Summary
이 논문의 초점은 환경에서 획득한 까다로운 혐기성 미생물을 위한 배지를 만들기 위한 모범 사례를 자세히 설명하는 것입니다. 이러한 방법은 혐기성 배양을 관리하는 데 도움이 되며 찾기 어려운 배양되지 않은 미생물인 "미생물 암흑 물질"의 성장을 지원하는 데 적용할 수 있습니다.
Abstract
혐기성 미생물의 배양 의존적 연구는 방법론적 역량에 달려 있습니다. 이러한 분석법은 혐기성 미생물에 적합한 성장 조건(예: pH 및 탄소원)을 만들고 유지하는 동시에 인공 환경을 손상시키지 않고 샘플을 추출할 수 있어야 합니다. 이를 위해 현장 환경에 의해 정보를 얻고 시뮬레이션하는 방법은 해당 환경에서 미생물을 배양하는 데 큰 도움이 될 수 있습니다. 여기에서는 지상 표면 및 지하 미생물을 배양하기 위한 현장 정보 및 시뮬레이션 혐기성 방법을 간략하게 설명하고 교란을 최소화한 혐기성 샘플 수집을 강조합니다. 이 프로토콜은 맞춤형 혐기성 액체 배지의 생산과 혐기성 미생물의 환경 획득 및 시험관 내 성장에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 환경적으로 획득한 배양을 위한 퇴적물 및 혐기성 액체 매체의 환경 시뮬레이션에 사용되는 혐기성 생물반응기의 중요한 구성 요소를 다룹니다. 우리는 실험적 탄소원에 반응하여 활성 배양이 동적으로 조정되는 생물반응기의 수명 동안 유지된 마이크로바이옴의 예비 차세대 염기서열 분석 데이터를 포함했습니다.
Introduction
대부분의 미생물은 배양되지 않은 상태로 남아 있습니다. 이것은 한천 플레이트를 사용하여 성공적으로 배양된 소수의 미생물과 대조되는 현미경을 통해 관찰된 세포 간의 큰 불균형에 의해 뒷받침됩니다. 스탈리(Staley)와 코놉카(Konopka)는 이 차이를 "판금 카운트 변칙(Great Plate Count Anomaly)"이라고 명명했다.[1] 추정된 설명되지 않은 다양성은 여러 다른 환경에서 순위 풍부도 곡선에 분포된 많은 새로운 속을 보여주는 메타게놈 및 메타전사체 데이터에 의해 뒷받침된다2. 관찰되었지만(일반적으로 미생물 군집의 무작위 샷건 시퀀싱에 의해) 배양되지 않은 미생물은 "미생물 암흑물질"(microbial dark matter)이라고 불립니다.3,4.
-omics의 시대에 미생물 배양은 게놈 데이터를 완전히 평가하고 존재하는 유전자의 기능/표현형을 검증하는 데 필수적입니다. 배양된 미생물의 염기서열 분석은 샷건 균유전체학(shotgun metagenomics) 및 환경으로부터 메타게놈 조립 게놈(metagenome-assembled genomes)과 같은 기술이 허용될 때까지 완전한 게놈을 자신 있게 얻을 수 있는 유일한 방법이다5. 배양된 미생물과 결합된 게놈 평가는 "미생물 암흑 물질"을 이해하기 위한 강력한 추론을 제공합니다. "미생물 암흑 물질"의 많은 구성원은 영양소 및 기타 원소의 순환과 귀중한 천연 제품의 생산에 영향을 미치고 생태계를 지원하며 생태 서비스를 수행하는 중요한 기능을 수행합니다. 의학적 관점에서 볼 때, 현재 판매되고 있는 모든 의약품의 약 절반은 박테리아 제품 및 제품의 파생물이며, 배양되지 않은 종을 프로파일링하면 미래의 항생제를 밝힐 수 있을 것으로 의심됩니다. 이 비교양 다수에게 접근하기 위해서는 다양한 재배 방법론을 늘려야 한다6. "미생물 암흑물질(microbial dark matter)"의 구성원 중 혐기성 과소영양 미생물은 대체로 과소 보고되고 있으며, 생태학적으로나 산업적으로 가치 있는 생화학적 경로7를 보유하고 있을 가능성이 높기 때문에 배양의 중요한 표적이 된다. 그러나 혐기성 과소 영양 미생물은 종종 더 긴 배양 시간이 필요하고, 까다로운 조건(예: 특정 비표준 체외 온도) 및 특수 배지 레시피의 사용으로 인해 호기성 및 코피오영양 미생물보다 배양하기가 더 어렵습니다.
새로운 혐기성 과소 영양 미생물을 포함하여 "미생물 암흑 물질"의 구성원을 배양하기 위한 현재 개발 기술은 우리의 이해를 크게 향상시키고 계통 발생 나무 내에서 이러한 미생물의 표현을 증가시켰습니다. 새로운 미생물을 배양하기 위해 정보에 입각한 배지를 사용하는 현재 기술(즉, 관심 미생물에 대한 지식을 사용하여 유도된 배지)은 세 가지 뚜렷한 방법으로 구분할 수 있습니다. 첫 번째 방법은 멤브레인 내에 이미 관심 미생물을 포함하는 시험관 내 성장 챔버로 전달하기 위해 환경의 개별 부분을 직접 제거하는 것입니다. 개별 섹션(예: 해수)은 관심 미생물이 현장에서 사용하는 지구화학적 서식지를 제공하는 역할을 하는 반면, 멤브레인은 세포의 이동을 억제합니다(관심 세포는 내부에 남아 있고 개별 섹션과 함께 도착한 외부 세포는 남아 있지 않음). 자연 서식지에서 미생물을 표적으로 하는 데 자연적으로 이용 가능한 화합물을 포함시킴으로써, 이러한 미생물을 배양할 수 있다8. 두 번째 방법은 메타전사체학 또는 유전체학을 활용하여 대사 능력을 규명하여 표적 배지 설계에 대한 배양 매개변수를 좁힐 수 있는 단서를 제공합니다. 이 접근법은 환경에서 특정 유형의 미생물을 풍부하게 하는 데 사용할 수 있는 생태생리학적 프로필을 제공합니다. 배지의 조항은 농축 다양성을 감소시키기 위해 표적 미생물을 지원하는 것으로 추정되는 존재하는 확인된 유전자에 맞춰져 있습니다.9,10. 한 가지 주의할 점은 게놈 정보는 유전자의 발현을 직접 추론하지 않는 반면, 전사체 정보는 유전자의 발현을 직접 추론한다는 것입니다.
세 번째 방법은 미디어를 시뮬레이션하지 않고 환경을 미디어 소스로 직접 사용하는 첫 번째 방법과 달리 환경 정보에 입각한 시뮬레이션된 미디어를 포함합니다. 이 세 번째 방법은 관심 미생물이 포함된 현장 현장의 지구화학에 대한 환경 정찰이 필요합니다. 이러한 지식을 바탕으로 기본 구성 요소와 물리적 매개변수를 식별하여 환경에 입각한 시뮬레이션 매체를 생성합니다. 그런 다음 배지는 환경에서 미생물 함유 침전물 또는 액체를 배지로 직접 주입합니다. 이 방법은 배양 미생물학자가 충분한 양의 소스 환경(첫 번째 방법에 필요함) 또는 적절한 메타전사체 또는 게놈 데이터(두 번째 방법에 필요한 경우)에 액세스할 수 없는 경우에 특히 유용합니다.
다음 프로토콜은 세 번째 방법의 예입니다. 관심 있는 환경을 시뮬레이션하는 것을 목표로 합니다. 현장에서 획득한 다양한 혐기성 미생물 배양을 표적으로 하는 세 가지 순진한 배지 레시피가 프로토콜 내에서 병렬로 제시됩니다. 대표되는 3가지 배양물은 토양에서 유래한 혼합배양(이하, 토양 혼합 배양), 시추공 내에서 유래한 혼합 배양(이하, 시추공 혼합 배양), 시추공 내에서 유래한 분리 메탄겐(이하, 시추공 분리 메탄원)이다. 여기에 공유된 미디어 레시피의 복합 정체성과 양은 시작 가이드로 사용됩니다. 그들은 독자의 환경과 관심 미생물에 맞게 맞춤화할 수 있고 권장됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 맞춤형 혐기성 액체 매체 생산
- 배양병용 배지(500mL 생산)
- 화합물을 측정하여 1L 병에 추가하고 판독기의 관심 배양액에 해당하는 표 1 의 컬럼을 사용하여 pH를 조정합니다( 표 1 의 양은 1,000mL 생산에 대해 기록되었으므로 그에 따라 조정). 병을 휘저어 균질하게 화합물을 혼합합니다.
- 병을 전자레인지에 5-6분 동안 돌려 액체를 끓입니다. 전자레인지를 자주 열고 내열 장갑을 사용하여 액체를 부드럽게 휘젓습니다. 거품이 난 후 액체가 잠잠해지면 전자레인지를 빠르게 엽니다. 그렇지 않으면 액체가 빠르게 팽창하여 병이 넘칠 수 있습니다.
- 멸균 10mL 유리 피펫을N2 가스 매니폴드 설정에 부착합니다(Balch et al.11의 설계를 기반으로 함, 순도의N2 가스에 대해 가열된 구리 컬럼이 필요하지 않음, 자세한 가스 매니폴드 정보는 보충 파일 1 참조). 매니폴드를 열어O2 를 배출하고N2 가스가 흘러나오도록 합니다.
- 피펫 팁을 액체에 넣고 기포가 적당히 강해지도록 가스의 흐름을 조정합니다. 병이 더 이상 만질 수 없을 정도로 뜨겁지 않을 때까지 N2 로 액체를 씻어냅니다.
참고: 미디어 내용에 따라 다르지만 일반적으로 ~20분이 소요됩니다. - 병이 식을 때까지 기다리는 동안 멸균 100mL 배양병 10개를 준비합니다. 또는 토양 혼합 배양 수집을 위한 배지를 준비하는 경우 멸균 500mL 병 2개를 준비합니다.
- 미디어 병을 만졌을 때 식으면 피펫 팁을 병의 헤드 공간으로 당깁니다. 0.125g의 NaHCO3와 0.300g의Na2S∙9H2O를 첨가하고 레사주린이 무색으로 변할 때까지 기다립니다.
주의 : Na2S∙9 H2O는 부식성, 독성 및 자극제입니다. 취급 시 개인 보호 장비를 사용하고 금속 도구를 접촉한 후에는 철저히 헹굽니다. - 레사주린의 색이 변할 때까지 기다리는 동안 금속 캐뉼라를 가스 매니폴드 설정에 부착하고 캐뉼라 팁을 배양병에 넣습니다. 병으로의 N2 의 흐름을 적당한 속도로 조정하여 후속 단계에서 추가 된 액체가 가스 흐름으로 인해 출렁이지 않도록합니다.
- 레사주린이 무색이 되면 각 배양병에 50mL의 액체를 분양하거나 각 500mL 병에 250mL의 액체를 분취합니다.
- 캐뉼라를 제거한 직후 일치하는 크기의 고무 마개로 각 병의 뚜껑을 닫습니다. 알루미늄 씰(배양병용) 또는 GL45 개방형 상단 나사 캡(500mL 병용)으로 스토퍼를 고정합니다.
- 병을 오토클레이브 가능한 쓰레기통에 넣고 수위가 병의 수위와 일치할 때까지 수돗물로 통을 채웁니다.
알림: 이렇게 하면 고압멸균하는 동안 유리의 온도 차이로 인한 응력으로 인해 병이 파열되지 않습니다. - 121°C에서 30분 동안 병을 고압멸균합니다.
- 생물 반응기용 매체(8L 생산)
- 카보이의 준비
- 1/4"(6.4mm) 호스 미늘 볼 밸브의 밸브를 엽니다. 6/1"(4mm) 내경(ID) 및 1/2"(6.4mm) 외경(OD) 실리콘 튜브 2개를 호스 미늘 볼 밸브의 양쪽 끝에 부착합니다.
- 어셈블리의 한쪽 끝에 5/16"-1/4"(7.9mm-6.4mm) 호스 바브 어댑터 피팅을 부착합니다. 어셈블리의 다른 쪽 끝을 8L 카보이의 호스 미늘에 부착합니다.
- 지퍼 타이를 사용하여 카보이의 호스 바브와 튜브 사이의 연결부와 호스 바브 어댑터 피팅과 튜브 사이의 연결을 고정합니다.
- 121°C에서 30분 동안 조립하여 카보이를 오토클레이브합니다.
- 중간 생산
- 8L 카보이 어셈블리에 있는 호스 바브 볼 밸브의 밸브를 닫습니다.
- 화합물을 측정하여 8L 카보이에 추가하고 판독기의 관심 배양에 해당하는 표 1 의 컬럼을 사용하여 pH를 조정합니다( 표 1 의 양은 1,000mL 생산에 대해 기록되었으므로 그에 따라 조정). 교반 막대를 추가하고 교반 핫 플레이트를 사용하여 화합물을 균질하게 혼합합니다.
- 교반 열판으로 액체를 끓일 때까지 가열합니다. 액체를 30분 동안 끓입니다.
알림: 액체를 끓일 때까지 가열하는 것은 매체의 내용물에 따라 다르지만 2-3시간이 걸릴 수 있습니다. - 멸균 10mL 유리 피펫을N2 가스 매니폴드 설정에 부착합니다(Balch et al.11의 설계를 기반으로 함, 순도의N2 가스에 대해 가열된 구리 컬럼이 필요하지 않음, 자세한 가스 매니폴드 정보는 보충 파일 1 참조). 매니폴드를 열어O2 를 배출하고N2 가스가 흘러나오도록 합니다.
- 불을 끈 다음 피펫 팁을 액체에 넣고 기포가 적당히 활발하지만 넘치지 않도록 가스의 흐름을 조정합니다. 액체를 N2 로 30분 동안 플러시합니다.
- 피펫 팁을 카보이의 헤드스페이스로 당깁니다. 2.0g의 NaHCO3와 4.8g의Na2S∙9H2O를 첨가하고 레자주린이 무색이 될 때까지 기다립니다.
주의 : Na2S∙9 H2O는 부식성, 독성 및 자극제입니다. 취급 시 개인 보호 장비를 사용하고 금속 도구를 접촉한 후에는 철저히 헹굽니다. - 레자주린이 무색이 되면 유리 피펫을 제거하고 즉시 #10 스토퍼로 카보이를 덮습니다. 스토퍼 위와 카보이의 입술 주위에 와이어를 비틀어 스토퍼를 고정합니다.
- 카보이의 준비
2. 환경 혐기성 미생물의 현장 획득
- 표면 혐기성 시료 채취(토양 혼합 배양)
- 위와 같이 만든 혼합 토양 배양 배지 병과 코어를 현장으로 가져옵니다.
참고 : Giddings 2 5/8 "표준 테이퍼 토양 비트는 저자가 사용합니다 (재료 표). 그러나 원하는 깊이로 샘플링할 수 있는 모든 토양 코어러 또는 흙손을 사용할 수 있습니다. - 샘플 수집 실린더의 상단이 침전물 표면과 같은 높이가 될 때까지 코어를 침전물로 밀어 넣습니다(파일/스테이크 드라이브).
- 코어를 90° 비틀어 코어를 해제하고 샘플이 환경에서 추출될 때까지 위쪽으로 당깁니다.
- 느슨한 퇴적물(예: 습지를 채취할 때 발생할 수 있는 것)에서는 추출할 때 새 니트릴 장갑을 낀 손으로 코어 바닥을 덮어 추출 시 샘플이 떨어지거나 물로 퍼지는 것을 방지합니다.
- 심의 바닥에서 6-7cm 위로 눈으로 빠르게 근사합니다. 새 니트릴 장갑을 낀 손을 사용하여 코어를 자르고 바닥을 6-7cm 분리합니다.
- 코어의 바닥을 즉시 배양 병으로 옮깁니다. 토양/침전물이 너무 크면 병에 더 쉽게 맞도록 빠르게 성형하여 호기성 대기에 대한 노출을 최대한 최소화하십시오.
- 샘플이 옮겨지면 즉시 스토퍼의 위치를 조정하고 나사 캡으로 제자리에 고정합니다.
- 샘플을 시원하게 유지하십시오. 실험실로 돌아오면 수집 병을 4°C에서 냉장 보관합니다.
- 위와 같이 만든 혼합 토양 배양 배지 병과 코어를 현장으로 가져옵니다.
- 지하 혐기성 시료 채취(시추공 혼합 배양)
- 가스 매니폴드 옆에 멸균된 1L 병을 놓습니다. 고무 마개로 병을 덮습니다. 스토퍼에 100% 에탄올을 떨어뜨리고 라이터를 사용하여 불을 붙입니다.
- 멸균 23G 바늘을 N2 가스 매니폴드 설정에 부착합니다. 매니폴드를 열어O2 를 배출하고N2 (또는 Ar) 가스가 적당한 속도로 흘러나오도록 합니다.
- 마개가 더 이상 불이 붙지 않으면 바늘을 병에 삽입하십시오. 가스 매니폴드에 부착되지 않은 두 번째 멸균 23G 바늘을 병에 삽입합니다. 1-2분 동안 병을 세척합니다.
- 가스 매니폴드에 부착되지 않은 바늘을 빼냅니다. 1분 동안 병에 압력을 가합니다. 나머지 바늘을 빼냅니다.
- 가압된 병과 멸균된 23G 바늘을 시추공 부위로 가져옵니다. Merino et al.12의 방법에 따라 시추공에서 액체를 끌어냅니다.
알림: 시추공의 방법, 연결 및 유속에 따라 물 샘플 획득 전략이 변경됩니다. 물의 흐름이 연속적인 경우 2.2.6단계에 설명된 대로 물을 수집합니다. 충분할 것입니다. 물의 흐름이 배치 수집되거나 저유량인 경우 대체 입구/출구 방법을 사용할 수 있습니다. 모든 상황에서 오염을 최소화하고 수집된 샘플이 샘플링하려는 환경을 대표하는지 확인하십시오. 이는 정부 또는 민간 사이트의 모든 샘플 수집 이벤트가 사용 가능한 접근성에 매우 적합해야 한다는 저자의 경험이었기 때문에 광범위하게 일반화된 진술입니다. - 병을 빠르게 열고 액체를 펌핑하여 병을 완전히 채운 다음 병을 닫습니다.
- 현장으로 가져온 23G 바늘을 병의 고무 마개에 삽입하여 병의 압력을 완화합니다. 바늘을 빼냅니다.
- 샘플을 시원하게 유지하십시오. 실험실로 돌아오면 수집 병을 4°C에서 냉장 보관합니다.
3. 현장에서 획득한 혐기성 미생물의 시험관 내 성장
- 배양 보틀에 의한 성장
- 마개가 달린 N2 의 멸균 병과 위와 같이 준비된 배양 병 및 수집 병을 준비합니다. 스토퍼에 100% 에탄올을 떨어뜨리고 라이터를 사용하여 불을 붙입니다.
- 23G 바늘을 1mL 주사기에 조립합니다. 마개가 더 이상 불이 붙지 않으면 바늘을 N2 병에 삽입하고 ~ 1mL의 N2 를 끌어 올립니다. 바늘을 빼냅니다.
- 플런저를 천천히 눌러 N2를 풉니다. 주사기가 비워지자마자 바늘을 채취 병에 삽입하고 0.5mL의 환경 시료를 채취합니다. 바늘을 빼냅니다.
- 바늘을 배양병에 삽입하고 샘플을 주입합니다. 바늘을 빼냅니다.
- 병을 소용돌이치고 표 1 또는 독자의 관심 환경에 따라 온도에서 인큐베이터에 넣습니다.
참고: 배양 진행(병 또는 생물반응기)은 0.02mm 깊이의 Petroff-Hauser 혈구측정기를 사용하여 모니터링됩니다. 혐기성 또는 까다로운 미생물의 농축은 일반적으로 OD600 을 사용할 수 있는 세포 밀도에 도달하지 못하며, 다른 검출 방법은 일상적이고 반복적인 모니터링에 적합하지 않습니다. 검출 한계, 품질 관리 및 통계 계산은 세포 계수 챔버의 유형과 사용자의 요구에 따라 다릅니다.
- 생물반응기에 의한 성장
- 수정 된 주사기로 풍선 준비
- 3개의 10mL 루어 락 시린지(각 최종 어셈블리에 하나씩)에서 플런저를 제거합니다. 각 주사기에서 플랜지를 잘라내고 잘린 끝이 풍선을 뚫지 않도록 정리합니다. 수정된 주사기에서 filed 칩을 모두 제거합니다.
- 한 풍선을 다른 풍선 안에 넣어 두 배로 된 풍선을 준비합니다.
- 변형된 10mL 주사기 위로 이중 풍선의 끝을 늘립니다.
- 바깥쪽 풍선의 끝을 안쪽 풍선에서 약간 분리합니다. 풍선 사이에 갇힌 공기를 모두 짜냅니다.
- 풍선 바닥 주위의 지퍼 타이를 조여 풍선을 주사기에 고정합니다.
- 수정 된 스토퍼 준비
- 1mL 루어 락 주사기 10개(수정할 각 스토퍼당 2개)에서 플런저를 제거합니다. 주사기에서 플랜지를 잘라냅니다.
- #10 크기의 고무 마개 2개(8L 카보이용)와 GL45 나사산 마감 처리된 병용 3개의 크기(캐치 병용)를 준비합니다. 1/4"(6.4mm) 드릴 비트를 사용하여 수정된 주사기가 맞을 수 있을 만큼 충분히 넓고 밀폐될 수 있을 만큼 좁게 각 고무 스토퍼의 상단을 통해 두 개의 구멍을 뚫습니다.
- 고무 마개의 구멍을 통해 수정된 주사기를 삽입합니다.
- 수정된 스토퍼를 121°C에서 30분 동안 세척하고 고압멸균합니다.
- 생물반응기 조립체의 준비
- 70% 에탄올로 모든 마개, 암 루어 잠금 어댑터 커넥터 및 기타 비오토클레이브 바이오리액터 재료를 소독하고 121°C에서 30분 동안 모든 튜브(길이로 절단한 후), 스토퍼, 유리솜 및 기타 오토클레이브 가능한 바이오리액터 재료를 오토클레이브합니다.
- 멸균 생물반응기(그림 1 및 그림 2)를 링 스탠드에 놓고 체인 스트랩으로 고정합니다. 또한 수조, 연동 펌프, 배지가 들어 있는 스토퍼가 있는 8L 카보이(프로토콜 단계 1.2부터), 3.5L 병 1개(비샘플링 캐치 병) 및 500mL 병 1개(샘플링 캐치 병)를 설정합니다.
- 카보이 스토퍼링
- 수정된 주사기로 풍선을 놓습니다. 3방향 마개를 주사기의 루어 잠금 팁에 연결합니다.
- 풍선 어셈블리를 가져 와서 3 방향 마개를 N2 탱크의 튜브에 연결합니다. 3방향 마개를 돌려 대기로 열린 끝을 차단합니다.
- 가스 탱크를 열고 풍선에 N2를 채웁니다. 가득 차면 3방향 마개를 돌려 풍선 끝을 막습니다. 가스 탱크를 닫고 3방향 마개에서 탱크 튜브를 분리합니다.
- 3방향 마개(수정된 주사기가 있는 풍선), 양방향 마개, 암 루어 잠금 어댑터 커플러 및 수정된 스토퍼 주사기 중 하나의 루어 잠금 팁을 순서대로 연결합니다.
- 다른 주사기의 루어 잠금 팁에 양방향 마개를 연결합니다. 수정된 스토퍼 어셈블리에서 양방향 스톱콕의 두 밸브를 모두 닫습니다.
- 카보이의 수정되지 않은 크기 #10 스토퍼를 고정하는 와이어를 풉니다. 수정되지 않은 스토퍼를 수정된 스토퍼 어셈블리로 빠르게 교체하고 이전과 같이 와이어를 비틀어 수정된 스토퍼 어셈블리를 카보이에 고정합니다.
알림: 자신 있고 준비된 경우 수정된 스토퍼 어셈블리를 사용하여 매체 준비의 마지막 단계(단계 1.2.2.7)에서 카보이를 스토퍼할 수 있습니다. - 3방향 마개를 돌려 대기로 열린 끝을 차단합니다. 순차적 양방향 마개를 엽니다. 이제 풍선의 가스와 8L 카보이의 헤드스페이스가 연결됩니다.
- 비샘플링 및 샘플링 캐치 병 스토퍼
- GL45 나사산 마감 처리된 병에 맞게 수정된 스토퍼가 있는 3.5L 비샘플링 캐치 병을 스토퍼하고 스토퍼 바닥에 70% 에탄올을 도포하여 병에 맞춥니다. GL45 개방형 상단 나사 캡으로 병 캡을 씌웁니다.
- 개조된 주사기의 루어 잠금 팁이 있는 풍선, 3방향 마개, 암 루어 잠금 어댑터 커플러, 수정된 스토퍼 주사기 중 하나의 루어 잠금 팁을 순서대로 연결합니다. 3방향 마개를 돌려 끝이 대기에 직접 열리도록 차단합니다.
- 다른 주사기의 루어 잠금 팁에 암 루어 잠금 어댑터 커플러를 연결합니다.
- 500mL 샘플링 캐치 병에 대해 위의 세 단계를 반복합니다.
- 튜빙 설정
- 생물 반응기 워터 재킷 포트와 수조 호스 미늘 사이의 거리를 측정합니다. 이 거리에 걸쳐 3/16"(4.8mm) ID, 3/8"(9.5mm) OD 실리콘 튜브의 두 가지 길이를 자릅니다.
- GL14 개방형 상단 나사 캡이 있는 두 개의 직선 호스 커넥터를 조립합니다. 두 튜브 조각의 한쪽 끝에 각각을 부착합니다.
- 나사 캡을 생물반응기 워터 재킷의 포트에 비틀어 끼웁니다. 튜브의 다른 쪽 끝을 수조 호스 미늘에 부착하여 물이 수조에서 흘러나오도록 하고, 생물반응기 워터 재킷의 바닥으로 들어가고, 워터 재킷의 상단에서 빠져나와 수조로 돌아갑니다. 튜브 끝 주위의 지퍼 타이를 조여 튜브를 수조 호스 미늘에 고정합니다.
- VWR 초저유량 가변 유량 미니 펌프와 유사한 펌프의 경우 함께 제공되는 3/16"(4.8mm) OD 슬롯형 튜빙 어셈블리를 펌프에 끼우십시오.
- 카보이 튜빙 어셈블리와 연동 펌프 튜빙 어셈블리 사이의 거리를 측정합니다. 이 거리에 걸쳐 3/16"(4.8mm) ID, 3/8"(9.5mm) OD 실리콘 튜브의 길이를 자릅니다.
- 튜브의 한쪽 끝을 카보이 튜빙 어셈블리의 호스 바브에 부착하고 다른 쪽 끝을 연동 펌프 튜빙 어셈블리의 호스 바브에 부착하여 매체가 카보이에서 연동 펌프를 통해 흐르도록 방향을 지정합니다.
- 연동 펌프 튜빙 어셈블리와 생물 반응기의 하단 포트 사이의 거리를 측정합니다. 이 거리에 걸쳐 3/16"(4.8mm) ID, 3/8"(9.5mm) OD 실리콘 튜브의 길이를 자릅니다.
- 이 튜브의 한쪽 끝을 연동 펌프 튜브 어셈블리의 호스 미늘에 부착하고 다른 쪽 끝을 생물 반응기의 하단 포트에 조심스럽게 부착합니다. 유리가 깨지지 않도록 주의하고 연결부를 고정하기 위해 튜브 끝 주위의 지퍼 타이를 조여 튜브를 생물 반응기의 하단 포트에 고정합니다.
- 5/127"(3mm) ID, 16/3"(4.8mm) OD 실리콘 튜브의 약 9.5mm(3인치) 길이를 측정하고 자릅니다.
- 암 루어 잠금 어댑터 커넥터를 3방향 마개에 연결합니다. 3방향 마개의 끝을 튜브에 부착합니다.
- GL14 개방형 상단 나사 캡이 있는 각진 호스 커넥터 하나를 조립합니다. 튜브의 다른 쪽 끝에 부착합니다.
- 나사 캡을 생물반응기의 맨 위 수직 포트에 비틀어 놓습니다. 3방향 마개를 돌려 생물 반응기를 가리키는 끝을 차단합니다.
- 맨 위의 수직 포트 어셈블리와 비샘플링 캐치 병 어셈블리 사이의 거리를 측정합니다. 이 거리에 걸쳐 3/16"(4.8mm) ID, 3/8"(9.5mm) OD 실리콘 튜브의 길이를 자릅니다. 두 개의 1mL 루어 락 주사기의 플랜지를 잘라내고 튜브 끝에 삽입합니다.
- 이 튜빙 어셈블리의 한쪽 끝을 최상위 수직 포트 어셈블리의 3방향 꼭지에 부착하고 다른 쪽 끝을 논샘플링 캐치 병 어셈블리의 암 루어 잠금 어댑터 커넥터에 부착합니다.
- 맨 위의 수직 포트 어셈블리와 샘플링 캐치 병 어셈블리 사이의 거리를 측정합니다. 이 거리에 걸쳐 3/16"(4.8mm) ID, 3/8"(9.5mm) OD 실리콘 튜브의 길이를 자릅니다. 두 개의 1mL 루어 락 주사기의 플랜지를 잘라내고 튜브 끝에 삽입합니다.
- 이 튜빙 어셈블리의 한쪽 끝을 최상위 수직 포트 어셈블리의 3방향 마개에 부착하고 다른 쪽 끝을 샘플링 캐치 병 어셈블리의 암 루어 잠금 어댑터 커넥터에 부착합니다.
- 바이오리액터 충진
- 생물 반응기의 GL18 포트 중 하나를 흰색 고무 격막으로 덮습니다. 다른 GL18 포트와 나머지 수직 노출 GL14 포트를 GL18/GL14 크기의 PTFE 표면 실리콘 격막(PTFE가 유리를 향함)으로 덮고 상단 나사 캡을 엽니다.
- 50cm 길이의 막대를 사용하여 0.9g의 유리솜을 생물 반응기 바닥에 포장합니다.
- 121°C에서 30분 동안 1.3L의 모래를 오토클레이브합니다. 깔때기를 사용하여 생물 반응기에 모래를 채웁니다.
참고: 독자의 환경과 관심 미생물에 의해 정보를 얻은 다른 퇴적물 유형은 여기에서 대체할 수 있습니다. - N2 탱크에 튜브를 바이오리액터 상단에 놓고 바이오리액터 헤드스페이스를N2로 2분 동안 플러시합니다. #7 크기의 스토퍼와 GL45 개방형 상단 나사 캡으로 바이오리액터를 즉시 캡을 씌웁니다.
- 논샘플링 캐치 병에서 튜브를 분리하고 3방향 마개를 돌려 풍선을 가리키는 끝을 차단합니다. 튜브를 N2 탱크에 연결하여 암 루어 잠금 어댑터 커넥터에 연결하고 바이오리액터 헤드스페이스를 N2 로 2분 동안 세척합니다. 즉시 튜브를 다시 연결하고 3방향 마개를 되돌려 대기로 열린 끝을 차단합니다.
- 샘플링 캐치 병에 대해 위의 단계를 반복합니다.
- 생물 반응기의 맨 위 수직 포트의 3방향 마개를 돌려 샘플링 캐치 병을 가리키는 끝을 차단합니다. 카보이의 액체를 생물 반응기로 펌핑합니다. 펌프를 일시 중지하고 샘플링 병의 풍선을 배출하고 필요에 따라 카보이의 풍선에 N2 를 채웁니다.
- 바이오리액터에 배지가 채워지면 펌프 유속을 0.6mL/분(Mini-Pump의 디지털 값 40)으로 설정합니다.
알림: 다른 판독기 원하는 유량은 여기에서 대체할 수 있습니다. - 표 1 또는 독자의 관심 환경에 따라 수조 온도를 설정합니다.
참고: Inoculum은 연구 세부 사항에 따라 이 시점 또는 나중에 추가할 수 있습니다. 이 시점에서 접종하는 경우 3.2.4.10단계로 진행하십시오. 나중에 접종하는 경우 3.2.5단계로 진행하십시오. - 수집 병 또는 접종된 배양 병과 마개가 있는 N2 멸균 병을 준비합니다. 스토퍼에 100% 에탄올을 떨어뜨리고 라이터를 사용하여 불을 붙입니다.
- 23G 바늘을 60mL 주사기에 조립합니다. 마개가 더 이상 불이 붙지 않으면 바늘을 N2 병에 삽입하고 ~ 50mL의 N2 를 끌어 올립니다. 바늘을 빼냅니다.
- 플런저를 천천히 눌러 N2를 풉니다. 주사기가 비워지자마자 바늘을 채취 병에 삽입하고 50mL의 환경 샘플을 채취합니다. 바늘을 빼냅니다.
- 23G 바늘을 멸균 된 긴 금속 바늘 (캐뉼라, 길이 31.5cm)로 교체하십시오. 생물반응기의 GL18 포트에 있는 흰색 고무 격막을 통해 긴 금속 바늘을 삽입합니다.
- 침전물에 바늘을 밀어 넣고 접종물을 주입합니다. 바늘을 빼냅니다.
- 바이오리액터 유지보수 실행
- 생물 반응기가 작동하는 매일 다음을 수행하십시오.
- 수조 수위를 확인하십시오. 물이 부족하면 물을 더 추가합니다(부식 및 미네랄 축적을 줄여 장비 수명을 위해 증류수 사용).
- 비 샘플링 캐치 병의 풍선을 확인하십시오. 가득 찬 풍선은 매체의 흐름을 억제합니다. 가득 차면 3방향 마개를 돌려 캐치 병을 가리키는 끝을 차단합니다. 풍선을 짜서 비우십시오. 그런 다음 3방향 마개를 되돌려 대기에 열려 있는 끝을 차단합니다. 풍선이 비워질 때까지 반복합니다.
- 8L 카보이의 풍선을 확인하십시오. 낮으면 순차적 양방향 꼭지를 닫고 양방향 꼭지에서 3방향 꼭지를 분리합니다. 3.2.3.3.2, 3.2.3.3.3 및 3.2.3.3.7 단계에 따라 부품 번호 어셈블리를 다시 채우고 다시 부착합니다.
- 8L 카보이의 매체 레벨을 확인하십시오. 부족하면 다른 8L 카보이를 조립하고 프로토콜 단계 1.2에 따라 더 많은 매체를 준비합니다. 및 3.2.3.3. 펌프를 일시 중지하고 호스 미늘 볼 밸브를 닫고 기존 카보이를 빠르게 분리하고 새 카보이를 연결합니다.
참고: 0.6mL/분의 유속의 경우 9일마다 새 배지가 필요합니다. - 샘플링되지 않은 캐치 병의 매체 수준을 확인하십시오. 가득 차면 다른 비 s를 조립하십시오.amp3.2.3.4.1단계에 따라 캐치 병. N2로 새 병을 세척하고 기존 병에서 수정된 주사기와 튜브로 풍선을 빠르게 분리한 다음 새 병에 연결합니다.
- 전체 non-s에서 수정된 스토퍼를 제거합니다.amp링 캐치 병. 액체를 121°C에서 30분 동안 고압멸균합니다. 그런 다음 독자의 기관 정책에 따라 액체를 폐기하십시오. non-s의 모든 조각을 청소하고 오토클레이브amp링 캐치 병 어셈블리를 사용하여 다음 사용을 준비합니다.
- 다음을 수행하여 7일(또는 독자가 원하는 수)마다 샘플링을 수행합니다.
- 생물 반응기의 맨 위 수직 포트의 3방향 꼭지를 돌려 비샘플링 캐치 병을 가리키는 끝을 차단합니다. 250mL의 액체를 수집합니다.
참고: 유속이 0.6mL/분인 경우 250mL를 수집하는 데 ~7시간이 걸립니다. - 생물 반응기의 맨 위 수직 포트의 3방향 꼭지를 되돌려 샘플링 캐치 병을 가리키는 끝을 차단합니다. 튜브와 샘플링 캐치 병을 생물 반응기 상단 수직 포트의 3방향 꼭지에서 분리합니다.
- 테스트, 보관 및/또는 적절한 폐기 후amp액체, 수정된 주사기로 풍선을 제외한 s의 모든 s를 청소하십시오.amp링 캐치 병 어셈블리. 수정된 주사기 및 암 루어 잠금 어댑터 커넥터가 있는 풍선을 제외한 모든 부품을 121°C에서 30분 동안 오토클레이브합니다. 다음 샘플링 날을 위해 재조립하십시오.
알림: 필요한 경우 신속한 수리 및 교체를 위해 부품, 캡, 튜브 및 격막의 중복 또는 삼중 중복을 갖는 것이 좋습니다.
- 생물 반응기의 맨 위 수직 포트의 3방향 꼭지를 돌려 비샘플링 캐치 병을 가리키는 끝을 차단합니다. 250mL의 액체를 수집합니다.
- 생물 반응기가 작동하는 매일 다음을 수행하십시오.
- 수정 된 주사기로 풍선 준비
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
여기에서, 우리는 본원에 기술된 바와 같은 시추공 혼합 배양 배지 제조방법 및 생물반응기 셋업 방법을 사용한 생물반응기 연구의 결과를 나타낸다. 시추공 혼합 배양 배지는 산화적 열수 용해(OHD)13,14에 의해 처리된 옥수수 속대의 슬러리를 탄소원으로서 함유하도록 변형되었다. 개질된 시추공 혼합 배양 배지를 0.4mL/분의 속도로 44일 동안 생물반응기로 펌핑하였다. 23일째에는 미국 네바다주 데스밸리 지역의 시추공 BLM-1에서 채취한 접종물15개가 추가됐다. 생물반응기로부터의 액체 샘플은 1일, 8일, 15일, 22일, 23일(접종 후), 30일, 37일 및 44일에 샘플링 캐치 보틀에서 수집하였다.
접종 배양물(및 생물반응기 퇴적물의 접종 전 오토클레이브 생존 거주자)의 일반적인 상태를 추적하기 위해 생물반응기 액체 샘플을 직접 세포 수로 관찰했습니다. 샘플링된 액체의 직접 세포 계수는 Petroff-Hauser 혈구측정기로 수행되었습니다. 생물반응기의 미생물 구성원의 정체를 알아보기 위해 생물반응기 액체 샘플에서 DNA를 추출하고 16S rRNA 유전자를 차세대 염기서열분석(NGS)으로 분석했습니다. NGS 데이터는 MiSeq SOP16에 따라 mothur를 사용하여 사내에서 처리되었습니다.
접종 전에는 직접 세포 수가 검출 한계(b.d.l.)인 1.0 × 106 cells/mL 미만인 경우가 많았습니다. 23일째(접종 후)에는 2.6 × 106 cells/mL의 낮은 세포 수를 보인 반면, 그 다음 30일, 37일, 44일째에는 1.0 × 107 cells/mL 이상의 세포 수를 보였습니다(그림 3). 세포 수는 1일, 8일, 22일에 b.d.l.이었지만, 모든 시점에서 NGS를 위해 DNA를 추출하여 고압멸균 후에도 퇴적물에 접종 전 미생물의 기저 존재를 나타냈습니다. 존재하는 주요 속(각 OTU(Operational Taxonomic Unit)의 판독 횟수에 의해 결정됨)은 8일, 15일 및 22일에 안정적이었으며 Geobacillus로 확인되었습니다. 23일째에 BLM-1 접종물을 접종한 후, 지오바실러스 는 더 이상 우세하지 않았고, 새로운 주요 속이 다수의 미량으로 존재하는 속과 함께 발생했으며, 대부분의 경우 연구가 끝날 때까지 존재를 유지했습니다(그림 4). 이를 통해 BLM-1 접종물이 생물반응기 내에서 활발하고 역동적으로 변화하는 배양물이라는 결론을 내렸습니다.
NGS 데이터에 대한 추가 연구는 "미생물 암흑 물질"의 구성원을 밝혀냈다. "unclassified" 또는 "uncultured"라는 단어를 포함하는 분류학적 이름이 할당된 OTU는 "미생물 암흑 물질"의 구성원을 포함하는 OTU의 대용물로 사용되었습니다. NGS 데이터는 44일째(시추공 BLM-1의 미생물 접종 후 마지막 날)에 수집되었으며, 접종 전 데이터(1일, 8일, 15일 또는 22일)에 판독된 OTU가 접종물에 있을 가능성이 높지 않기 때문에 OTU를 포함하지 않도록 필터링했습니다. 필터링된 44일차 NGS 데이터에는 1,844개의 OTU와 3,396개의 판독이 포함되었습니다. 이 중 366개의 OTU(20%) 및 925개의 판독(27%)은 문 수준에서 분류되지 않았으며, 1252개의 OTU(68%) 및 2357개의 판독(69%)은 속 수준에서 분류되지 않았거나 배양되지 않았습니다. 비록 단기적이기는 하지만, 이 파일럿 연구는 "미생물 암흑 물질"의 구성원을 배양하기 위해 환경적으로 정보에 입각한 배지를 사용하는 생물반응기의 잠재력을 지원합니다.
그림 1: 혐기성 배양에 사용되는 맞춤형 설계 붕규산 바이오리액터의 개략도. (A) 한쪽에서 본 바이오리액터 모습. (B) A 를 z축을 중심으로 90°(시계 방향) 회전하면 뷰가 제공됩니다. (C) 생물반응기의 평면도. 재킷 설계로 물이나 기름으로 온도를 제어할 수 있습니다. 두 개의 재킷 포트는 B의 뷰 오른쪽에서 볼 수 있습니다. 내부 챔버는 모든 유형의 퇴적물로 채우거나 플랑크톤 배양을 위해 퇴적물을 비울 수 있습니다. 3개의 샘플링 포트( A의 뷰 오른쪽에 표시)를 통해 바이오리액터 컬럼의 다양한 깊이에서 물질을 제거할 수 있습니다. 표준 45, 18 및 14 GL 개구부는 1-6개월 동안 기밀 밀봉을 유지하는 테프론 또는 부틸 격막을 사용하여 밀봉할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 활성 바이오리액터 어셈블리. 사진 왼쪽에서 오른쪽으로 제시된 유리 제품은 (A) 8L 카보이, (B) 바이오리액터( 그림 1 참조) 및 (C) 비샘플링 캐치 병입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 바이오리액터 연구의 직접 세포 수. 생물반응기 내의 미생물 집단은 0.02mm Petroff-Hauser 혈구계 세포 계수 챔버를 사용하여 모니터링되었습니다. 접종은 23일 초에 추가되었습니다. 1일, 8일, 22일의 세포 수가 검출 한계 미만이었습니다. 직접 세포 계수의 유효 검출 한계는 1 × 106 cells/mL입니다. 약어: b.d.l. = 검출 한계 미만. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 바이오리액터 차세대 염기서열분석. OTU는 생물반응기 연구의 각 시점에서 고유한 OTU에 속하는 판독 비율을 나타내는 누적 막대 그래프로 표시됩니다. 고유한 OTU는 속 컷오프에서 관련 분류에 할당되었습니다. '기타' 속은 각 시점에서 읽기의 10% 미만인 모든 속으로 정의됩니다. 대표되는 DNA의 총 판독 수는 506,358개입니다. 각 시점의 읽기 횟수는 그래프 상단에 나열됩니다. 접종은 23일 초에 추가되었습니다. 약어: OTU = Operational Taxonomic Unit. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 화합물 | 토양 혼합 배양을 위한 금액 | 시추공 혼합 배양을 위한 금액 | 시추공 분리 메탄겐 금액 |
| 증류수 | 1000.0 mL | 1000.0 mL | 1000.0 mL |
| 헤페스 | 3.600 지 | - | - |
| 걸레 | - | - | 2.000 지 |
| MgCl2 ∙6 H2O | 0.400 지 | 0.400 지 | 0.400 지 |
| 케이클 | 0.500 지 | 0.250 지 | 0.500 지 |
| NH4Cl | 0.268 지 | 0.268 지 | 0.268 지 |
| Na2그래서4 | - | 0.284 지 | 1.500 지 |
| Na2HPO4 ∙2 H2O | - | - | 0.356 지 |
| pH 6에서 1 M KH2PO4 | 1.0 mL | 1.0 mL | - |
| pH 9.4에서 1 MH3BO3 | 1.0 mL | 1.0 mL | 1.0 mL |
| 미량 미네랄 | 1.0 mL | - | 1.0 mL |
| 비타민 | - | - | 1.0 mL |
| 1mg/mL 나트륨 레자주린 | 0.4 mL | 0.3 mL | 0.4 mL |
| pH 조정 | - | 7.0 | 7.0 |
| pH 조절에 의한 | - | 나오(NaOH) | 코 |
| 배양 온도 | 25 캜 | 60 캜 | 47 캜 |
표 1: 미디어 구성. 각 매체에 대한 화합물 및 물리적 매개 변수 목록. 제시된 미디어는 순진합니다. 탄소 및 에너지원은 독자의 미생물 및 관심 환경에 특정할 수 있고 알려야 하므로 포함되지 않습니다. 가능한 탄소 및 에너지원 추가에 대한 아이디어는 토론 섹션을 참조하십시오.
보충 파일 1: 가스 매니폴드 설정. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜의 중간 생산 섹션(섹션 1)은 출판 이후 널리 사용되어 온 Miller and Wolin17의 수정된 Hungate 기법에 그 구조를 빚지고 있습니다. 이 확장된 프로토콜의 실용성은 서술적 특성과 미생물의 현장 획득과의 결합에서 비롯됩니다. 환경에 대한 정보를 제공하고 시뮬레이션된 배지를 포함하는 배양병은 혐기성 지하 박테리아 Thermoanaerosceptrum fracticalcis 균주 DRI1318, Caldiatribacterium inferamans 균주 SIUC1(등록 번호 MT023787; 준비 중인 원고) 및 Anaerothermus hephaesti를 현장에서 획득한 이전 구성원을 성공적으로 배양하는 데 사용되었습니다 균주 SIUC3 (등록 번호 MK618647; 준비 중인 원고) 및 혐기성 지하 박테리아 특성화되지 않은 균주 DRI14 (등록 번호 KR708540).
이 프로토콜의 한 가지 초점은 표면 및 지하 혐기성 환경과 미생물에 매우 잘 적응하도록 만들어졌다는 것입니다. 첫째, 배지 조성은 관심 환경의 조성을 반영하도록 변경되도록 권장됩니다. 예를 들어, Na+ 및 Cl-에 대해 이온 농도가 3,000mg/L인 환경을 시뮬레이션할 때 레시피에 3,000mg/L의 NaCl을 추가할 수 있습니다. 또는 650mL의 모래와 650mL의 셰일을 바이오리액터에 배치하여 사암과 셰일의 부피 비율이 1:1인 환경을 시뮬레이션할 수 있습니다. 둘째, 배지 조성물은 관심의 특정 미생물의 성장을 촉진하도록 변형될 수 있다. 특히, 이 논문의 세 가지 매체와 같은 순진한 매체는 그러한 수정을 준비하고 이에 의존한다. 탄소 및 에너지원의 예로는 푸마르산염(18), 펩톤(18), 셀룰로오스-함유 유기물(19), 아세테이트(20), 효모 추출물(19,20), 자일리톨(균주 SIUC1), 포름산염(균주 SIUC3), 및H2/CO2, 시트레이트, 및 글루코스와 같은 다른 잠재적 공급원이 있다. 마지막으로, 배지 조성은 원하는 연구에 따라 변경될 수 있습니다. 예를 들어, 대표 결과 섹션에 설명 된 연구의 주요 관심사는 대표적인 지하 혐기성 미생물이 독특한 혼합 유기 슬러리 (OHD13,14에 의해 처리 된 옥수수 속대 슬러리)에 어떻게 반응하는지 발견하는 것이 었습니다. 따라서 그 레시피에는 기존의 옵션 대신 이 탄소원이 포함되어 있었습니다. 특정 연구에 대한 다른 잠재적 수정 사항에는 플라스틱, 산 및 중금속 또는 생물 정화 연구를 위한 기타 생체 이물의 추가가 포함됩니다. 부가가치 해중합 제품 연구를 위한 셀룰로오스 및 플라스틱과 같은 난치성 탄소 폴리머의 추가; 그리고 소규모 퇴비 및 기타 농업 연구를 위한 분뇨 및 식물 폐기물 추가.
pH, 산화 환원 전위(ORP) 및 용존 산소(DO) 측정과 같이 매질의 환원제 후 분석이 필요한 경우, 해당 배치의 특성을 자신 있게 이해하기 위해 대표적인 수의 배지 병을 희생하여 간접적으로 수행할 수 있습니다. 밀봉된 중간 크기의 병을 공기에 노출시킨 후에는 개봉 후 1분 이내에 ORP 및 DO 판독값을 측정하는 것이 좋습니다. 산소에 의존하지 않는 측정(예: pH)은 초기 개봉 후 긴급하지 않게 수행할 수 있습니다. 까다로운 혐기성 미생물은 일반적으로 성장을 위해 -200mV< ORP 값이 필요합니다. 배지가 >-200mV의 ORP 값 및/또는 DO 값>0.40mg/L인 경우, 추가 Na2S(0.1-0.2g/L) 또는 다른 환원제(예: 구연산 티타늄, L-시스테인, 아스코르브산)를 사용하여 배지를 더 환원할 수 있습니다.
Resazurin은 종종 산소 지시약으로 사용됩니다 (이 프로토콜에서와 같이). 그러나, 보다 정확하게는 산화 환원 지시약(21)으로서, 산소가 용액의 산화 환원 전위를 변화시킴에 따라 간접적으로 산소의 존재를 나타낸다. 용액의 레사주린은 처음에 파란색으로 나타납니다. 환원제에 노출되면 용액은 돌이킬 수 없을 정도로 분홍색으로 변합니다. 용액이 더 환원되면 가역적으로 무색으로 변하고 산화되면 분홍색으로 돌아갑니다. 저자들은 레자주린을 함유한 환원 배지가 파란색에서 분홍색으로 바뀌었지만 무색으로 바뀌지 않은 경우를 관찰했습니다. 그러나 저자는 또한 이러한 배지가 고압 멸균 후 무색으로 이동하는 경우가 많으며 배지를 끓이고 세척하는 데 소요되는 시간이 증가하면 일반적으로 환원제를 첨가한 후 레사주린이 무색 형태로 이동할 수 있음을 관찰했습니다. 원하는 경우 용존 산소 프로브로 매체의 산소 농도를 확인할 수 있습니다.
이러한 바이오리액터와 맞춤형 유리 바이오리액터 자체를 실행하는 데 필요한 모든 재료는 ~$5K를 초과하지 않았습니다(이는 수조, 펌프 및 인큐베이터와 같은 지원 장비를 이미 사용할 수 있다고 가정함). 이러한 혐기성 배양 기술은 >$10K부터 시작할 수 있는 상업용 자동 생물 반응기에 비해 경제적입니다. 또한 많은 상업용 바이오리액터가 일회용 반응기 용기로 전환하고 있으며, 이는 비교의 역학을 변화시키고 소규모 연구 실험실/대학이 지속적으로 교체하는 데 비용 효율적이지 않습니다. 또한 상용 시스템에는 까다로운 미생물 성장의 성공에 영향을 미치는 제조상의 화학적 편향(사용된 플라스틱, 개스킷/피팅의 그리스 또는 화학적으로 처리된 물)이 있을 수 있습니다. 혐기성 환경 시료를 수집할 수 있는 저렴한 비용, 맞춤화 가능성 및 다양성은 접종을 할 수 있는 정보에 입각한 배지와 결합하여 연구를 위한 농축을 생성하여 고유한 미생물을 얻을 가능성을 크게 향상시킵니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 수년에 걸쳐 이러한 기술에 영향을 미치거나 발전시킨 정보와 멘토링의 계보를 인정하고 싶습니다. 전직 대학원생, 박사 후 연구원 및 현재 교수인 Hamilton-Brehm 박사는 시간을 내어 혐기성 기술을 가르친 Mike Adams 박사, Gerti Schut 박사, Jim Elkins 박사, Mircea Podar 박사, Duane Moser 박사 및 Brian Hedlund 박사에게 감사의 빚을 지고 있습니다. 국제자연보호협회(Nature Conservancy)와 아메리칸 리버스(American Rivers)는 각각 G21-026-CON-P 보조금과 AR-CE21GOS373 보조금을 통해 이 작업을 지원했습니다. 이 논문에 표현된 모든 의견, 결과, 결론 또는 권장 사항은 저자의 것이며 반드시 Nature Conservancy 또는 American Rivers의 견해를 반영하는 것은 아닙니다. 이 연구는 SIU Advanced Energy Institute의 보조금으로 지원되었으며, SIU Advanced Energy Institute는 Advanced Energy Resource Board를 통해 수여된 자금 지원에 감사를 표합니다. NGS는 LC Sciences에서 수행했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Materials | |||
| 1 L borosillicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 1 mL syringe with slip tip | Fisher Scientific | ||
| 10 mL glass pipette | Fisher Scientific | ||
| 100 mL culture bottle | Fisher Scientifc | ||
| 20 mm hand crimper | Fisher Scientifc | ||
| 23 G needle | Fisher Scientifc | ||
| 500 mL borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| Aluminum seal | Fisher Scientifc | ||
| Cannula, 31.5 cm length | Fisher Scientific | ||
| Cannula, 6 cm length | Fisher Scientifc | ||
| Corer | Giddings Machine Company | Assembled from company parts | |
| Gas manifold | Swagelok | Assembled from many different parts | |
| Lighter | Lowe's | ||
| N2 gas | Airgas | ||
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | ||
| Rubber stopper (for GL45 bottles) | Glasgeratebau OCHS | ||
| Rubber stopper (for culture bottles) | Ace Glass | ||
| Stirring hot plate | Corning | ||
| Trace minerals | ATCC | ||
| Vitamins | ATCC | ||
| Bioreactor-specific Materials | |||
| #10 rubber stopper | Ace Glass | ||
| #7 rubber stopper | Fisher Scientifc | ||
| 1 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 1/4" hose barb ball valve | Amazon | ||
| 10 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 3.5 L borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 5/16" - 1/4" hose barb adapter fitting | Amazon | ||
| 60 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 8 L borosillicate carboy | Allen Glass | ||
| Angled hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-20 | |
| Balloon | Party City | ||
| Borosillicate bioreactor | Allen Scientific Glass | Custom made upon request | |
| Drill | Lowe's | ||
| Female luer lock adapter coupler | Amazon | ||
| GL14 open top cap | Ace Glass | 7621-04 | |
| GL18 open top cap | Ace Glass | 7621-08 | |
| GL45 open top cap | Ace Glass | ||
| PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap | Ace Glass | 7625-06 | |
| PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap | Ace Glass | 7625-07 | |
| Ring stand | Fisher Scientific | ||
| Ring stand chain clamp | Amazon | ||
| Ring stand clamp | Fisher Scientific | ||
| Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od | Grainger | 55YG13 | |
| Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od | Grainger | ||
| Straight hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-22 | |
| Three-way stopcock | Amazon | ||
| Two-way stopcock | Amazon | ||
| Ultra low flow variable flow mini-pump | VWR | ||
| Water bath | Fisher Scientifc | ||
| White rubber septum for 13-18 mm od tubes | Ace Glass | 9096-49 | |
| Wire | Lowe's | ||
| Zip tie | Lowe's |
References
- Staley, J. T., Konopka, A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).
- Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes. MSystems. 3 (5), e00055 (2018).
- Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
- Marcy, Y., et al. Dissecting biological "dark matter" with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).
- Giovannoni, S., Stingl, U. The importance of culturing bacterioplankton in the'omics' age. Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).
- Stewart, E. J.
- Dedysh, S. N. Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps. Front. Microbiol. 2, 184 (2011).
- Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. Isolating" uncultivable" microorganisms in pure culture in a simulated natural environment. Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).
- Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012 (2011).
- Tyson, G. W., et al. Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community. Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).
- Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).
- Merino, N., et al. Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow. Sci. Total Environ. 842, 156768 (2022).
- Anderson, K. B., Creeping, J. C., Huggett, W. W. Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791. , Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf (2013).
- Anderson, K. B., Crelling, J. C., Huggett, W. W., Perry, D. M. Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512. , Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf (2018).
- Mullin, S. W., et al. Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer. Front. Microbiol. 11, 536535 (2020).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Miller, T. L., Wolin, M. A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes. Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin. Front. Microbiol. 10, 2224 (2019).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).
- Twigg, R. S.
