の栓付き滅菌ボトルと、上記のようにして調製した培養ボトルおよび回収ボトルをセットする。栓にエタノール100%を垂らし、ライターで火をつけます。
- 23 G の針を 1 mL のシリンジに組み立てます。栓が燃えなくなったら、針をN2 ボトルに挿入し、~1 mLのN2を吸い上げます。針を抜きます。
- プランジャーをゆっくりと押し下げて、N2を解放します。シリンジが空になったらすぐに、ニードルをコレクションボトルに挿入し、0.5 mLの環境サンプルを採取します。針を抜きます。
- ニードルを培養ボトルに挿入し、サンプルを注入します。針を抜きます。
- ボトルを渦巻き、 表1 または読者の関心のある環境から通知された温度のインキュベーターに入れます。.
注:培養の進行状況(ボトルまたはバイオリアクター)は、深さ0.02 mmのペトロフハウザー血球計算盤を使用して監視されます。嫌気性微生物や潔癖性微生物の濃縮は、通常、OD600 が使用可能な細胞密度には到達せず、他の検出法は日常的および反復的なモニタリングには実用的ではありません。検出限界、品質管理、および統計計算は、細胞計数チャンバーの種類とユーザーのニーズによって異なります。
- バイオリアクターによる成長
- 修正された注射器によるバルーンの準備
- 3本の10 mLルアーロックシリンジ(最終アセンブリごとに1本ずつ)からプランジャーを取り外します。各シリンジからフランジを切り取り、切断した端をやすりで磨いて、バルーンに穴を開けないようにします。変更したシリンジからすべてのやすりがけされたチップを取り除きます。
- 1つのバルーンを別のバルーンの中に入れて、2倍にしたバルーンを準備します。
- 2倍にしたバルーンの端を、変更した10 mLシリンジの上に伸ばします。.
- 外側のバルーンの端を内側のバルーンから少し離します。風船の間に閉じ込められた空気をすべて絞り出します。
- バルーンの底部に結束バンドを締めて、バルーンをシリンジに固定します。
- 修正ストッパーの作製
- 10本の1 mLルアーロックシリンジ(変更するストッパーごとに2本ずつ)からプランジャーを取り外します。シリンジからフランジを切り取ります。
- ゴム栓サイズ#10(8Lカーボーイ用)を2つ、GL45スレッド仕上げのボトル用サイズ3つ(キャッチボトル用)を用意します。1/4インチ(6.4 mm)のドリルビットを使用して、各ゴム栓の上部に、改造したシリンジが収まるのに十分な幅と、気密性を高めるのに十分な狭さに2つの穴を開けます。
- 改造したシリンジをゴム栓の穴に挿入します。
- 変更したストッパーを洗浄し、121°Cで30分間オートクレーブします。
- バイオリアクターアセンブリの調製
- すべての活栓、メス型ルアーロックアダプターコネクタ、およびその他のオートクレーブ不可のバイオリアクター材料を70%エタノールで消毒し、すべてのチューブ(長さに切断した後)、ストッパー、グラスウール、およびその他のオートクレーブ可能なバイオリアクター材料を121°Cで30分間オートクレーブします。
- 滅菌バイオリアクター(図1 および 図2)をリングスタンドにセットし、チェーンストラップで固定します。また、ウォーターバス、蠕動ポンプ、ストッパー付き8Lカーボーイ含有培地(プロトコルステップ1.2から)、3.5Lボトル1本(非サンプリングキャッチボトル)、および500mLボトル1本(サンプリングキャッチボトル)も用意します。
- カーボーイを栓する
- 改造した注射器でバルーンをセットします。三方活栓をシリンジのルアーロックチップに接続します。
- バルーンアセンブリを取り、三方活栓をN2のタンクのチューブに接続します。三方活栓を回して、大気に開放された端を遮断します。
- ガスタンクを開き、バルーンにN2を入れます。いっぱいになったら、三方活栓を回してバルーンの端を塞ぎます。ガスタンクを閉じ、タンクチューブを三方活栓から外します。
- 三方活栓(改造シリンジ付きバルーン)、二方活栓、メス型ルアーロックアダプターカプラー、改造ストッパーシリンジのルアーロック先端を順番に接続します。
- もう一方のシリンジのルアーロックチップに、双方向活栓を接続します。変更されたストッパーアセンブリの双方向活栓の両方のバルブを閉じます。
- カーボーイの未変更サイズ#10ストッパーを固定しているワイヤーをほどきます。未変更のストッパーを変更済みのストッパーアセンブリにすばやく交換し、前と同じようにワイヤーをひねって、変更したストッパーアセンブリをカーボーイに固定します。
注意: 自信を持って準備ができていれば、修正されたストッパーアセンブリを使用して、培地の準備の最終ステップ(ステップ1.2.2.7)でカーボーイをストッパーにすることができます。 - 三方活栓を回して、大気に開放された端を遮断します。順番に双方向活栓を開きます。これで、バルーンのガスと8Lカーボーイのヘッドスペースが接続されました。
- 非サンプリングおよびサンプリングキャッチボトルの栓
- 3.5Lのノンサンプリングキャッチボトルを、GL45スレッド仕上げのボトル用にサイズを変更したストッパーで栓し、栓の底に70%エタノールを塗布してボトルに収まります。GL45オープントップスクリューキャップでボトルに蓋をします。
- 改造シリンジのルアーロックチップ付きバルーン、三方活栓、メス型ルアーロックアダプターカプラー、改造ストッパーシリンジのルアーロックチップを順番に接続します。三方活栓を回して、端が大気に直接開いているのを遮断します。
- もう一方のシリンジのルアーロックチップに、メスのルアーロックアダプターカプラーを接続します。
- 500 mL サンプリング キャッチ ボトルについて、上記の 3 つの手順を繰り返します。
- チューブのセットアップ
- バイオリアクターのウォータージャケットポートとウォーターバスホースバーブの間の距離を測定します。内径3/16インチ(4.8 mm)、外径3/8インチ(9.5 mm)のシリコンチューブを2本の長さで切断します。
- 2 つのストレート ホース コネクタを GL14 オープントップ スクリュー キャップで組み立てます。2 つのチューブ片の一方の端にそれぞれを取り付けます。
- スクリューキャップをバイオリアクターウォータージャケットのポートにひねります。チューブのもう一方の端をウォーターバスホースバーブに取り付けて、水がウォーターバスから流出し、バイオリアクターウォータージャケットの下部に入り、ウォータージャケットの上部から出て、ウォーターバスに戻るようにします。チューブの端の周りの結束バンドを締めて、チューブをウォーターバスホースのバーブに固定します。
- VWR超低流量可変流量ミニポンプに類似したポンプの場合は、付属の3/16インチ(4.8 mm)外径スロット付きチューブアセンブリをポンプに通します。
- カーボーイチューブアセンブリとペリスタルティックポンプチューブアセンブリの間の距離を測定します。内径3/16インチ(4.8 mm)、外径3/8インチ(9.5 mm)のシリコンチューブの長さを切断して、この距離にまたがります。
- チューブの一方の端をカーボーイチューブアセンブリのホースバーブに取り付け、もう一方の端をペリスタルティックポンプチューブアセンブリのホースバーブに取り付け、媒体がカーボーイからペリスタルティックポンプを通って流れるように方向付けます。
- 蠕動ポンプチューブアセンブリとバイオリアクターの底部ポートの間の距離を測定します。内径3/16インチ(4.8 mm)、外径3/8インチ(9.5 mm)のシリコンチューブの長さを切断して、この距離にまたがります。
- このチューブの一方の端を蠕動ポンプチューブアセンブリのホースバーブに取り付け、もう一方の端をバイオリアクターの下部ポートに慎重に取り付けます。ガラスにひびが入らないように注意するだけでなく、接続を固定するために、チューブの端に結束バンドを締めて、チューブをバイオリアクターの下部ポートに固定します。
- 長さ約5インチ(127mm)の内径3/16インチ(4.8 mm)、外径3/8インチ(9.5 mm)のシリコンチューブを測定して切断します。
- メス型ルアーロックアダプターコネクターを三方活栓に取り付けます。三方活栓の任意の端をチューブに取り付けます。
- GL14オープントップスクリューキャップ付きの1つの角度付きホースコネクタを組み立てます。チューブのもう一方の端に取り付けます。
- スクリューキャップをバイオリアクターの一番上の垂直ポートにひねります。三方活栓を回して、バイオリアクターを指す端を塞ぎます。
- 最上部の垂直ポートアセンブリと非サンプリングキャッチボトルアセンブリの間の距離を測定します。内径3/16インチ(4.8 mm)、外径3/8インチ(9.5 mm)のシリコンチューブの長さを切断して、この距離にまたがります。2本の1 mLルアーロックシリンジからフランジを切り取り、チューブの端に挿入します。
- このチューブアセンブリの一方の端を最上部の垂直ポートアセンブリの3方向活栓に取り付け、もう一方の端を非サンプリングキャッチボトルアセンブリのメスルアーロックアダプターコネクタに取り付けます。
- 最上部の垂直ポートアセンブリとサンプリングキャッチボトルアセンブリの間の距離を測定します。内径3/16インチ(4.8 mm)、外径3/8インチ(9.5 mm)のシリコンチューブの長さを切断して、この距離にまたがります。2本の1 mLルアーロックシリンジからフランジを切り取り、チューブの端に挿入します。
- このチューブアセンブリの一方の端を一番上の垂直ポートアセンブリの三方活栓に取り付け、もう一方の端をサンプリングキャッチボトルアセンブリのメス型ルアーロックアダプターコネクタに取り付けます。
- バイオリアクターへの充填
- バイオリアクターのGL18ポートの1つを白いゴム製のセプタムで覆います。他の GL18 ポートと残りの垂直露出 GL14 ポートには、GL18/GL14 サイズの PTFE 面シリコン セプタム(ガラス面の PTFE)とオープン トップ スクリュー キャップを装着します。
- 長さ50cmのロッドで、0.9gのグラスウールをバイオリアクターの底に詰めます。
- 121°Cで1.3Lの砂を30分間オートクレーブします。漏斗を使用してバイオリアクターに砂を充填します。
注:読者の環境や関心のある微生物によって通知される他の堆積物の種類は、ここで代用できます。 - チューブをバイオリアクターの上部にあるN2 のタンクに入れ、バイオリアクターのヘッドスペースをN2 で2分間洗い流します。すぐにバイオリアクターに#7サイズのストッパーとGL45オープントップスクリューキャップで蓋をします。
- 非サンプリングキャッチボトルから、チューブを外し、三方活栓を回して、バルーンを指す端を塞ぎます。チューブをN2 のタンクにメスのルアーロックアダプターコネクタに接続し、バイオリアクターのヘッドスペースをN2 で2分間洗い流します。すぐにチューブを再接続し、三方活栓を戻して、大気に開放された端を遮断します。
- サンプリングキャッチボトルについて、上記の手順を繰り返します。
- バイオリアクターの一番上の垂直ポートの三方活栓を回して、サンプリングキャッチボトルを指す端を塞ぎます。カーボーイからバイオリアクターに液体をポンプで送ります。ポンプを一時停止し、サンプリングボトルのバルーンをベントし、必要に応じてカーボーイのバルーンにN2 を充填します。
- バイオリアクターに培地が充填されたら、ポンプの流量を 0.6 mL/分に設定します(ミニポンプのデジタル値 40)。
注:他のリーダー希望の流量は、ここで代用できます。 - 表1または読者の関心のある環境から通知されたように、ウォーターバス温度を設定します。
注:接種は、研究の詳細に応じて、この時点で追加することも、後で追加することもできます。この時点で接種する場合は、手順3.2.4.10に進みます。後で接種する場合は、手順3.2.5に進みます。 - 採取ボトルまたは接種培養ボトルと、N2の栓付き滅菌ボトルをセットします。栓にエタノール100%を垂らし、ライターで火をつけます。
- 23 Gの針を60 mLのシリンジに組み立てます。栓が燃えなくなったら、針をN2 ボトルに挿入し、~50 mLのN2を吸い上げます。針を抜きます。
- プランジャーをゆっくりと押し下げて、N2を解放します。シリンジが空になったらすぐに、ニードルをコレクションボトルに挿入し、50 mLの環境サンプルを採取します。針を抜きます。
- 23Gの針を滅菌済みの長い金属針(カニューレ、長さ31.5cm)に交換します。長い金属針をバイオリアクターのGL18ポートの白いゴム製のセプタムに挿入します。
- 針を沈殿物に押し込み、接種剤を注入します。針を抜きます。
- バイオリアクターメンテナンスの実行
- バイオリアクターが稼働している毎日、以下を実行します。
- ウォーターバスのレベルを確認してください。低い場合は、水を追加します(腐食やミネラルの蓄積を減らして機器の寿命を延ばすために蒸留水を使用してください)。
- 非サンプリングキャッチボトルのバルーンを確認します。バルーンがいっぱいになると、培地の流れが阻害されます。いっぱいになったら、三方活栓を回して、キャッチボトルを指す端を塞ぎます。風船を絞って空にします。次に、三方活栓を戻して、大気に開放された端を遮断します。バルーンが空になるまで繰り返します。
- 8Lカーボーイのバルーンをチェック。低い場合は、順番に 2 方向活栓を閉じ、3 方向活栓を 2 方向活栓から外します。手順3.2.3.3.2、3.2.3.3.3、および3.2.3.3.7に従って、バルーンアセンブリを補充して再度取り付けます。
- 8Lカーボーイのミディアムのレベルを確認してください。低い場合は、別の8Lカーボーイを組み立て、プロトコルステップ1.2に従ってさらに培地を準備します。および 3.2.3.3.ポンプを一時停止し、ホースバーブボールバルブを閉じ、古いカーボーイをすばやく外し、新しいカーボーイを接続します。
注:流速が 0.6 mL/分の場合、9 日ごとに新しい培地が必要になります。 - 非サンプリングキャッチボトル内の培地のレベルを確認してください。いっぱいになったら、ステップ3.2.3.4.1に従って別の非サンプリングキャッチボトルを組み立てます。新しいボトルをN2で洗い流し、改造したシリンジとチューブでバルーンを古いボトルからすばやく外し、新しいボトルに接続します。
- 変更したストッパーを完全な非サンプリングキャッチボトルから取り外します。液体を121°Cで30分間オートクレーブします。次に、読者の機関の方針に従って液体を廃棄します。非サンプリングキャッチボトルアセンブリのすべての部品を洗浄してオートクレーブし、次の使用に備えます。
- 7 日ごと (またはリーダーが希望する日数) ごとにサンプリングを実行するには、次の操作を行います。
- バイオリアクターの一番上の垂直ポートの三方活栓を回して、非サンプリングキャッチボトルを指す端を塞ぎます。250 mLの液体を回収します。
注:流速が 0.6 mL/分の場合、250 mL の回収には ~7 時間かかります。 - バイオリアクターの一番上の垂直ポートの三方活栓を戻して、サンプリングキャッチボトルを指す端を塞ぎます。チューブとサンプリングキャッチボトルを、バイオリアクターの一番上の垂直ポートの三方活栓から外します。
- サンプリング液のテスト、保管、および/または適切な廃棄後、バルーンを除くサンプリングキャッチボトルアセンブリのすべての部品を改造したシリンジで清掃します。121°Cで30分間オートクレーブしますが、バルーンには改良されたシリンジとメス型ルアーロックアダプターコネクターが付いています。次のサンプリング日のために再組み立てします。
注意: 必要に応じて迅速な修理と交換のために、部品、キャップ、チューブ、およびセプタムの重複または三重の冗長性を持つことを強くお勧めします。
- バイオリアクターの一番上の垂直ポートの三方活栓を回して、非サンプリングキャッチボトルを指す端を塞ぎます。250 mLの液体を回収します。
- バイオリアクターが稼働している毎日、以下を実行します。
- 修正された注射器によるバルーンの準備
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Representative Results
本稿では、本明細書に記載のボアホール混合培地調製方法およびバイオリアクターセットアップ方法を用いたバイオリアクター試験の結果を示す。ボアホール混合培地は、酸化水熱溶解(OHD)で処理したトウモロコシの穂軸のスラリーを炭素源として含有するように改質した13,14。改変したボアホール混合培地を、0.4 mL/分の速度で 44 日間バイオリアクターにポンプで送液しました。23日目には、米国ネバダ州デスバレー地域にあるボアホールBLM-1から調達した接種物が追加された15。バイオリアクターからの液体サンプルは、1、8、15、22、23(接種後)、30、37、および44日目にサンプリングキャッチボトルに収集されました。
接種培養物(および接種前のオートクレーブで生き残ったバイオリアクター堆積物の住人)の一般的な状態を追跡するために、バイオリアクター液体サンプルを直接細胞カウントで観察しました。サンプリングした液体の直接細胞カウントは、Petroff-Hauser血球計算盤で行いました。バイオリアクターの微生物メンバーの同一性を知るために、バイオリアクターの液体サンプルからDNAを抽出し、16S rRNA遺伝子を次世代シーケンシング(NGS)で解析しました。NGS データは、MiSeq SOP16 に従って mothur を使用して社内で処理しました。
接種前は、直接細胞数は検出限界(b.d.l.)の1.0×106 細胞/mLを下回ることが多かった。接種23日目(接種後)の細胞数は2.6×106 細胞/mLと低く、翌30日目、37日目、44日目は細胞数が1.0×107 細胞/mLを超えました(図3)。1日目、8日目、22日目の細胞数はb.d.l.であったが、すべての時点からNGS用のDNAを抽出し、オートクレーブ後も堆積物中に接種前微生物が基底に存在することを示した。存在する主要な属(各運用分類単位(OTU)のリード数によって決定される)は、8日目、15日目、および22日目に安定しており、 Geobacillusとして同定されました。23日目にBLM-1接種を接種した後、 Geobacillus はもはや優勢ではなく、新しい主要な属が多数のマイナーな属とともに発生し、ほとんどの場合、研究の終わりまで存在感を維持しました(図4)。これらのことから、BLM-1接種物はバイオリアクター内で活発かつダイナミックに変化する培養物であったと結論付けています。
NGSデータの追加調査では、「微生物暗黒物質」のメンバーが明らかになりました。「unclassified」または「uncultured」という単語を含む分類名が割り当てられたOTUは、「微生物暗黒物質」のメンバーを含むOTUの代理として使用されました。NGSデータは、44日目(ボアホールBLM-1由来の微生物による接種後の最終日)に収集され、接種前データ(1、8、15、または22日目)に読み取られたOTUが接種物に含まれていなかった可能性が高いため、これらのOTUが含まれていないようにフィルタリングしました。フィルタリングした 44 日目の NGS データには、1,844 の OTU と 3,396 のリードが含まれていました。これらのうち、366 OTU(20%)および925リード(27%)は門レベルで未分類であり、1252 OTU(68%)および2357リード(69%)は属レベルで未分類または未培養であった。短期的ではあるが、このパイロット研究は、環境情報に配慮した培地を用いたバイオリアクターが「微生物暗黒物質」のメンバーを培養する可能性を裏付けている。
図1:嫌気性培養に使用されるカスタム設計のホウケイ酸バイオリアクターの概略図。 (A)バイオリアクターを片側から見た図。(B)Z軸を中心に A を90°(時計回り)回転させると、ビューが得られます)。(C)バイオリアクターの上面図。ジャケット付き設計により、水や油で温度を制御できます。2 つのジャケット ポートは、 B のビューの右側に見えます。内部チャンバーは、あらゆる種類の堆積物で満たすことができ、プランクトン培養のために堆積物を空にしておくこともできます。3つのサンプリングポート( 図Aの右側)により、バイオリアクターカラムの異なる深さの物質を除去することができます。標準の45、18、および14 GL開口部は、テフロンまたはブチルセプタムを使用してシールでき、1〜6か月間気密シールを保持します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:アクティブなバイオリアクターアセンブリ。 写真のガラス器具は、左から(A)8Lカーボーイ、(B)バイオリアクター( 図1参照)、(C)ノンサンプリングキャッチボトルです。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:バイオリアクター研究からの直接細胞数。 バイオリアクター内の微生物集団は、0.02 mm Petroff-Hauser血球計算盤細胞計数チャンバーを使用してモニターしました。接種は23日目の初めに追加されました。1日目、8日目、および22日目の細胞数は検出限界を下回っていました。直接細胞計数の有効検出限界は、1 × 106 cells/mLです。略語:b.d.l.=検出限界未満。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:バイオリアクターの次世代シーケンシング。 OTU は積み上げ棒グラフで表され、バイオリアクター研究の各時点からの一意の OTU に属するリードの割合を示します。一意の OTU は、属のカットオフで関連する分類に割り当てられました。属「その他」は、各時点でのリードの10%未満のすべての属として定義されます。表されるDNAリードの総数は506,358です。各時点の読み取り数は、グラフの上部に一覧表示されます。接種は23日目の初めに追加されました。略語: OTU = Operational Taxonomic Unit。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 化合物 | 土壌混合培養量 | ボアホール混合培養量 | ボアホール単離メタン生成物質の量 |
| 蒸留水 | 1000.0 mLの | 1000.0 mLの | 1000.0 mLの |
| ヘペス | 3.600グラム | - | - |
| モップ | - | - | 2.000グラム |
| MgCl2 ∙6 H2O | 0.400グラム | 0.400グラム | 0.400グラム |
| KClの | 0.500グラム | 0.250グラム | 0.500グラム |
| NH4Cl | 0.268グラム | 0.268グラム | 0.268グラム |
| Na2SO4 | - | 0.284 グラム | 1.500グラム |
| Na2HPO4 ∙2 H2O | - | - | 0.356グラム |
| pH 6 で 1 M KH2PO4 | 1.0 mLの | 1.0 mLの | - |
| pH 9.4で1 M H3BO3 | 1.0 mLの | 1.0 mLの | 1.0 mLの |
| 微量ミネラル | 1.0 mLの | - | 1.0 mLの |
| ビタミン | - | - | 1.0 mLの |
| 1 mg/mLレサズリンナトリウム | 0.4 mLの | 0.3 mLの | 0.4 mLの |
| pH調整を | - | 7.0 | 7.0 |
| pH調整 | - | NaOHの | 島 |
| インキュベーション温度 | 25 °C | 60 °C | 47 °C |
表1:メディア構成。 各培地の化合物と物理パラメータのリスト。提示されたメディアは素朴です。炭素源やエネルギー源は、読者の関心のある微生物や環境に特有のものであり、情報を得る必要があるため、含まれていません。可能な炭素およびエネルギー源の追加のアイデアについては、ディスカッションセクションを参照してください。
補足ファイル1:ガスマニホールドのセットアップ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルの中生産セクション(セクション1)は、その構造をMillerとWolin17の修正されたHungate技術に負っており、その発行以来広く使用されています。この拡張されたプロトコルの実用性は、その記述的な性質と、微生物のその場での獲得との組み合わせから来ています。嫌気性細菌Thermoanaerosceptrum fracticalcis株DRI1318、Caldiatribacterium inferamans株SIUC1(アクセッション番号MT023787;原稿準備中)、およびAnaerothermus hephaestiの、環境情報に基づいた模擬培地を含む培養ボトルは、以下のin situで獲得した「微生物暗黒物質」の元メンバーの培養に成功していますSIUC3株(アクセッション番号MK618647;原稿準備中)、および嫌気性地下細菌の未特徴性株DRI14(アクセッション番号KR708540)。
このプロトコルの1つの焦点は、表面および地下の嫌気性環境と微生物に非常に適応性があるように作られていることです。まず、培地の組成は、関心のある環境の構成を反映するように変更することが奨励されます。たとえば、Na+ と Cl- の両方でイオン濃度が 3,000 mg/L の環境をシミュレートする場合、3,000 mg/L の NaCl をレシピに追加できます。または、砂岩と頁岩の体積比が1:1の環境をシミュレートする場合、650 mLの砂と650 mLのシェールをバイオリアクターに入れることができます。第二に、培地の組成を改変して、目的の特定の微生物の増殖を促進することができます。特に、本稿で取り上げた3つのメディアのような素朴なメディアは、そのような修正を前提とし、それに依存している。炭素およびエネルギー源の例には、フマル酸塩18、ペプトン18、セルロース含有有機物19、酢酸塩20、酵母抽出物19,20、キシリトール(株SIUC1)、ギ酸塩(株SIUC3)、およびH2/CO2、クエン酸塩、およびグルコースなどの他の潜在的な供給源が含まれる。最後に、培地の組成は、所望の研究に応じて変更することができる。たとえば、代表的な結果のセクションで説明した研究の主な関心は、代表的な地下嫌気性微生物が独自の混合有機スラリー(OHD13,14で処理されたトウモロコシの穂軸のスラリー)にどのように反応するかを発見することでした。したがって、そのレシピには、従来のオプションの代わりにこの炭素源が含まれていました。特定の研究に対するその他の修正の可能性には、バイオレメディエーション研究のためのプラスチック、酸、重金属、またはその他の生体異物の追加が含まれます。付加価値のある解重合製品研究のためのセルロースやプラスチックなどの難分解性炭素ポリマーの添加。小規模堆肥やその他の農業研究のための肥料と植物廃棄物の追加。
pH、酸化還元電位(ORP)、溶存酸素(DO)の測定など、培地の還元後分析が必要な場合は、そのバッチの特性を自信を持って理解するために、代表的な数の培地ボトルを犠牲にすることで間接的に行うことができます。密封されたミディアムボトルを空気にさらす場合は、開封後1分以内にORPおよびDOの測定値を測定することを強くお勧めします。酸素に依存しない測定(pHなど)は、最初の開封後、緊急性を伴わずに行うことができます。気難しい嫌気性微生物は、通常、増殖に-200mV
レサズリンは、酸素インジケーターとしてよく使用されます(このプロトコルのように)。しかしながら、より正確には酸化還元指示薬21であり、酸素が溶液の酸化還元電位を変化させるので間接的に酸素の存在を示す。溶液中のレサズリンは、最初は青色に見えます。.還元剤に曝露すると、溶液は不可逆的にピンク色に変化します。溶液をさらに還元すると、可逆的に無色に変化し、酸化するとピンク色に戻ります。著者らは、レサズリンを含む還元培地が青からピンクに変化したが、無色に変化しなかった例を観察した。しかし、著者らは、このような培地はオートクレーブ後に無色に移行することが多く、培地の煮沸と洗い流しに費やす時間が長くなると、還元剤を添加した後にレサズリンが無色の形態に移行することも観察しました。必要に応じて、培地中の酸素濃度を溶存酸素プローブで検証できます。
これらのバイオリアクターとカスタムメイドのガラスバイオリアクター自体を稼働させるために必要なすべての材料は、~$5Kを超えませんでした(これは、ウォーターバス、ポンプ、インキュベーターなどのサポート機器がすでに利用可能であることを前提としています)。これらの嫌気性培養技術は、>$10Kから始まる商用自動バイオリアクターと比較して、経済的に優しいものです。さらに、多くの商用バイオリアクターは使い捨てのリアクター容器に切り替えており、比較のダイナミクスが変化し、小規模な研究所や大学が継続的に交換する費用対効果は高くありません。さらに、市販のシステムには、製造上の化学的偏り(使用されるプラスチック、ガスケット/フィッティングのグリース、または化学的に処理された水)があり、気難しい微生物の増殖の成功に影響を与える可能性があります。低コスト、カスタマイズ性、および嫌気性環境サンプルを収集するための汎用性は、接種可能な情報に基づいた培地と組み合わせることで、研究用の濃縮物を生成し、ユニークな微生物を獲得する可能性を大幅に高めます。
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Disclosures
著者らは、利益相反がないことを宣言しています。
Acknowledgments
著者は、長年にわたってこれらの手法に影響を与え、進化させてきた情報とメンターシップの系譜を認めたいと思います。元大学院生、ポスドク、そして現在の教授であるハミルトン・ブレーム博士は、無酸素技術を教えるために時間を割いてくださったマイク・アダムス博士、ゲルティ・シュット博士、ジム・エルキンス博士、ミルチャ・ポダール博士、デュアン・モーザー博士、ブライアン・ヘドランド博士に感謝の意を表しています。ネイチャー・コンサーバンシーとアメリカン・リバーズは、それぞれ助成金G21-026-CON-PとAR-CE21GOS373を通じてこの作業を支援しました。この論文で表明された意見、調査結果、結論、または推奨事項は著者のものであり、必ずしもネイチャーコンサーバンシーまたはアメリカンリバーズの見解を反映しているわけではありません。この研究は、SIU Advanced Energy Instituteからの助成金によって支援されており、SIU Advanced Energy Instituteは、Advanced Energy Resource Boardを通じて授与された資金に感謝しています。NGSはLC Sciencesによって実施されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Materials | |||
| 1 L borosillicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 1 mL syringe with slip tip | Fisher Scientific | ||
| 10 mL glass pipette | Fisher Scientific | ||
| 100 mL culture bottle | Fisher Scientifc | ||
| 20 mm hand crimper | Fisher Scientifc | ||
| 23 G needle | Fisher Scientifc | ||
| 500 mL borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| Aluminum seal | Fisher Scientifc | ||
| Cannula, 31.5 cm length | Fisher Scientific | ||
| Cannula, 6 cm length | Fisher Scientifc | ||
| Corer | Giddings Machine Company | Assembled from company parts | |
| Gas manifold | Swagelok | Assembled from many different parts | |
| Lighter | Lowe's | ||
| N2 gas | Airgas | ||
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | ||
| Rubber stopper (for GL45 bottles) | Glasgeratebau OCHS | ||
| Rubber stopper (for culture bottles) | Ace Glass | ||
| Stirring hot plate | Corning | ||
| Trace minerals | ATCC | ||
| Vitamins | ATCC | ||
| Bioreactor-specific Materials | |||
| #10 rubber stopper | Ace Glass | ||
| #7 rubber stopper | Fisher Scientifc | ||
| 1 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 1/4" hose barb ball valve | Amazon | ||
| 10 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 3.5 L borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 5/16" - 1/4" hose barb adapter fitting | Amazon | ||
| 60 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 8 L borosillicate carboy | Allen Glass | ||
| Angled hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-20 | |
| Balloon | Party City | ||
| Borosillicate bioreactor | Allen Scientific Glass | Custom made upon request | |
| Drill | Lowe's | ||
| Female luer lock adapter coupler | Amazon | ||
| GL14 open top cap | Ace Glass | 7621-04 | |
| GL18 open top cap | Ace Glass | 7621-08 | |
| GL45 open top cap | Ace Glass | ||
| PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap | Ace Glass | 7625-06 | |
| PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap | Ace Glass | 7625-07 | |
| Ring stand | Fisher Scientific | ||
| Ring stand chain clamp | Amazon | ||
| Ring stand clamp | Fisher Scientific | ||
| Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od | Grainger | 55YG13 | |
| Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od | Grainger | ||
| Straight hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-22 | |
| Three-way stopcock | Amazon | ||
| Two-way stopcock | Amazon | ||
| Ultra low flow variable flow mini-pump | VWR | ||
| Water bath | Fisher Scientifc | ||
| White rubber septum for 13-18 mm od tubes | Ace Glass | 9096-49 | |
| Wire | Lowe's | ||
| Zip tie | Lowe's |
References
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