Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

קבוצה של פורמטים מדומים מדומים באתרם לטיפוח מיקרואורגניזמים אנאירוביים שנרכשו בסביבה

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/66228
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 3, 1, 4, 1
1Department of Microbiology, Southern Illinois University Carbondale, 2MEDPREP, Southern Illinois University School of Medicine, 3Department of Geology, Southern Illinois University Carbondale, 4Department of Zoology, Southern Illinois University Carbondale

Summary

המוקד של מאמר זה הוא לפרט שיטות עבודה מומלצות להכנת מדיה עבור מיקרואורגניזמים אנאירוביים מהירים שנרכשו מסביבה. שיטות אלה מסייעות בניהול תרביות אנאירוביות וניתן ליישם אותן כדי לתמוך בצמיחה של מיקרואורגניזמים חמקמקים ולא מתורבתים, "החומר האפל המיקרוביאלי".

Abstract

מחקר תלוי תרבות של מיקרואורגניזמים אנאירוביים נשען על יכולת מתודולוגית. שיטות אלה חייבות ליצור ולתחזק תנאי גידול מתאימים (למשל, pH ומקורות פחמן) עבור מיקרואורגניזמים אנאירוביים, תוך מתן אפשרות להפקת דגימות מבלי לפגוע בסביבה המלאכותית. לשם כך, שיטות המבוססות על סביבה באתרה ומדמות אותה יכולות לסייע רבות בגידול מיקרואורגניזמים מסביבה זו. כאן, אנו מתארים שיטה אנאירובית מושכלת ומדומה באתרה לגידול מיקרואורגניזמים יבשתיים ותת-קרקעיים, תוך שימת דגש על איסוף דגימות אנאירוביות עם הפרעה מינימלית. פרוטוקול זה מפרט את הייצור של תווך נוזלי אנאירובי הניתן להתאמה אישית, ואת הרכישה הסביבתית והצמיחה במבחנה של מיקרואורגניזמים אנאירוביים. הפרוטוקול מכסה גם רכיבים קריטיים של ביוריאקטור אנאירובי המשמש להדמיות סביבתיות של משקעים ומדיה נוזלית אנאירובית עבור תרבויות שנרכשו סביבתיים. כללנו נתוני ריצוף ראשוניים מהדור הבא ממיקרוביום מתוחזק לאורך תוחלת החיים של ביוריאקטור, שבו התרבית הפעילה התאימה את עצמה באופן דינמי בתגובה למקור פחמן ניסיוני.

Introduction

רוב המיקרואורגניזמים נותרים בלתי מתורבתים; זה נתמך על ידי הפער הגדול בין התאים שנצפו באמצעות מיקרוסקופיה, בניגוד למיקרואורגניזמים המעטים שגודלו בהצלחה באמצעות לוחות אגר. סטיילי וקונופקה כינו פער זה "אנומליה של ספירת הלוחות הגדולה"1. המגוון המשוער שאינו מוסבר נתמך על ידי נתונים מטאגנומיים ומטה-טרנסקריפטומיים המראים סוגים חדשים רבים המופצים בעקומות שפע דרגות מסביבות שונות2. מיקרואורגניזמים שנצפו (בדרך כלל על ידי ריצוף אקראי של רובה ציד של קהילה מיקרוביאלית) אך לא תורבתו כונו "חומר אפל מיקרוביאלי"3,4.

בעידן האומיקס, גידול מיקרואורגניזמים נותר הכרחי כדי להעריך באופן מלא נתונים גנומיים ולאמת את הפונקציה/פנוטיפ של הגנים הנוכחיים. ריצוף מיקרואורגניזמים בתרבית הוא עדיין הדרך היחידה להשיג בביטחון גנומים שלמים עד שטכנולוגיות כגון מטגנומיקה של רובה ציד וגנומים שהורכבו מטא-גנום מהסביבה יהפכו לבלתי קבילותלטעות 5. הערכות גנומיות יחד עם מיקרואורגניזמים בתרבית מספקות מסקנות חזקות להבנת "חומר אפל מיקרוביאלי". חברים רבים ב"חומר האפל המיקרוביאלי" מבצעים תפקידים חיוניים המשפיעים על מחזור חומרי מזון ואלמנטים אחרים ועל ייצור מוצרים טבעיים יקרי ערך, תומכים במערכות אקולוגיות ומבצעים שירותים אקולוגיים. מבחינה רפואית, כמחצית מכלל התרופות המשווקות כיום הן מוצרים ונגזרות של מוצרים מחיידקים, ופרופיל זנים לא מתורבתים חשוד כחושף את האנטיביוטיקות של העתיד. כדי לקבל גישה לרוב חסר תרבות זה, יש להגדיל מגוון של מתודולוגיות טיפוח6. בקרב חברי "החומר האפל המיקרוביאלי", מיקרואורגניזמים אוליגוטרופיים אנאירוביים אינם מדווחים במידה רבה, וסביר להניח שהם מחזיקים במסלולים ביוכימיים בעלי ערך אקולוגי ותעשייתי7, מה שהופך אותם למטרות חשובות של תרבית. עם זאת, מיקרואורגניזמים אוליגוטרופיים אנאירוביים קשים יותר לתרבית מאשר עמיתיהם האירוביים והקופיוטרופיים בשל זמני דגירה ארוכים יותר הנדרשים לעתים קרובות, תנאים קפדניים (למשל, טמפרטורות מבחנה לא סטנדרטיות מסוימות), ושימוש במתכוני מדיה מיוחדים.

הטכניקות המתפתחות כיום לתרבית חברי "החומר האפל המיקרוביאלי", כולל מיקרואורגניזמים אוליגוטרופיים אנאירוביים חדשניים, שיפרו מאוד את הבנתנו והגדילו את הייצוג של מיקרואורגניזמים אלה בתוך העץ הפילוגנטי. ניתן להפריד את הטכניקות הנוכחיות המשתמשות במדיה מושכלת לטיפוח מיקרואורגניזמים חדשים (כלומר, מדיה הנגזרת באמצעות ידע על המיקרואורגניזמים/ים המעניינים) לשלוש שיטות נפרדות. הראשונה מבין השיטות כרוכה בהסרה ישירה של חלק נפרד מהסביבה לצורך העברה לתא גדילה במבחנה שכבר מכיל את המיקרואורגניזמים המעניינים בתוך הממברנה. החלק הבדיד (למשל, מי ים) פועל כדי לספק למיקרואורגניזמים המעניינים את בית הגידול הגיאוכימי שבו הם משתמשים באתרם, בעוד שהממברנה עוצרת את תנועת התאים על פני (תאים בעלי עניין יישארו בפנים; תאים חיצוניים שהגיעו עם החלק הבדיד יישארו בלי). על ידי הכללת תרכובות הזמינות באופן טבעי למיקרואורגניזמים בסביבתם הטבעית, מיקרואורגניזמים כאלה יכולים להיות מתורבתים8. השיטה השנייה משתמשת במטא-טרנסקריפטומיקה או גנומיקה כדי להבהיר יכולות מטבוליות, ומספקת רמזים לפרמטרים צרים של תרבית לתכנון מדיום ממוקד. גישה זו מספקת פרופיל אקו-פיזיולוגי שניתן להשתמש בו כדי להתמקד בהעשרה של סוגים ספציפיים של מיקרואורגניזמים מחוץ לסביבה. הוראות המדיום מותאמות לגנים המזוהים הנוכחיים הנחזים לתמוך במיקרואורגניזמים הממוקדים כדי להפחית את מגוון ההעשרה,9,10. אזהרה אחת היא שמידע גנומי אינו מסיק ישירות את ביטוי הגנים, בעוד שמידע שעתוק כן.

השיטה השלישית כוללת מדיה מודעת סביבתית ומדומה, להבדיל מהשיטה הראשונה, שאינה מדמה את המדיה אלא משתמשת בסביבה ישירות כמקור לתקשורת. שיטה שלישית זו דורשת סיור סביבתי של הגיאוכימיה של אתר שדה המכיל מיקרואורגניזמים בעלי עניין. בעזרת ידע זה, רכיבים ראשוניים ופרמטרים פיזיים מזוהים כדי לייצר מדיום מדומה מודע לסביבה. לאחר מכן התווך מקבל עירוי ישיר של משקעים או נוזלים המכילים מיקרואורגניזמים מהסביבה לתוך המדיום. שיטה זו היא בעלת ערך מיוחד במקרים בהם למיקרוביולוג המטפח אין גישה לכמויות מספיקות של סביבת מקור (לפי הצורך בשיטה הראשונה) וגם לא לנתונים מטא-תעתוקים או גנומיים מתאימים (לפי הצורך בשיטה השנייה).

הפרוטוקול הבא הוא דוגמה לשיטה השלישית; הוא מושכל על ידי ומטרתו לדמות סביבות עניין. שלושה מתכוני מדיה נאיביים המכוונים לתרביות מיקרואורגניזמים אנאירוביות שונות שנרכשו בתחום מוצגים במקביל בתוך הפרוטוקול. שלוש התרבויות המיוצגות הן תרבויות מעורבות שמקורן באדמה (להלן: תרבית מעורבת קרקע), תרבויות מעורבות שמקורן מתוך קידוח (להלן: תרבית מעורבת בקידוח), ומתאנוגן מבודד שמקורו בתוך קידוח (להלן: מתאנוגן מבודד מקידוח). הזהויות והכמויות המורכבות במתכוני המדיה המשותפים כאן נועדו לשמש מדריך מתחיל; הם מסוגלים ומעודדים להיות מותאמים אישית לסביבה של הקורא ומיקרואורגניזמים של עניין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור מדיום נוזלי אנאירובי הניתן להתאמה אישית

  1. בינוני לבקבוקי תרבית (ייצור של 500 מ"ל)
    1. למדוד ולהוסיף תרכובות לבקבוק 1 ליטר ולהתאים את ה- pH באמצעות העמודה בטבלה 1 המתאימה לתרבות העניין של הקורא (הכמויות בטבלה 1 נרשמות לייצור של 1,000 מ"ל, התאם בהתאם). מערבבים תרכובות להומוגניות על ידי ערבול הבקבוק.
    2. מחממים את הנוזל לרתיחה על ידי גלישה במיקרו של הבקבוק במשך 5-6 דקות. פתחו את המיקרוגל לעתים קרובות וערבלו את הנוזל בעדינות באמצעות כפפה עמידה בחום. פתח את המיקרוגל במהירות אם הנוזל הולך עדיין לאחר מבעבע; אחרת, הנוזל עלול להתרחב במהירות ולהציף את הבקבוק.
    3. חבר פיפטת זכוכית סטרילית של 10 מ"ל למערך סעפת גז N2 (מבוסס על העיצוב של Balch et al.11, אם כי לא דורש עמוד נחושת מחומם עבור גז N2 של טוהר; ראה קובץ משלים 1 למידע נוסף על סעפת גז). פתח את הסעפת כדי לאוורר את O2 ואפשר לגז N2 לזרום החוצה.
    4. מניחים את קצה הפיפטה לתוך הנוזל ולהתאים את זרימת הגז כך בועות נמרצות למדי. שטפו את הנוזל עם N2 עד שהבקבוק כבר לא חם מדי למגע.
      הערה: הדבר תלוי בתוכן המדיה אך בדרך כלל נמשך ~20 דקות.
    5. בזמן ההמתנה שהבקבוק יתקרר, הניחו 10 בקבוקי תרבית סטריליים של 100 מ"ל; או אם מכינים מדיה לאיסוף תרבית מעורבת באדמה, הניחו שני בקבוקים סטריליים של 500 מ"ל.
    6. ברגע שבקבוק המדיה קריר למגע, משכו את קצה הפיפטה כלפי מעלה לתוך חלל הראש של הבקבוק. הוסף 0.125 גרם של NaHCO3 ו 0.300 גרם של Na2S∙9 H2O והמתן עד resazurin הופך חסר צבע.
      זהירות: Na2S∙9 H2O הוא חומר מאכל, רעיל ומגרה. יש להשתמש בציוד מגן אישי בעת הטיפול ולשטוף היטב כלי מתכת לאחר מגע.
    7. בזמן ההמתנה לרזורין שישנה את צבעו, חברו צינוריות מתכת למערך סעפת הגז והכניסו את קצות הצינוריות לבקבוקי תרבית. התאימו את זרימת N2 לבקבוקים לקצב מתון, כך שהנוזל שנוסף בשלב הבא לא יישפך בגלל זרימת הגז.
    8. ברגע resazurin הוא חסר צבע, aliquot 50 מ"ל של נוזל לתוך כל בקבוק תרבית או 250 מ"ל של נוזל לתוך כל בקבוק 500 מ"ל.
    9. מכסים כל בקבוק בפקק גומי בגודל תואם מיד לאחר הסרת הצינוריות. הדקו את הפקק באמצעות אטם אלומיניום (לבקבוקי תרבית) או פקק בורג פתוח GL45 (לבקבוקי 500 מ"ל).
    10. הניחו את הבקבוקים בפח הניתן להרכבה ומלאו את הפח במי ברז עד שמפלס המים יהיה זהה לזה שבבקבוקים.
      הערה: פעולה זו תבטיח שהבקבוקים לא ייקרעו עקב לחץ הנגרם על ידי הפרשי טמפרטורה על הזכוכית בזמן אוטוקלאבינג.
    11. הבקבוקים בטמפרטורה של 121°C למשך 30 דקות.
  2. בינוני לביוריאקטור (ייצור של 8 ליטר)
    1. הכנת קארבוי
      1. פתח את השסתום של שסתום כדורי צינור בגודל 1/4 אינץ' (6.4 מ"מ). חבר שני צינורות סיליקון בקוטר 6 ס"מ בקוטר פנימי (ID) בקוטר 1/4 אינץ' (ID) ובקוטר חיצוני (OD) בקוטר 1/2 אינץ' (12.7 מ"מ) לשני קצות שסתום כדור הצינור.
      2. חבר לקצה אחד של המכלול מתאם מוט צינור בגודל 5/16 אינץ' -1/4 אינץ' (7.9 מ"מ-6.4 מ"מ). חבר את הקצה השני של המכלול למוט הצינור של קארבוי 8 ליטר.
      3. השתמש באזיקון רוכסן כדי לאבטח את החיבור בין מוט הצינור של הקרבוי לבין הצינור, ואת החיבור בין מתאם מוט הצינור לבין הצינור.
      4. Autoclave carboy עם הרכבה ב 121 ° C במשך 30 דקות.
    2. ייצור בינוני
      1. סגור את השסתום של שסתום כדור הצינור במכלול 8 ליטר carboy.
      2. למדוד ולהוסיף תרכובות לקארבוי 8 ליטר ולהתאים את ה- pH באמצעות העמודה בטבלה 1 המתאימה לתרבות העניין של הקורא (הכמויות בטבלה 1 נרשמות לייצור של 1,000 מ"ל, התאם בהתאם). הוסיפו ערבוב והשתמשו בצלחת ערבוב כדי לערבב את התרכובות להומוגניות.
      3. מחממים את הנוזל לרתיחה בעזרת הפלטה החמה הבוחשת. מניחים לנוזל לרתיחה למשך 30 דקות.
        הערה: חימום הנוזל לרתיחה תלוי בתכולת המדיה אך יכול להימשך 2-3 שעות.
      4. חבר פיפטת זכוכית סטרילית של 10 מ"ל למערך סעפת גז N2 (מבוסס על העיצוב של Balch et al.11, אם כי לא דורש עמוד נחושת מחומם עבור גז N2 של טוהר; ראה קובץ משלים 1 למידע נוסף על סעפת גז). פתח את הסעפת כדי לאוורר את O2 ואפשר לגז N2 לזרום החוצה.
      5. מכבים את החום, ואז מניחים את קצה הפיפטה לתוך הנוזל, ומתאימים את זרימת הגז כך שהבועות יהיו נמרצות במידה בינונית אך לא יעלו על גדותיהן. שטפו את הנוזל עם N2 למשך 30 דקות.
      6. משכו את קצה הפיפט כלפי מעלה אל חלל הראש של הקארבוי. הוסף 2.0 גרם של NaHCO3 ו 4.8 גרם של Na2S∙9 H2O, והמתן עד resazurin הופך חסר צבע.
        זהירות: Na2S∙9 H2O הוא חומר מאכל, רעיל ומגרה. יש להשתמש בציוד מגן אישי בעת הטיפול ולשטוף היטב כלי מתכת לאחר מגע.
      7. ברגע resazurin הוא חסר צבע, להסיר פיפטה זכוכית מיד מכסה את carboy עם פקק #10. סובב חוט מעל הפקק וסביב שפת הפקק כדי לאבטח את הפקק.

2. רכישה באתרו של מיקרואורגניזמים אנאירוביים סביבתיים

  1. רכישת דגימה אנאירובית משטח (תרבית מעורבת קרקע)
    1. הביאו את הבקבוק/ים של מצע תרבית אדמה מעורבת שנעשה כנ"ל וקורר לשטח.
      הערה: סיבית אדמה סטנדרטית של Giddings 2 5/8" משמשת את המחברים (Table of Materials). עם זאת, ניתן להשתמש בכל קורר אדמה או מגבת שניתן לדגום לעומק הרצוי.
    2. דחפו (כונן ערימה/יתד) את הקורר לתוך המשקע עד שהחלק העליון של גליל איסוף הדגימות יהיה סמוק עם פני השטח של המשקע.
    3. סובבו את הליבה ב-90° כדי לשחרר את הליבה ומשכו כלפי מעלה עד למיצוי הדגימה מהסביבה.
    4. במשקעים רופפים (כמו אלה שעלולים להיתקל בהם בעת דגימת ביצות), כסו את בסיס הליבה ביד חדשה עטופה בכפפת ניטריל בזמן השאיבה כדי למנוע מהדגימה לנשור או להתפשט למים בעת השאיבה.
    5. מקורב במהירות על ידי העין 6-7 ס"מ למעלה מבסיס הליבה. השתמשו ביד חדשה עטופה בכפפות ניטריל כדי לחתוך לתוך הליבה ולהפריד את החלק התחתון 6-7 ס"מ.
    6. מעבירים מיד את תחתית הליבה לבקבוק התרבית. אם האדמה/משקעים גדולים מדי, צרו אותם במהירות כך שיכנסו לבקבוק ביתר קלות, תוך צמצום החשיפה לאטמוספירה האירובית ככל האפשר.
    7. לאחר העברת הדגימה, מקם מיד מחדש את הפקק והחזק אותו במקומו עם מכסה בורג.
    8. שמרו על קרירות הדגימה. יש לשמור בקירור את בקבוק האיסוף בטמפרטורה של 4°C עם חזרתו למעבדה.
  2. רכישת דגימה אנאירובית מתחת לפני השטח (תרבית מעורבת בקידוח)
    1. הניחו בקבוק סטרילי של 1 ליטר ליד סעפת הגז. מכסים את הבקבוק עם פקק גומי. טפטפו 100% אתנול על הפקק והציתו אותו באמצעות מצית.
    2. חבר מחט סטרילית של 23 G למערך סעפת הגז N2 . פתח את הסעפת כדי לאוורר את O2 ואפשר לגז N2 (או Ar) לזרום החוצה בקצב מתון.
    3. ברגע שהפקק כבר לא בוער, הכנס את המחט לתוך הבקבוק. הכנס מחט סטרילית שנייה של 23 גרם שאינה מחוברת לסעפת הגז לתוך הבקבוק. שוטפים את הבקבוק למשך 1-2 דקות.
    4. חלצו את המחט שאינה מחוברת לסעפת הגז. יש ללחוץ על הבקבוק למשך דקה. חלצו את המחט הנותרת.
    5. הביאו את הבקבוק בלחץ ומחט 23 גרם מעוקרת לאתר הקידוח. לשאוב נוזל מהקידוח בעקבות השיטות של Merino et al.12.
      הערה: בהתאם לשיטה, לחיבור ולקצב הזרימה של הקידוח, הדבר משנה את האסטרטגיה של רכישת דגימת מים. אם יש זרימה רציפה של מים, איסוף מים כמתואר בשלב 2.2.6. יספיק. אם זרימת המים נאספת באצווה או זרימה נמוכה, ניתן להשתמש בשיטת כניסה/יציאה חלופית. בכל המצבים, מזערו את הזיהום, ונסו לוודא שהדגימה שנאספה מייצגת את הסביבה הרצויה לדגימה. זוהי אמירה כללית באופן רחב מכיוון שהניסיון של המחברים היה שכל אירוע איסוף דגימות מאתרים ממשלתיים או פרטיים היה צריך להיות מותאם מאוד לנגישות הזמינה.
    6. פתחו את הבקבוק במהירות, שאבו פנימה נוזלים כדי למלא את הבקבוק במלואו וסגרו את הבקבוק.
    7. הכנס את מחט 23 G שהובאה למקום לתוך פקק הגומי של הבקבוק כדי להקל על הלחץ בבקבוק. חלצו את המחט.
    8. שמרו על קרירות הדגימה. יש לשמור בקירור את בקבוק האיסוף בטמפרטורה של 4°C עם חזרתו למעבדה.

3. גידול חוץ גופי של מיקרואורגניזמים אנאירוביים שנרכשו בשטח

  1. גידול לפי בקבוק תרבית
    1. הוציאו בקבוק סטרילי פקק של N2 ואת בקבוקי התרבית ובקבוק האיסוף שהוכנו כנ"ל. טפטפו 100% אתנול על הפקקים והציתו אותם באמצעות מצית.
    2. להרכיב מחט 23 גרם על מזרק 1 מ"ל. ברגע שהפקקים כבר לא בוערים, הכנס את המחט לבקבוק N2 וצייר ~ 1 מ"ל של N2. חלצו את המחט.
    3. לחץ באיטיות על הבוכנה כדי לשחרר את N2. ברגע שהמזרק ריק, הכנס את המחט לבקבוק האיסוף וצייר 0.5 מ"ל של הדגימה הסביבתית. חלצו את המחט.
    4. הכניסו את המחט לבקבוק התרבית והזריקו את הדגימה. חלצו את המחט.
    5. מערבלים את הבקבוק ומניחים אותו באינקובטור בטמפרטורה, כפי שעולה מטבלה 1 או מסביבת העניין של הקורא.
      הערה: התקדמות התרבית (בקבוק או ביוריאקטור) מנוטרת באמצעות המוציטומטר פטרוף-האוזר בעומק 0.02 מ"מ. העשרה של מיקרואורגניזמים אנאירוביים או מהירים בדרך כלל אינה מגיעה לצפיפויות תאים שבהן OD600 שמיש, ושיטות זיהוי אחרות אינן מעשיות לניטור שגרתי וחוזר. מגבלות זיהוי, בקרת איכות וחישובים סטטיסטיים תלויים בסוג תא ספירת התאים ובצרכי המשתמש.
  2. גידול על ידי ביוריאקטור
    1. הכנת בלון עם מזרק שונה
      1. הסר את הבוכנה משלושה מזרקי נעילה של 10 מ"ל (אחד לכל הרכבה סופית). חותכים את האוגן מכל מזרק וממלאים את הקצה הכרות כדי שלא ינקב את הבלונים. נקה את כל השבבים מתויקים מתוך מזרק שונה.
      2. הכינו בלון כפול על ידי הנחת בלון אחד בתוך בלון אחר.
      3. מותחים את קצה הבלון המוכפל מעל מזרק 10 מ"ל שונה.
      4. מפרידים מעט בין קצה הבלון החיצוני לבלון הפנימי. סחטו החוצה את כל האוויר הכלוא בין הבלונים.
      5. הדקו את האזיקון סביב בסיס הבלונים כדי להצמיד את הבלונים למזרק.
    2. הכנת פקק שונה
      1. הסר את הבוכנות מעשרה מזרקי נעילה של 1 מ"ל (שניים לכל פקק שיש לשנות). חותכים את האוגן מהמזרקים.
      2. הגדר שני פקקי גומי בגודל #10 (עבור 8 L carboys) ושלושה גדלים עבור בקבוקים עם גימור חוט GL45 (עבור בקבוקי תפיסה). באמצעות מקדח בגודל 1/4 אינץ' (6.4 מ"מ), קדח שני חורים דרך החלק העליון של כל פקק גומי רחב מספיק כדי שהמזרקים ששונו יתאימו וצרים מספיק כדי שההתאמה תהיה אטומה.
      3. הכנס את המזרקים שהשתנו דרך החורים של פקק הגומי.
      4. נקה ובצע autoclave את הפקק שונה ב 121 ° C למשך 30 דקות.
    3. הכנת מכלול הביוריאקטור
      1. יש לחטא עם 70% אתנול את כל הסטופקוקים, מחברי מתאם נעילת הלואר הנשי וחומרים ביוריאקטורים אחרים שאינם ניתנים להרכבה, ואוטוקלאבה בטמפרטורה של 121°C למשך 30 דקות את כל הצינוריות (לאחר חיתוך לאורך), פקקים, צמר זכוכית וחומרים ביוריאקטורים אחרים הניתנים להרכבה.
      2. הניחו ביוריאקטור סטרילי (איור 1 ואיור 2) על מעמד טבעתי ואבטחו אותו באמצעות רצועת שרשרת. כמו כן הוצבו אמבט מים, משאבה פריסטלטית, קרבוי 8 ליטר פקק המכיל מדיום (משלב פרוטוקול 1.2), בקבוק 3.5 ליטר אחד (בקבוק תפיסה ללא דגימה), ובקבוק אחד של 500 מ"ל (בקבוק תפיסת דגימה).
      3. לעצור את הקארבוי
        1. מוציאים בלון עם מזרק מותאם. חברו סטופקוק תלת-כיווני לקצה נעילת הפיתוי של המזרק.
        2. קח את מכלול הבלונים וחבר את הסטופקוק התלת-כיווני לצינורות של מיכל N2. סובב את הסטופקוק המשולש כדי לחסום את הקצה הפתוח לאטמוספירה.
        3. פתחו את מיכל הדלק ומלאו את הבלון ב-N2. לאחר שהתמלא, סובב את הסטופקוק המשולש כדי לחסום את הקצה לבלון. סגור את מיכל הדלק ונתק את צינור המיכל מהסטופקוק התלת-כיווני.
        4. חבר את הדברים הבאים ברצף: סטופקוק תלת-כיווני (של הבלון עם המזרק שהשתנה), סטופקוק דו-כיווני, מצמד מתאם נעילת פיתוי נשי, וקצה מנעול הפיתוי של אחד המזרקים של הפקק שהשתנה.
        5. לקצה נעילת הפיתוי של המזרק השני, חברו סטופקוק דו-כיווני. סגור את שני השסתומים של הסטופקוקים הדו-כיווניים במכלול הפקק השונה.
        6. בטל את החוט המחזיק את פקק #10 בגודל #10 של הקארבוי. החלף במהירות את הפקק שלא השתנה במכלול הפקק שהשתנה וסובב את החוט כבעבר כדי לאבטח את מכלול הפקק שהשתנה לרכב.
          הערה: אם אתה בטוח ומוכן, ניתן להשתמש במכלול הפקק שהשתנה כדי לעצור את הקארבוי בשלב הסופי של הכנה בינונית (שלב 1.2.2.7).
        7. סובב את הסטופקוק המשולש כדי לחסום את הקצה הפתוח לאטמוספירה. פתח את הסטופר הדו-כיווני ברצף. הגז של הבלון ומרחב הראש של הקארבוי 8 ליטר מחוברים כעת.
      4. עצירת בקבוקי התפיסה ללא דגימה ודגימה
        1. פקק את בקבוק התפיסה ללא דגימה בנפח 3.5 ליטר עם פקק מותאם בגודל לבקבוקים עם גימור חוט GL45, תוך מריחת 70% אתנול על בסיס הפקק כדי לסייע בהכנסתו לבקבוק. יש לסגור את הבקבוק עם פקק בורג פתוח GL45.
        2. חבר את הדברים הבאים ברצף: בלון עם קצה נעילת הלואר של המזרק שהשתנה, סטופקוק תלת-כיווני, מצמד מתאם נעילת luer נקבה וקצה נעילת luer של אחד המזרקים של הפקק שהשתנה. סובב את הסטופקוק המשולש כדי לחסום את הקצה פתוח ישירות לאטמוספירה.
        3. לקצה מנעול הפיתוי של המזרק השני, חברו מצמד מתאם נעילה נשי.
        4. חזור על שלושת השלבים לעיל עבור בקבוק הדגימה 500 מ"ל.
      5. התקנת צינורות
        1. מדוד את המרחק בין יציאות מעיל המים של הביוריאקטור לבין מוטות צינור אמבט המים. חתכו שני אורכים של 3/16 אינץ' (4.8 מ"מ) ID, 3/8 אינץ' (9.5 מ"מ) צינורות סיליקון OD כדי לחצות מרחק זה.
        2. הרכיבו שני מחברי צינורות ישרים עם מכסי ברגים פתוחים GL14. חברו כל אחד מהם לקצה אחד של שני חלקי הצינורות.
        3. סובב את מכסי הברגים אל יציאות מעיל המים של הביוריאקטור. חברו את הקצוות האחרים של הצינור לצינורות אמבט המים כך שהמים יזרמו החוצה מאמבט המים, ייכנסו לתחתית מעיל המים של הביוריאקטור, יצאו בחלק העליון של מעיל המים ויחזרו לאמבט המים. הדקו את האזיקונים סביב קצות הצינור כדי לאבטח את הצינור לצינורות צינור המים.
        4. עבור משאבות הדומות למיני-משאבת VWR Ultra Low Flow Variable Flow Mini-Pump, יש להשחיל את מכלול הצינור המחורץ OD הנלווה בגודל 3/16 אינץ' (4.8 מ"מ) דרך המשאבה.
        5. מדוד את המרחק בין מכלול צינורות הקרבוי למכלול צינורות המשאבה הפריסטלטיים. חתך אורך של 3/16" (4.8 מ"מ) ID, 3/8" (9.5 מ"מ) צינורות סיליקון OD כדי לחצות מרחק זה.
        6. חבר קצה אחד של הצינור למוט הצינור של מכלול צינורות הקרבוי ואת הקצה השני למוט הצינור של מכלול צינורות המשאבה הפריסטלטית, בכיוון כך שהתווך יזרום מהקארבוי ודרך המשאבה הפריסטלטית.
        7. מדוד את המרחק בין מכלול צינורות המשאבה הפריסטלטית לבין היציאה התחתונה של הביוריאקטור. חתך אורך של 3/16" (4.8 מ"מ) ID, 3/8" (9.5 מ"מ) צינורות סיליקון OD כדי לחצות מרחק זה.
        8. חבר קצה אחד של צינור זה לצינור של מכלול צינורות המשאבה הפריסטלטית וחבר בזהירות את השני ליציאה התחתונה של הביוריאקטור. נזהרים לא לסדוק את הזכוכית אלא גם לאבטח את החיבור, הדקו אזיקון סביב קצה הצינור כדי לאבטח את הצינור ליציאה התחתונה של הביוריאקטור.
        9. מדוד וחתוך כ-5 אינץ' (127 מ"מ) אורך של 3/16 אינץ' (4.8 מ"מ) ID, צינורות סיליקון OD 3/8 אינץ' (9.5 מ"מ).
        10. חבר מחבר מתאם נעילה נשי לסטופקוק תלת-כיווני. חבר כל קצה של הסטופקוק המשולש לצינור.
        11. הרכיבו מחבר צינור זוויתי אחד עם מכסה בורג פתוח GL14. חברו אותו לקצה השני של הצינור.
        12. סובב את מכסה הבורג ליציאה האנכית העליונה של הביוריאקטור. סובב את הסטופקוק המשולש כדי לחסום את הקצה והצביע על הביוריאקטור.
        13. מדוד את המרחק בין מכלול היציאה האנכי העליון לבין מכלול בקבוק התפיסה שאינו דגימה. חתך אורך של 3/16" (4.8 מ"מ) ID, 3/8" (9.5 מ"מ) צינורות סיליקון OD כדי לחצות מרחק זה. חותכים את האוגנים משני מזרקי נעילה של 1 מ"ל ומכניסים אותם לקצוות הצינור.
        14. חבר קצה אחד של מכלול צינורות זה לסטופקוק התלת-כיווני של מכלול היציאה האנכי העליון ביותר וחבר את הקצה השני למחבר מתאם נעילת הפיתוי הנשי במכלול בקבוק התפיסה ללא דגימה.
        15. מדוד את המרחק בין מכלול היציאה האנכי העליון לבין מכלול בקבוק הדגימה. חתך אורך של 3/16" (4.8 מ"מ) ID, 3/8" (9.5 מ"מ) צינורות סיליקון OD כדי לחצות מרחק זה. חותכים את האוגנים משני מזרקי נעילה של 1 מ"ל ומכניסים אותם לקצוות הצינור.
        16. חבר קצה אחד של מכלול צינורות זה לסטופקוק התלת-כיווני של מכלול היציאה האנכי העליון ביותר וחבר את השני למחבר מתאם נעילת הפיתוי הנשי במכלול בקבוק תפיסת הדגימה.
    4. מילוי הביוריאקטור
      1. מכסים את אחת מיציאות GL18 של הביוכור עם מחיצת גומי לבנה. יש לסגור את יציאת GL18 השנייה ואת יציאות GL14 החשופות אנכית הנותרות עם PTFE בגודל GL18/GL14 הפונה לסיליקון ספטה (PTFE מול הזכוכית) ומכסי ברגים עליונים פתוחים.
      2. בעזרת מוט באורך 50 ס"מ, יש לארוז 0.9 גרם של צמר זכוכית בבסיס הביוריאקטור.
      3. Autoclave 1.3 ליטר של חול ב 121 ° C במשך 30 דקות. מלאו את הביוריאקטור בחול באמצעות משפך.
        הערה: ניתן להחליף כאן סוגי משקעים אחרים המבוססים על סביבת הקורא ומיקרואורגניזמים בעלי עניין.
      4. הניחו את הצינור במיכל של N2 לחלק העליון של הביוריאקטור ושטפו את ראש הביוריאקטור עם N2 למשך 2 דקות. סגרו מיד את הביוריאקטור עם פקק בגודל #7 ומכסה בורג פתוח GL45.
      5. מבקבוק התפיסה שאינו דוגם, נתקו את הצינור וסובבו את הסטופקוק התלת-כיווני כדי לחסום את הקצה המצביע על הבלון. חבר את הצינור למיכל של N2 למחבר מתאם נעילת הלואר הנשי ושטוף את מרווח הראש של הביוריאקטור עם N2 למשך 2 דקות. מיד לחבר מחדש את הצינור ולהחזיר את הסטופקוק המשולש כדי לחסום את הקצה הפתוח לאטמוספירה.
      6. חזור על השלב לעיל עבור בקבוק הדגימה.
      7. סובב את הסטופקוק התלת-כיווני של היציאה האנכית העליונה של הביוריאקטור כדי לחסום את הקצה והצביע על בקבוק הדגימה. יש לשאוב נוזלים מהקארבוי לתוך הביוריאקטור. עצרו את המשאבה, אווררו את בלון בקבוק הדגימה, ומלאו את בלון הקארבוי ב-N2 לפי הצורך.
      8. לאחר שהביוריאקטור התמלא בתווך, הגדר את קצב זרימת המשאבה ל- 0.6 מ"ל לדקה (ערך דיגיטלי של 40 במשאבת המיני).
        הערה: ניתן להחליף קצבי זרימה אחרים הרצויים לקורא כאן.
      9. הגדר את טמפרטורת אמבט המים, כפי שהיא מעודכנת בטבלה 1 או בסביבת העניין של הקורא.
        הערה: ניתן להוסיף Inoculum בשלב זה או מאוחר יותר, בהתאם לפרטי המחקר. אם אתם מחוסנים בשלב זה, המשיכו לשלב 3.2.4.10. אם החיסון מאוחר יותר, המשך לשלב 3.2.5.
      10. הניחו בקבוק איסוף או בקבוק תרבית מחוסן ובקבוק סטרילי פקק של N2. טפטפו 100% אתנול על הפקקים והציתו אותם באמצעות מצית.
      11. להרכיב מחט 23 גרם על מזרק 60 מ"ל. ברגע שהפקקים כבר לא בוערים, הכנס את המחט לבקבוק N2 וצייר ~ 50 מ"ל של N2. חלצו את המחט.
      12. לחץ באיטיות על הבוכנה כדי לשחרר את N2. ברגע שהמזרק ריק, הכנס את המחט לבקבוק האיסוף וצייר 50 מ"ל של הדגימה הסביבתית. חלצו את המחט.
      13. החליפו את מחט 23 גרם במחט מתכת סטרילית ארוכה (צינורית, אורך 31.5 ס"מ). הכנס את מחט המתכת הארוכה דרך מחיצת הגומי הלבנה ביציאת GL18 של הביוריאקטור.
      14. דוחפים את המחט לתוך המשקע ומזריקים את החיסון. חלצו את המחט.
    5. הפעלת תחזוקת ביוריאקטורים
      1. בכל יום שבו הביוריאקטור פועל, בצע את הפעולות הבאות:
        1. בדוק את מפלס אמבט המים. אם הם נמוכים, הוסיפו עוד מים (השתמשו במים מזוקקים לאריכות ימים של הציוד על ידי הפחתת קורוזיה והצטברות מינרלים).
        2. בדוק את הבלון של בקבוק התפיסה שאינו דגימה; בלון מלא יעכב את זרימת התווך. כאשר הוא מלא, סובב את הסטופר המשולש כדי לחסום את הקצה והצביע על בקבוק התפיסה. לסחוט את הבלון כדי לרוקן אותו; לאחר מכן, להחזיר את הסטופקוק המשולש כדי לחסום את הקצה הפתוח לאטמוספירה; חזור על הפעולה עד שהבלון מתרוקן.
        3. בדוק את הבלון של 8 ליטר carboy. אם הוא נמוך, סגור את הסטופקוק הדו-כיווני ברצף ונתק את הסטופקוק התלת-כיווני מהסטופקוק הדו-כיווני. מלא מחדש וחבר מחדש את מכלול הבלון לפי השלבים 3.2.3.3.2, 3.2.3.3.3 ו- 3.2.3.3.7.
        4. בדוק את רמת המדיום בקרבוי 8 ליטר. אם נמוך, להרכיב עוד 8 ליטר carboy ולהכין בינוני יותר בעקבות פרוטוקול שלבים 1.2. ו-3.2.3.3. השהה את המשאבה, סגור את שסתום כדור הצינור, נתק במהירות את הקארבוי הישן וחבר את הקארבוי החדש.
          הערה: עבור קצב זרימה של 0.6 מ"ל/דקה, יהיה צורך בתווך חדש כל 9 ימים.
        5. בדוק את רמת המדיום בבקבוק התפיסה שאינו דגימה. אם הוא מלא, יש להרכיב בקבוק נוסף ללא דגימה לפי שלב 3.2.3.4.1. שוטפים את הבקבוק החדש ב-N2, מנתקים במהירות את הבלון עם המזרק והצינורית ששונו מהבקבוק הישן ומתחברים לבקבוק החדש.
        6. הסר את הפקק שהשתנה מבקבוק תפיסה מלא שאינו דגימה. Autoclave את הנוזל ב 121 °C במשך 30 דקות; לאחר מכן, השליכו את הנוזל בהתאם למדיניות המוסדית של הקורא. נקו ובצעו אוטוקלאבים של כל חלקי מכלול בקבוק התפיסה ללא דגימה כדי להכין אותם לשימוש הבא.
      2. בצע דגימה כל 7 ימים (או מספר רצוי של קוראים) על ידי ביצוע הפעולות הבאות:
        1. סובב את הסטופקוק התלת-כיווני של היציאה האנכית העליונה ביותר של הביוריאקטור כדי לחסום את הקצה והצביע על בקבוק התפיסה שאינו דגימה. לאסוף 250 מ"ל של נוזל.
          הערה: עבור קצב זרימה של 0.6 מ"ל/דקה, איסוף 250 מ"ל ייקח ~ 7 שעות.
        2. החזירו את הסטופקוק התלת-כיווני של היציאה האנכית העליונה של הביוריאקטור כדי לחסום את הקצה המצביע על בקבוק הדגימה. נתק את הצינור ואת בקבוק הדגימה מהסטופקוק התלת-כיווני של היציאה האנכית העליונה ביותר של הביוריאקטור.
        3. לאחר בדיקה, אחסון ו/או סילוק נכון של נוזל הדגימה, יש לנקות את כל חלקי מכלול בקבוק הדגימה למעט הבלון עם המזרק ששונה. Autoclave כל החלקים ב 121 ° C במשך 30 דקות למעט הבלון עם מזרק שונה ומחברי מתאם נעילת luer נקבה. הרכיבו מחדש ליום הדגימה הבא.
          הערה: מומלץ מאוד לבצע יתירות כפולה או משולשת של חלקים, מכסים, צינורות וספטה לצורך תיקון והחלפה מהירים במידת הצורך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן אנו מציגים תוצאות ממחקר ביוריאקטור המשתמש בשיטת הכנה בינונית של תרבית מעורבת בקידוח ובשיטת התקנת ביוריאקטור כמתואר כאן. מדיום התרבית המעורבת בקידוח שונה כדי להכיל כמקור פחמן תרחיף של קלחי תירס שעובדו על ידי המסה הידרותרמית חמצונית (OHD)13,14. מדיום תרבית מעורבת של קידוח שונה נשאב לתוך הביוריאקטור במשך 44 ימים בקצב של 0.4 מ"ל/דקה. ביום ה-23 נוסף חיסון שמקורו בקידוח BLM-1 באזור עמק המוות בנבאדה, ארה"ב,15. דגימות נוזליות מהביוריאקטור נאספו בבקבוק דיגום בימים 1, 8, 15, 22, 23 (לאחר חיסון), 30, 37 ו-44.

כדי לעקוב אחר המצב הכללי של תרבית החיסון (והתושבים ששרדו לפני החיסון אוטוקלב של משקעי הביוריאקטורים), דגימות נוזליות של ביוריאקטורים נצפו על ידי ספירת תאים ישירה. ספירת תאים ישירה של נוזל שנדגם נעשתה באמצעות המוציטומטר Petroff-Hauser. כדי ללמוד את זהותם של חברים מיקרוביאליים בביוריאקטור, דנ"א הופק מדגימות נוזליות של ביוריאקטורים, והגנים 16S rRNA נותחו על ידי ריצוף הדור הבא (NGS). נתוני ה-NGS עובדו בתוך החברה באמצעות mothur בעקבות MiSeq SOP16.

לפני החיסון, ספירת תאים ישירה הייתה לעתים קרובות מתחת למגבלת הזיהוי (b.d.l.) של 1.0 ×10 6 תאים/מ"ל. ביום ה-23 (לאחר החיסון) הייתה ספירת תאים נמוכה של 2.6 ×-106 תאים/מ"ל, ואילו בימים שלאחר מכן ב-30, 37 ו-44 הייתה ספירת תאים מעל 1.0 ×-107 תאים/מ"ל (איור 3). אף על פי שספירת התאים הייתה b.d.l. בימים 1, 8 ו-22, DNA הופק עבור NGS מכל נקודת זמן, מה שמצביע על נוכחות בסיסית של מיקרואורגניזמים קדם-חיסוניים במשקעים גם לאחר אוטוקלאבינג. הסוג העיקרי הקיים (נקבע על ידי מספר הקריאות בכל יחידה טקסונומית תפעולית (OTU)) היה יציב בימים 8, 15 ו-22, וזוהה כגאובצילוס. לאחר החיסון עם BLM-1 inoculum ביום ה-23, Geobacillus כבר לא שלט, וסוגים עיקריים חדשים הופיעו יחד עם מספר רב של סוגים נוכחים מינוריים, אשר לרוב שמרו על נוכחות עד סוף המחקר (איור 4). מאלו אנו מסיקים שהחיסון BLM-1 היה תרבית פעילה ומשתנה באופן דינמי בתוך הביוריאקטור.

מחקר נוסף של נתוני NGS חשף חברים ב"חומר האפל המיקרוביאלי". OTUs עם שמות טקסונומיים שהוקצו המכילים את המילים "לא מסווג" או "לא תרבותי" שימשו כפרוקסי עבור OTUs המכילים חברים של "החומר האפל המיקרוביאלי". נתוני NGS נאספו ליום 44 (היום האחרון של החיסון עם מיקרואורגניזמים מקידוח BLM-1) וסוננו כך שלא יכילו OTUs שהיו להם קריאות בנתונים לפני החיסון (ימים 1, 8, 15 או 22) מכיוון שסביר להניח ש- OTUs אלה לא היו בחיסון. נתוני היום המסונן 44 NGS הכילו 1,844 OTUs ו-3,396 קריאות. מתוכם, 366 קריאות OTUs (20%) ו-925 קריאות (27%) לא סווגו ברמת הסוג, ו-1252 OTUs (68%) ו-2357 קריאות (69%) היו לא מסווגות או לא מתורבתות ברמת הסוג. למרות שהוא קצר טווח, מחקר פיילוט זה תומך בפוטנציאל של ביוריאקטור עם מדיה מודעת לסביבה לחברי התרבית של "החומר האפל המיקרוביאלי".

Figure 1
איור 1: סכמה של ביוריאקטור בורוסיליקט בעיצוב מותאם אישית המשמש לתרבית אנאירובית. (A) מבט על ביוריאקטור מצד אחד. (B) סיבוב A ב-90° (בכיוון השעון) סביב ציר z נותן את התצוגה). (C) מבט מלמעלה על הביו-ריאקטור. עיצוב הז'קט מאפשר בקרת טמפרטורה עם מים או שמן. את שתי יציאות הז'קט ניתן לראות בצד ימין של הנוף ב-B. החדר הפנימי יכול להיות מלא במשקעים מכל סוג שהוא או יכול להישאר ריק ממשקעים לתרבית פלנקטונית. שלוש יציאות דגימה (הנראות בצד ימין של התצוגה ב-A) מאפשרות להסיר חומר בעומקים שונים של עמודת הביוריאקטורים. ניתן לאטום פתחים סטנדרטיים של 45, 18 ו-14 GL באמצעות ספטה טפלון או בוטיל שיחזיקו אטם אטום לגז למשך 1-6 חודשים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הרכבה פעילה של ביוריאקטור. כלי זכוכית המוצגים בתמונה משמאל לימין הם (A) 8 ליטר carboy, (B) ביוריאקטור (ראו איור 1), ו-(C) בקבוק מלכוד ללא דגימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ספירת תאים ישירה ממחקר ביוריאקטורים. אוכלוסיות מיקרוביאליות בתוך הביוריאקטור נוטרו באמצעות תא ספירת תאי המוציטומטר פטרוף-האוזר בקוטר 0.02 מ"מ. אינוקולום נוסף בתחילת היום ה-23. ספירת התאים בימים 1, 8 ו-22 הייתה מתחת למגבלת האיתור. מגבלת הזיהוי האפקטיבית של ספירת תאים ישירה היא 1 × 106 תאים/מ"ל. קיצור: b.d.l. = מתחת למגבלת האיתור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ריצוף הדור הבא של ביוריאקטור. OTUs מיוצגים בגרפים מוערמים המציינים את אחוז הקריאות השייכות ל- OTUs ייחודיים מכל נקודת זמן של מחקר הביוריאקטורים. OTUs ייחודיים הוקצו לטקסונומיה הקשורה אליהם בחיתוך סוג. סוג 'אחר' מוגדר ככל הסוגים פחות מ-10% מהקריאות בכל נקודת זמן. המספר הכולל של קריאות DNA המיוצגות הוא 506,358. מספר הקריאות עבור כל נקודת זמן מופיע בראש הגרף. אינוקולום נוסף בתחילת היום ה-23. קיצור: OTU = יחידה טקסונומית תפעולית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תרכובת כמות לתרבית מעורבת קרקע כמות עבור תרבות מעורבת קידוח כמות עבור מתאנוגן מבודד קידוח
מים מזוקקים 1000.0 מ"ל 1000.0 מ"ל 1000.0 מ"ל
HEPES 3.600 גרם - -
MOPS - - 2.000 גרם
MgCl2 ∙6 H2O 0.400 גרם 0.400 גרם 0.400 גרם
KCl 0.500 גרם 0.250 גרם 0.500 גרם
NH4Cl 0.268 גרם 0.268 גרם 0.268 גרם
נא2SO4 - 0.284 גרם 1.500 גרם
Na2HPO4 ∙2 H2O - - 0.356 גרם
1 מ KH2PO4 ב pH 6 1.0 מ"ל 1.0 מ"ל -
1 M H3BO3 ב pH 9.4 1.0 מ"ל 1.0 מ"ל 1.0 מ"ל
יסודות קורט 1.0 מ"ל - 1.0 מ"ל
ויטמינים - - 1.0 מ"ל
1 מ"ג/מ"ל נתרן רזזורין 0.4 מ"ל 0.3 מ"ל 0.4 מ"ל
התאמת pH ל - 7.0 7.0
התאמת pH על ידי - נאוה קו
טמפרטורת הדגירה 25°C 60°C 47°C

טבלה 1: הרכב מדיה. רשימת תרכובות ופרמטרים פיזיים לכל מדיום. התקשורת המוצגת נאיבית; הם אינם מכילים פחמן ומקורות אנרגיה כמו אלה יכולים להיות ספציפיים צריך להיות מעודכן על ידי מיקרואורגניזמים של הקורא ואת הסביבה של עניין. עיין בסעיף הדיון לקבלת רעיונות לתוספות אפשריות של פחמן ומקורות אנרגיה.

קובץ משלים 1: התקנת סעפת גז. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרק הייצור הבינוני של פרוטוקול זה (סעיף 1) חב את מבנהו לטכניקת ההונגט השונה של מילר וולין17, שהייתה בשימוש נרחב מאז פרסומה. המעשיות של פרוטוקול מורחב זה נובעת מאופיו התיאורי ומהזיווג שלו עם רכישה באתרו של מיקרואורגניזמים. בקבוקי תרבית המכילים מדיה מדומה ומודעת לסביבה שימשו לתרבית מוצלחת של החברים הבאים שנרכשו באתרם של "החומר האפל המיקרוביאלי": חיידקים אנאירוביים מתחת לפני השטח זן Thermoanaerosceptrum fracticalcis DRI1318, זן Caldiatribacterium inferamans SIUC1 (מספר הצטרפות MT023787; כתב יד בהכנה) ו - Anaerothermus hephaesti זן SIUC3 (מספר הצטרפות MK618647; כתב יד בהכנה), וחיידק אנאירובי תת-קרקעי לא מאופיין DRI14 (מספר הצטרפות KR708540).

אחד המוקדים של פרוטוקול זה הוא שהוא עשוי להיות בעל יכולת הסתגלות גבוהה לסביבות אנאירוביות תת-קרקעיות ולמיקרואורגניזמים. ראשית, מעודדים לשנות את הרכב המדיום כך שישקף את הרכב סביבת העניין. לדוגמה, ניתן להוסיף 3,000 מ"ג/ליטר של NaCl למתכון כאשר מדמים סביבה עם ריכוזים יוניים של 3,000 מ"ג/ליטר הן עבור Na+ והן עבור Cl-; או 650 מ"ל חול ו-650 מ"ל פצלים יכולים להיות ממוקמים בביוריאקטור כאשר מדמים סביבה עם יחס נפח של 1:1 בין אבן חול לפצלים. שנית, ניתן לשנות את הרכב המדיום כדי לעודד צמיחה של מיקרואורגניזמים ספציפיים בעלי עניין. במיוחד, אמצעי תקשורת נאיביים כמו שלושת אמצעי התקשורת במאמר זה דרוכים לשינויים כאלה ותלויים בהם. דוגמאות למקורות פחמן ואנרגיה כוללות פומרט18, פפטון18, חומר אורגני המכיל תאית19, אצטט20, תמצית שמרים19,20, קסיליטול (זן SIUC1), פורמט (זן SIUC3), ומקורות פוטנציאליים אחרים כגון H2/CO2, ציטראט וגלוקוז. לבסוף, הרכב בינוני ניתן לשנות בהתאם המחקר הרצוי. לדוגמה, העניין העיקרי של המחקר המתואר בסעיף התוצאות המייצגות היה לגלות כיצד מיקרואורגניזמים אנאירוביים תת-קרקעיים מייצגים יגיבו לתרחיף אורגני מעורב ייחודי (תרחיף של קלחי תירס המעובדים על ידי OHD13,14); לפיכך, המתכון שלה הכיל מקור פחמן זה במקום אפשרויות קונבנציונליות יותר. תיקונים אפשריים אחרים למחקרים ספציפיים כוללים הוספת פלסטיק, חומצות ומתכות כבדות, או קסנוביוטיקה אחרת למחקרי ביו-רפואה; הוספת פולימרי פחמן סרבנים כגון תאית ופלסטיק למחקרי מוצרים בעלי ערך מוסף שעברו דה-פולימריזציה; והוספת זבל ופסולת צמחים לקומפוסט בקנה מידה קטן ולמחקרים חקלאיים אחרים.

אם רוצים ניתוח פוסט-רדוקטיבי של תווך, כגון מדידות של pH, פוטנציאל הפחתת חמצון (ORP) וחמצן מומס (DO), ניתן להשיג זאת בעקיפין על ידי הקרבת מספר מייצג של בקבוקים בינוניים כדי להבין בביטחון את אופי האצווה. עם חשיפת בקבוק בינוני אטום לאוויר, מומלץ בחום לבצע את קריאות ORP ו-DO פחות מדקה עם הפתיחה. מדידות שאינן תלויות חמצן (למשל, pH) ניתן לבצע באופן לא דחוף לאחר הפתיחה הראשונית. מיקרואורגניזמים אנאירוביים מהירים דורשים בדרך כלל ערכי ORP < -200 mV לצמיחה. אם המדיום מביא לערך ORP של > -200 mV ו/או ערכי DO >0.40 מ"ג/ליטר, ניתן להשתמש ב-Na2S נוספים (0.1-0.2 גרם/ליטר) או ברדוקציה אחרת (למשל, טיטניום ציטראט, L-ציסטאין, חומצה אסקורבית) כדי להפחית את המדיום עוד יותר.

Resazurin משמש לעתים קרובות מחוון חמצן (כמו בפרוטוקול זה); עם זאת, זה מדויק יותר מחוון חמצון-חיזור21, המציין נוכחות של חמצן בעקיפין כמו חמצן משנה את פוטנציאל חמצון-חיזור של תמיסה. Resazurin בתמיסה בתחילה מופיע בצבע כחול. עם החשיפה לחומרים מחזרים, התמיסה משתנה באופן בלתי הפיך לצבע ורוד. כאשר התמיסה מצטמצמת עוד יותר, היא עוברת באופן הפיך לחסרת צבע וחוזרת לוורוד עם החמצון. המחברים הבחינו במקרים שבהם מדיה מופחתת המכילה רסזורין עברה מכחול לוורוד, אך לא הצליחה לעבור לחסרת צבע. עם זאת, המחברים גם הבחינו כי מדיה כזו לעתים קרובות לעבור חסר צבע לאחר autoclaving, וכי זמן רב יותר בילה רותחים ושטיפה את המדיה בדרך כלל מאפשר resazurin לעבור לצורתו חסרת צבע לאחר הוספת reductants. אם תרצה, ריכוז החמצן בתווך ניתן לאמת עם בדיקת חמצן מומס.

כל החומרים הדרושים להפעלת ביוריאקטורים אלה והביוריאקטורים מזכוכית בהתאמה אישית עצמם לא עלו על ~ $5K (זאת בהנחה שציוד תמיכה כבר זמין כגון אמבטיות מים, משאבות ואינקובטורים). טכניקות גידול אנאירוביות אלה ידידותיות מבחינה כלכלית, בהשוואה לביוריאקטורים אוטומטיים מסחריים שיכולים להתחיל ב -10 אלף דולר >. בנוסף, ביוריאקטורים מסחריים רבים עוברים למיכלי כורים חד-פעמיים, מה שמשנה את דינמיקת ההשוואה ואינו משתלם כלכלית למעבדות מחקר / אוניברסיטאות קטנות יותר להחליף ללא הרף. בנוסף, מערכות מסחריות עשויות להיות הטיות כימיות בייצור (מהפלסטיק שבו נעשה שימוש, שומן על אטמים/אביזרים או מים שטופלו כימית) שישפיעו על הצלחת הגידול של מיקרואורגניזמים דקיקים. העלות הנמוכה, ההתאמה האישית והרבגוניות לאיסוף דגימה סביבתית אנאירובית, בשילוב עם מדיה מושכלת שניתן להתחסן, המביאה ליצירת העשרה למחקר, מגבירה מאוד את הסיכויים לרכוש מיקרואורגניזמים ייחודיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם ניגודי עניינים.

Acknowledgments

המחברים רוצים להכיר בשושלת המידע וההדרכה שהשפיעו / פיתחו טכניקות אלה לאורך השנים. ד"ר המילטון-ברהם כסטודנטית לתואר שני, פוסט-דוקטורנטית ופרופסור בהווה חבה חוב של הכרת תודה לאלה שהקדישו מזמנם ללמד טכניקות אנאירוביות: ד"ר מייק אדמס, ד"ר גרטי שוט, ד"ר ג'ים אלקינס, ד"ר מירצ'ה פודאר, ד"ר דואן מוזר וד"ר בריאן הדלונד. Nature Conservancy ו-American Rivers תמכו בעבודה זו באמצעות מענקים G21-026-CON-P ו-AR-CE21GOS373, בהתאמה. כל הדעות, הממצאים, המסקנות או ההמלצות המובעות במאמר זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את הדעות של שמורת הטבע או של נהרות אמריקה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון לאנרגיה מתקדמת של SIU, אשר מכיר בהכרת תודה במימון המוענק באמצעות מועצת משאבי האנרגיה המתקדמת. NGS בוצע על ידי LC Sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
General Materials
1 L borosillicate bottle Fisher Scientific
1 mL syringe with slip tip Fisher Scientific
10 mL glass pipette Fisher Scientific
100 mL culture bottle Fisher Scientifc
20 mm hand crimper Fisher Scientifc
23 G needle Fisher Scientifc
500 mL borosilicate bottle Fisher Scientific
Aluminum seal Fisher Scientifc
Cannula, 31.5 cm length Fisher Scientific
Cannula, 6 cm length Fisher Scientifc
Corer Giddings Machine Company  Assembled from company parts
Gas manifold Swagelok Assembled from many different parts
Lighter Lowe's
N2 gas Airgas
Nitrile gloves Fisher Scientific
Rubber stopper (for GL45 bottles) Glasgeratebau OCHS
Rubber stopper (for culture bottles) Ace Glass
Stirring hot plate Corning
Trace minerals ATCC
Vitamins ATCC
Bioreactor-specific Materials
#10 rubber stopper Ace Glass
#7 rubber stopper Fisher Scientifc
1 mL syringe with luer lock tip Fisher Scientifc
1/4" hose barb ball valve Amazon
10 mL syringe with luer lock tip Fisher Scientifc
3.5 L borosilicate bottle Fisher Scientific
5/16" - 1/4" hose barb adapter fitting Amazon
60 mL syringe with luer lock tip Fisher Scientifc
8 L borosillicate carboy Allen Glass
Angled hose connector for GL14 open top cap Ace Glass 7623-20
Balloon Party City
Borosillicate bioreactor Allen Scientific Glass Custom made upon request
Drill Lowe's
Female luer lock adapter coupler Amazon
GL14 open top cap Ace Glass 7621-04
GL18 open top cap Ace Glass 7621-08
GL45 open top cap Ace Glass
PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap Ace Glass 7625-06
PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap Ace Glass 7625-07
Ring stand Fisher Scientific
Ring stand chain clamp Amazon
Ring stand clamp Fisher Scientific
Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od Grainger 55YG13
Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od Grainger
Straight hose connector for GL14 open top cap Ace Glass 7623-22
Three-way stopcock Amazon
Two-way stopcock Amazon
Ultra low flow variable flow mini-pump VWR
Water bath Fisher Scientifc
White rubber septum for 13-18 mm od tubes Ace Glass 9096-49
Wire Lowe's
Zip tie Lowe's

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Staley, J. T., Konopka, A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).
  2. Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes. MSystems. 3 (5), e00055 (2018).
  3. Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
  4. Marcy, Y., et al. Dissecting biological "dark matter" with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).
  5. Giovannoni, S., Stingl, U. The importance of culturing bacterioplankton in the'omics' age. Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).
  6. Stewart, E. J. Growing unculturable bacteria. J. Bacteriol. 194 (16), 4151-4160 (2012).
  7. Dedysh, S. N. Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps. Front. Microbiol. 2, 184 (2011).
  8. Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. Isolating" uncultivable" microorganisms in pure culture in a simulated natural environment. Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).
  9. Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012 (2011).
  10. Tyson, G. W., et al. Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community. Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).
  11. Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).
  12. Merino, N., et al. Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow. Sci. Total Environ. 842, 156768 (2022).
  13. Anderson, K. B., Creeping, J. C., Huggett, W. W. Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791. , Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf (2013).
  14. Anderson, K. B., Crelling, J. C., Huggett, W. W., Perry, D. M. Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512. , Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf (2018).
  15. Mullin, S. W., et al. Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer. Front. Microbiol. 11, 536535 (2020).
  16. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).
  17. Miller, T. L., Wolin, M. A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes. Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).
  18. Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin. Front. Microbiol. 10, 2224 (2019).
  19. Hamilton-Brehm, S. D., et al. Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).
  20. Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).
  21. Twigg, R. S. Oxidation-reduction aspects of resazurin. Nature. 155 (3935), 401-402 (1945).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 203
קבוצה של פורמטים מדומים מדומים <em>באתרם</em> לטיפוח מיקרואורגניזמים אנאירוביים שנרכשו בסביבה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zimmerman, T., Leamon, G.,… More

Zimmerman, T., Leamon, G., Dillenburg, G., Egge, B., Pierce, J., Elliott, B., Murphy, T., Brooks, M., Hamilton-Brehm, S. D. A Set of In Situ Informed Simulated Medium Formats for Culturing Environmentally Acquired Anaerobic Microorganisms. J. Vis. Exp. (203), e66228, doi:10.3791/66228 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter