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पर्यावरण की दृष्टि से अधिग्रहित एनारोबिक सूक्ष्मजीवों के संवर्धन के लिए स्वस्थानी सूचित नकली माध्यम प्रारूपों का एक सेट

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/66228
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 3, 1, 4, 1
1Department of Microbiology, Southern Illinois University Carbondale, 2MEDPREP, Southern Illinois University School of Medicine, 3Department of Geology, Southern Illinois University Carbondale, 4Department of Zoology, Southern Illinois University Carbondale

Summary

इस पत्र का फोकस एक पर्यावरण से प्राप्त तेज एनारोबिक सूक्ष्मजीवों के लिए मीडिया बनाने के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं का विस्तार करना है। ये विधियां एनारोबिक संस्कृतियों को प्रबंधित करने में मदद करती हैं और मायावी असंस्कृत सूक्ष्मजीवों, "माइक्रोबियल डार्क मैटर" के विकास का समर्थन करने के लिए लागू की जा सकती हैं।

Abstract

एनारोबिक सूक्ष्मजीवों का संस्कृति-निर्भर अनुसंधान पद्धतिगत क्षमता पर टिकी हुई है। इन विधियों को एनारोबिक सूक्ष्मजीवों के लिए उपयुक्त विकास की स्थिति (जैसे, पीएच और कार्बन स्रोत) बनाना और बनाए रखना चाहिए, जबकि कृत्रिम वातावरण से समझौता किए बिना नमूनों को निकालने की अनुमति भी देनी चाहिए। यह अंत करने के लिए, जिन तरीकों को सूचित किया जाता है और एक स्वस्थानी वातावरण में अनुकरण किया जाता है, उस वातावरण से सूक्ष्मजीवों को संवर्धित करने में बहुत सहायता कर सकते हैं। यहां, हम स्थलीय सतह और उपसतह सूक्ष्मजीवों के संवर्धन के लिए एक स्वस्थानी सूचित और नकली एनारोबिक विधि की रूपरेखा तैयार करते हैं, जो न्यूनतम गड़बड़ी के साथ एनारोबिक नमूना संग्रह पर जोर देते हैं। यह प्रोटोकॉल एक अनुकूलन योग्य एनारोबिक तरल माध्यम के उत्पादन, और पर्यावरण अधिग्रहण और एनारोबिक सूक्ष्मजीवों के इन विट्रो विकास का विवरण देता है। प्रोटोकॉल में पर्यावरणीय रूप से अधिग्रहित संस्कृतियों के लिए तलछट और एनारोबिक तरल मीडिया के पर्यावरणीय सिमुलेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले एनारोबिक बायोरिएक्टर के महत्वपूर्ण घटक भी शामिल हैं। हमने एक बायोरिएक्टर के जीवनकाल में एक बनाए रखा माइक्रोबायोम से प्रारंभिक अगली पीढ़ी के अनुक्रमण डेटा को शामिल किया है जहां सक्रिय संस्कृति एक प्रयोगात्मक कार्बन स्रोत के जवाब में गतिशील रूप से समायोजित होती है।

Introduction

अधिकांश सूक्ष्मजीव असंस्कृत रहते हैं; यह माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मनाया कोशिकाओं के बीच महान असमानता सफलतापूर्वक अगर प्लेटों का उपयोग कर सुसंस्कृत कुछ सूक्ष्मजीवों द्वारा विपरीत द्वारा समर्थित है. स्टैली और कोनोपका ने इस असमानता को "ग्रेट प्लेट काउंट एनोमली" 1 नाम दिया। अनुमानित बेहिसाब विविधता मेटागेनोमिक और मेटाट्रेनस्क्रिप्टोमिक डेटा द्वारा समर्थित है जो कई अलग-अलग वातावरणों से रैंक बहुतायत घटता में वितरित कई उपन्यास जेनेरा दिखारहा है 2. सूक्ष्मजीव जिन्हें देखा गया है (आमतौर पर एक माइक्रोबियल समुदाय के यादृच्छिक शॉटगन अनुक्रमण द्वारा) लेकिन सुसंस्कृत नहीं किया गया है उन्हें "माइक्रोबियल डार्क मैटर"3,4के रूप में संदर्भित किया गया है।

-ओमिक्स के युग में, जीनोमिक डेटा का पूरी तरह से मूल्यांकन करने और मौजूद जीन के कार्य/फेनोटाइप को सत्यापित करने के लिए सूक्ष्मजीवों का संवर्धन अनिवार्य है। सुसंस्कृत सूक्ष्मजीवों अनुक्रमण अभी भी इस तरह के पर्यावरण से शॉटगन metagenomics और metagenome-इकट्ठे जीनोम के रूप में प्रौद्योगिकियों के रूप में आत्मविश्वास से पूर्ण जीनोम प्राप्त करने के लिए एक ही रास्ता है स्वीकार्य अचूक5. सुसंस्कृत सूक्ष्मजीवों के साथ मिलकर जीनोमिक मूल्यांकन "माइक्रोबियल डार्क मैटर" को समझने के लिए मजबूत निष्कर्ष प्रदान करते हैं। "माइक्रोबियल डार्क मैटर" के कई सदस्य महत्वपूर्ण कार्य करते हैं जो पोषक तत्वों और अन्य तत्वों के चक्रण और मूल्यवान प्राकृतिक उत्पादों के उत्पादन को प्रभावित करते हैं, पारिस्थितिक प्रणालियों का समर्थन करते हैं, और पारिस्थितिक सेवाएं करते हैं। चिकित्सा परिप्रेक्ष्य से, वर्तमान में विपणन किए गए सभी फार्मास्यूटिकल्स में से लगभग आधे बैक्टीरिया से उत्पादों के उत्पाद और डेरिवेटिव हैं, और असंस्कृत प्रजातियों की रूपरेखा भविष्य के एंटीबायोटिक दवाओं को प्रकट करने का संदेह है। इस असंस्कृत बहुमत तक पहुंच प्राप्त करने के लिए, विभिन्न प्रकार के संवर्धन पद्धतियों को बढ़ाया जाना चाहिए6. "माइक्रोबियल डार्क मैटर" के सदस्यों में, एनारोबिक ओलिगोट्रोफिक सूक्ष्मजीवों को काफी हद तक कम रिपोर्ट किया जाता है और संभवतः पारिस्थितिक और औद्योगिक रूप से मूल्यवान जैव रासायनिक रास्ते7 पकड़ते हैं, जिससे उन्हें संवर्धन का महत्वपूर्ण लक्ष्य बना दिया जाता है। हालांकि, एनारोबिक ऑलिगोट्रोफिक सूक्ष्मजीव अक्सर आवश्यक लंबे समय तक इनक्यूबेशन समय, तेज स्थितियों (जैसे, इन विट्रो तापमान में विशेष गैर-मानक), और विशेष मीडिया व्यंजनों के उपयोग के कारण अपने एरोबिक और कॉपियोट्रोफिक समकक्षों की तुलना में संस्कृति के लिए अधिक कठिन होते हैं।

उपन्यास एनारोबिक ओलिगोट्रोफिक सूक्ष्मजीवों सहित "माइक्रोबियल डार्क मैटर" के संस्कृति सदस्यों के लिए वर्तमान विकासशील तकनीकों ने हमारी समझ में बहुत सुधार किया है और फ़ाइलोजेनेटिक पेड़ के भीतर इन सूक्ष्मजीवों के प्रतिनिधित्व में वृद्धि की है। उपन्यास सूक्ष्मजीवों के संवर्धन के लिए सूचित मीडिया का उपयोग करने वाली वर्तमान तकनीकों (यानी, मीडिया जो ब्याज के सूक्ष्मजीव के ज्ञान का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है) को तीन अलग-अलग तरीकों में विभाजित किया जा सकता है। विधियों में से पहला इन विट्रो विकास कक्ष में स्थानांतरण के लिए पर्यावरण के एक असतत खंड को सीधे हटाने पर जोर देता है जिसमें पहले से ही एक झिल्ली के भीतर ब्याज के सूक्ष्मजीव होते हैं। असतत खंड (जैसे, समुद्री जल) भू-रासायनिक निवास स्थान के साथ ब्याज के सूक्ष्मजीवों को प्रदान करने के लिए कार्य करता है जो वे सीटू में उपयोग करते हैं, जबकि झिल्ली कोशिकाओं के आंदोलन को गिरफ्तार करती है (ब्याज की कोशिकाएं भीतर रहेंगी; असतत खंड के साथ आने वाली बाहरी कोशिकाएं बिना रहेंगी)। सूक्ष्मजीवों को उनके प्राकृतिक आवास में लक्षित करने के लिए स्वाभाविक रूप से उपलब्ध यौगिकों को शामिल करके, ऐसे सूक्ष्मजीवों को सुसंस्कृत किया जा सकताहै। दूसरी विधि मेटाट्रेनस्क्रिप्टोमिक्स या जीनोमिक्स का उपयोग चयापचय क्षमताओं को स्पष्ट करने के लिए करती है, जो लक्षित माध्यम डिजाइन के लिए संकीर्ण संवर्धन मापदंडों को सुराग प्रदान करती है। यह दृष्टिकोण एक पर्यावरण-शारीरिक प्रोफ़ाइल प्रदान करता है जिसका उपयोग पर्यावरण से विशिष्ट प्रकार के सूक्ष्मजीवों के संवर्धन को लक्षित करने के लिए किया जा सकता है। माध्यम के प्रावधानों को मौजूद पहचाने गए जीनों के लिए तैयार किया जाता है जिन्हें संवर्धन विविधता, 9,10 को कम करने के लिए लक्षित सूक्ष्मजीव (ओं) का समर्थन करने के लिए माना जाता है। एक चेतावनी यह है कि जीनोमिक जानकारी सीधे जीन की अभिव्यक्ति का अनुमान नहीं लगाती है, जबकि ट्रांसक्रिप्टोमिक जानकारी करती है।

तीसरी विधि में पर्यावरण की दृष्टि से सूचित और सिम्युलेटेड मीडिया शामिल है, जो पहली विधि से अलग है, जो मीडिया का अनुकरण नहीं करता है, बल्कि मीडिया के स्रोत के रूप में पर्यावरण का उपयोग करता है। इस तीसरी विधि के लिए ब्याज के सूक्ष्मजीवों वाले क्षेत्र स्थल के भू-रसायन विज्ञान की पर्यावरणीय टोही की आवश्यकता होती है। इस ज्ञान के साथ, पर्यावरण की दृष्टि से सूचित सिम्युलेटेड माध्यम का उत्पादन करने के लिए प्राथमिक घटकों और भौतिक मापदंडों की पहचान की जाती है। माध्यम तब सूक्ष्मजीव युक्त तलछट या तरल का प्रत्यक्ष जलसेक प्राप्त करता है जो पर्यावरण से माध्यम में होता है। यह विधि उन मामलों में विशेष मूल्य की है जहां संवर्धन माइक्रोबायोलॉजिस्ट के पास पर्याप्त मात्रा में स्रोत पर्यावरण (पहली विधि के लिए आवश्यक) तक पहुंच नहीं है और न ही उपयुक्त मेटाट्रेनस्क्रिप्टोमिक या जीनोमिक डेटा (दूसरे के लिए आवश्यक) है।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल तीसरी विधि का एक उदाहरण है; यह द्वारा सूचित किया जाता है और इसका उद्देश्य रुचि के वातावरण का अनुकरण करना है। क्षेत्र में अधिग्रहित विभिन्न एनारोबिक सूक्ष्मजीव संस्कृतियों को लक्षित करने वाले तीन भोले मीडिया व्यंजनों को प्रोटोकॉल के भीतर समानांतर में प्रस्तुत किया जाता है। प्रतिनिधित्व की गई तीन संस्कृतियां मिट्टी से उत्पन्न मिश्रित संस्कृतियां हैं (इसके बाद, मिट्टी मिश्रित संस्कृति), एक बोरहोल (इसके बाद, बोरहोल मिश्रित संस्कृति) के भीतर से उत्पन्न मिश्रित संस्कृतियां, और एक बोरहोल के भीतर से उत्पन्न होने वाली एक पृथक मेथनोजेन (इसके बाद, बोरहोल पृथक मेथनोजेन)। यहां साझा किए गए मीडिया व्यंजनों में यौगिक पहचान और मात्रा एक शुरुआत गाइड के रूप में है; वे पाठक के पर्यावरण और रुचि के सूक्ष्मजीवों के लिए अनुकूलित होने में सक्षम और प्रोत्साहित होते हैं।

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Protocol

1. अनुकूलन योग्य एनारोबिक तरल माध्यम का उत्पादन

  1. संस्कृति की बोतलों के लिए माध्यम (500 एमएल का उत्पादन)
    1. मापें और यौगिकों को 1 एल की बोतल में जोड़ें और पाठक की रुचि की संस्कृति के अनुरूप तालिका 1 में कॉलम का उपयोग करके पीएच को समायोजित करें ( तालिका 1 में मात्रा 1,000 एमएल के उत्पादन के लिए दर्ज की गई है, तदनुसार समायोजित करें)। बोतल को घुमाकर यौगिकों को समरूपता में मिलाएं।
    2. 5-6 मिनट के लिए बोतल माइक्रोवेव द्वारा उबलते करने के लिए तरल गरम करें. माइक्रोवेव को अक्सर खोलें और गर्मी प्रतिरोधी दस्ताने का उपयोग करके तरल को धीरे से घुमाएं। माइक्रोवेव को जल्दी से खोलें यदि तरल बुदबुदाने के बाद भी चला जाता है; अन्यथा, तरल तेजी से फैल सकता है और बोतल को ओवरफ्लो कर सकता है।
    3. एन2 गैस कई गुना सेटअप के लिए एक बाँझ 10 एमएल ग्लास विंदुक संलग्न करें (बाल्च एट अल 11 के डिजाइन के आधार पर, हालांकि शुद्धता के एन2 गैस के लिए गर्म तांबे के स्तंभ की आवश्यकता नहीं है; अधिक गैस कई गुना जानकारी के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें)। ओ2 को वेंट करने के लिए मैनिफोल्ड खोलें और एन2 गैस को बाहर निकलने दें।
    4. विंदुक टिप को तरल में रखें और गैस के प्रवाह को समायोजित करें ताकि बुलबुले मध्यम जोरदार हों। तरल को N2 से तब तक फ्लश करें जब तक कि बोतल छूने के लिए बहुत गर्म न हो जाए।
      नोट: यह मीडिया की सामग्री पर निर्भर है लेकिन आम तौर पर ~ 20 मिनट लेता है।
    5. बोतल के ठंडा होने की प्रतीक्षा करते समय, 10 बाँझ 100 एमएल संस्कृति की बोतलें सेट करें; या यदि मिट्टी मिश्रित संस्कृति के संग्रह के लिए मीडिया तैयार कर रहे हैं, तो दो बाँझ 500 एमएल की बोतलें सेट करें।
    6. एक बार मीडिया बोतल स्पर्श करने के लिए ठंडा है, बोतल के headspace में विंदुक टिप खींचें. NaHCO3 का 0.125 ग्राम और Na2S∙9 H2O का 0.300 ग्राम जोड़ें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि रेज़ुरिन रंगहीन न हो जाए।
      चेतावनी: Na2S∙9 H2O संक्षारक, विषाक्त और एक अड़चन है। संपर्क के बाद धातु के औजारों को अच्छी तरह से संभालते समय व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग करें और कुल्ला करें।
    7. रंग बदलने के लिए रेज़ज़ुरिन की प्रतीक्षा करते समय, धातु प्रवेशनी को गैस मैनिफोल्ड सेटअप में संलग्न करें और प्रवेशनी युक्तियों को संस्कृति की बोतलों में रखें। बोतलों में एन2 के प्रवाह को मध्यम दर पर समायोजित करें, ताकि बाद के चरण में जोड़ा गया तरल गैस प्रवाह के कारण फिसल न जाए।
    8. एक बार रेज़ुरिन रंगहीन होने के बाद, प्रत्येक संस्कृति की बोतल में 50 एमएल तरल या प्रत्येक 500 एमएल बोतल में 250 एमएल तरल विभाज्य होता है।
    9. प्रवेशनी को हटाने के तुरंत बाद एक मिलान आकार रबर डाट के साथ प्रत्येक बोतल कैप. स्टॉपर को एल्युमिनियम सील (कल्चर बोतलों के लिए) या GL45 ओपन-टॉप स्क्रू कैप (500 एमएल बोतलों के लिए) से सुरक्षित करें।
    10. बोतलों को एक ऑटोक्लेवबल बिन में रखें और बिन को नल के पानी से तब तक भरें जब तक कि पानी का स्तर बोतलों में मेल न खाए।
      नोट: यह सुनिश्चित करेगा कि आटोक्लेविंग करते समय कांच पर तापमान अंतर के कारण तनाव के कारण बोतलें फटती नहीं हैं।
    11. 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर बोतलों को आटोक्लेव करें।
  2. बायोरिएक्टर के लिए माध्यम (8 एल का उत्पादन)
    1. कारबॉय की तैयारी
      1. 1/4" (6.4 मिमी) नली बार्ब बॉल वाल्व का वाल्व खोलें। नली बार्ब बॉल वाल्व के दोनों छोर पर 1/4 "(6.4 मिमी) आंतरिक व्यास (आईडी) और 1/2" (12.7 मिमी) बाहरी व्यास (ओडी) सिलिकॉन टयूबिंग की दो 6 सेमी लंबाई संलग्न करें।
      2. असेंबली के एक छोर पर 5/16"-1/4" (7.9 मिमी-6.4 मिमी) नली बार्ब एडेप्टर फिटिंग संलग्न करें। विधानसभा के दूसरे छोर को 8 एल कार्बोय की नली बार्ब में संलग्न करें।
      3. कार्बोय की नली बार्ब और टयूबिंग के बीच कनेक्शन को सुरक्षित करने के लिए एक ज़िप टाई का उपयोग करें, और नली बार्ब एडाप्टर फिटिंग और टयूबिंग के बीच कनेक्शन।
      4. 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर विधानसभा के साथ carboy आटोक्लेव.
    2. मध्यम उत्पादन
      1. 8 एल कार्बोय असेंबली पर नली बार्ब बॉल वाल्व के वाल्व को बंद करें।
      2. 8 एल कार्बोय को मापें और यौगिकों को जोड़ें और पाठक की रुचि की संस्कृति के अनुरूप तालिका 1 में कॉलम का उपयोग करके पीएच को समायोजित करें ( तालिका 1 में मात्रा 1,000 एमएल के उत्पादन के लिए दर्ज की गई है, तदनुसार समायोजित करें)। एक हलचल पट्टी जोड़ें और यौगिकों को एकरूपता में मिलाने के लिए एक सरगर्मी गर्म प्लेट का उपयोग करें।
      3. सरगर्मी गर्म प्लेट के साथ उबलने के लिए तरल गरम करें। तरल को 30 मिनट तक उबलने दें।
        नोट: उबलते करने के लिए तरल हीटिंग मीडिया की सामग्री पर निर्भर है, लेकिन 2-3 घंटे लग सकते हैं.
      4. एन2 गैस कई गुना सेटअप के लिए एक बाँझ 10 एमएल ग्लास विंदुक संलग्न करें (बाल्च एट अल 11 के डिजाइन के आधार पर, हालांकि शुद्धता के एन2 गैस के लिए गर्म तांबे के स्तंभ की आवश्यकता नहीं है; अधिक गैस कई गुना जानकारी के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें)। ओ2 को वेंट करने के लिए मैनिफोल्ड खोलें और एन2 गैस को बाहर निकलने दें।
      5. गर्मी बंद करें, फिर विंदुक टिप को तरल में रखें, और गैस के प्रवाह को समायोजित करें ताकि बुलबुले मध्यम जोरदार हों लेकिन अतिप्रवाह न हों। 30 मिनट के लिए एन2 के साथ तरल फ्लश.
      6. विंदुक टिप carboy के headspace में ऊपर खींचो. NaHCO3 का 2.0 ग्राम और Na2S∙9 H2O का 4.8 ग्राम जोड़ें, और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि रेज़ुरिन रंगहीन न हो जाए।
        चेतावनी: Na2S∙9 H2O संक्षारक, विषाक्त और एक अड़चन है। संपर्क के बाद धातु के औजारों को अच्छी तरह से संभालते समय व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग करें और कुल्ला करें।
      7. एक बार resazurin रंगहीन है, कांच विंदुक हटा दें और तुरंत एक # 10 डाट के साथ carboy टोपी. स्टॉपर को सुरक्षित करने के लिए स्टॉपर के ऊपर और कारबॉय के होंठ के चारों ओर एक तार घुमाएं।

2. पर्यावरण अवायवीय सूक्ष्मजीवों के स्वस्थानी अधिग्रहण में

  1. सतह अवायवीय नमूना अधिग्रहण (मिट्टी मिश्रित संस्कृति)
    1. मिश्रित मृदा संस्कृति मीडिया की बोतलों को ऊपर और एक कोरर के रूप में खेत में लाएं।
      नोट: एक Giddings 2 5/8 "मानक शंकु मिट्टी बिट लेखकों (सामग्री की तालिका) द्वारा प्रयोग किया जाता है। हालांकि, किसी भी मिट्टी कोरर या ट्रॉवेल का उपयोग किया जा सकता है जो वांछित गहराई तक नमूना ले सकता है।
    2. कोरर को तलछट में तब तक पुश (ढेर/हिस्सेदारी ड्राइव) करें जब तक कि नमूना संग्रह सिलेंडर का शीर्ष तलछट की सतह के साथ फ्लश न हो जाए।
    3. कोर को मुक्त करने के लिए कोरर को 90° मोड़ें और तब तक ऊपर की ओर खींचें जब तक कि नमूना पर्यावरण से न निकाला जाए।
    4. ढीले तलछट में (जैसे कि आर्द्रभूमि का नमूना लेते समय क्या सामना किया जा सकता है), कोर के आधार को एक नए नाइट्राइल दस्ताने वाले हाथ से ढक दें क्योंकि इसे नमूना को बाहर गिरने या निष्कर्षण पर पानी में फैलने से रोकने के लिए निकाला जा रहा है।
    5. कोर के आधार से 6-7 सेमी ऊपर आंख से जल्दी से अनुमानित। कोर में टुकड़ा करने के लिए एक नए नाइट्राइल दस्ताने वाले हाथ का उपयोग करें और नीचे 6-7 सेमी अलग करें।
    6. कोर के निचले हिस्से को तुरंत कल्चर बोतल में स्थानांतरित करें। यदि मिट्टी/तलछट बहुत बड़ी है, तो जल्दी से इसे बोतल में आसानी से फिट करने के लिए बनाएं, जितना संभव हो उतना एरोबिक वातावरण के संपर्क को कम करें।
    7. एक बार नमूना स्थानांतरित हो जाने के बाद, तुरंत डाट को बदल दें और इसे स्क्रू कैप के साथ जगह पर रखें।
    8. नमूना ठंडा रखें। प्रयोगशाला में लौटने पर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रह बोतल को रेफ्रिजरेट करें।
  2. उपसतह अवायवीय नमूना अधिग्रहण (बोरहोल मिश्रित संस्कृति)
    1. गैस कई गुना द्वारा एक बाँझ 1 एल बोतल बाहर सेट. बोतल को रबर स्टॉपर से ढक दें। डाट पर 100% इथेनॉल ड्रिप करें और लाइटर का उपयोग करके आग लगा दें।
    2. एन2 गैस कई गुना सेटअप करने के लिए एक बाँझ 2 जी सुई संलग्न करें. ओ2 को वेंट करने के लिए कई गुना खोलें और एन2 (या एआर) गैस को मध्यम दर से बाहर निकलने दें।
    3. एक बार जब स्टॉपर में आग न लगे, तो सुई को बोतल में डालें। एक दूसरी बाँझ 23 जी सुई गैस कई गुना बोतल में संलग्न नहीं डालें. 1-2 मिनट के लिए बोतल फ्लश.
    4. गैस मैनिफोल्ड से जुड़ी सुई को निकालें। 1 मिनट के लिए बोतल दबाया. शेष सुई निकालें।
    5. दबाव वाली बोतल और एक निष्फल 23 जी सुई को बोरहोल साइट पर लाएं। मेरिनो एट अल12के तरीकों के बाद बोरहोल से तरल ड्रा करें।
      नोट: बोरहोल की विधि, कनेक्शन और प्रवाह दर के आधार पर, यह पानी का नमूना प्राप्त करने की रणनीति को बदलता है। यदि पानी का निरंतर प्रवाह होता है, तो चरण 2.2.6 में उल्लिखित पानी इकट्ठा करना। पर्याप्त होगा। यदि पानी का प्रवाह बैच एकत्र किया जाता है या कम प्रवाह होता है, तो एक वैकल्पिक इनलेट/आउटलेट विधि का उपयोग किया जा सकता है। सभी स्थितियों में, संदूषण को कम करें, और यह सुनिश्चित करने का प्रयास करें कि एकत्र किया गया नमूना नमूना के लिए वांछित पर्यावरण का प्रतिनिधि है। यह एक व्यापक रूप से सामान्यीकृत कथन है क्योंकि यह लेखकों का अनुभव रहा है कि सरकारी या निजी साइटों से प्रत्येक नमूना संग्रह घटना को उपलब्ध पहुंच के लिए अत्यधिक अनुकूल होना था।
    6. जल्दी से बोतल खोलें, बोतल को पूरी तरह से भरने के लिए तरल में पंप करें, और बोतल को बंद करें।
    7. बोतल में दबाव को कम करने के लिए बोतल के रबर स्टॉपर में साइट के साथ लाया गया था कि 23 जी सुई डालें. सुई निकालें।
    8. नमूना ठंडा रखें। प्रयोगशाला में लौटने पर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रह बोतल को रेफ्रिजरेट करें।

3. क्षेत्र में अधिग्रहित अवायवीय सूक्ष्मजीवों की इन विट्रो वृद्धि

  1. संस्कृति बोतल द्वारा विकास
    1. एन2 की एक स्टॉपर्ड बाँझ बोतल और ऊपर के रूप में तैयार संस्कृति की बोतलें और संग्रह की बोतल सेट करें। स्टॉपर्स पर 100% इथेनॉल ड्रिप करें और लाइटर का उपयोग करके उन्हें आग लगा दें।
    2. एक 1 एमएल सिरिंज पर एक 23 जी सुई इकट्ठा. एक बार स्टॉपर्स अब आग पर नहीं हैं, एन2 बोतल में सुई डालें और एन2 के ~ 1 एमएल खींचें। सुई निकालें।
    3. एन2 को छोड़ने के लिए प्लंजर पर धीरे-धीरे दबाएं। जैसे ही सिरिंज खाली है, संग्रह बोतल में सुई डालें और पर्यावरण के नमूने के 0.5 एमएल आकर्षित. सुई निकालें।
    4. संस्कृति की बोतल में सुई डालें और नमूना इंजेक्षन. सुई निकालें।
    5. बोतल भंवर और तापमान पर एक इनक्यूबेटर में जगह है, के रूप में तालिका 1 या ब्याज की पाठक के वातावरण द्वारा सूचित किया है.
      नोट: संस्कृति प्रगति (या तो बोतल या बायोरिएक्टर) की निगरानी 0.02 मिमी गहरी पेट्रोफ-हॉसर हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके की जाती है। एनारोबिक या फास्टिड सूक्ष्मजीवों के संवर्धन आमतौर पर सेल घनत्व तक नहीं पहुंचते हैं जहां ओडी600 प्रयोग करने योग्य है, और अन्य पता लगाने के तरीके नियमित और दोहराव निगरानी के लिए अव्यावहारिक हैं। पता लगाने की सीमा, गुणवत्ता नियंत्रण, और सांख्यिकीय गणना सेल गिनती कक्ष के प्रकार और उपयोगकर्ता की जरूरतों पर निर्भर हैं.
  2. बायोरिएक्टर द्वारा विकास
    1. एक संशोधित सिरिंज के साथ एक गुब्बारा तैयार करना
      1. तीन 10 एमएल luer ताला सीरिंज (प्रत्येक अंतिम विधानसभा के लिए एक) से सवार निकालें. प्रत्येक सिरिंज से निकला हुआ किनारा काट लें और कटे हुए अंत को फाइल करें ताकि यह गुब्बारे को छेद न दे। संशोधित सिरिंज से बाहर सभी दायर चिप्स साफ.
      2. एक गुब्बारे को दूसरे के अंदर रखकर एक दोगुना गुब्बारा तैयार कीजिए।
      3. संशोधित 10 एमएल सिरिंज पर दोगुना गुब्बारे के अंत खिंचाव.
      4. बाहरी गुब्बारे के सिरे को भीतरी गुब्बारे से थोड़ा अलग करें। गुब्बारों के बीच फंसी सारी हवा को निचोड़ लें।
      5. गुब्बारे के आधार के चारों ओर एक ज़िप टाई कस सिरिंज के लिए गुब्बारे सुरक्षित.
    2. एक संशोधित डाट की तैयारी
      1. दस 1 एमएल luer ताला सीरिंज (प्रत्येक डाट संशोधित किया जा करने के लिए के लिए दो) से सवार निकालें. सीरिंज से निकला हुआ किनारा काट लें।
      2. दो रबर स्टॉपर्स आकार # 10 (8 एल कार्बोय के लिए) और GL45 थ्रेड फिनिश (कैच बोतलों के लिए) वाली बोतलों के लिए तीन आकार सेट करें। 1/4" (6.4 मिमी) ड्रिल बिट का उपयोग करके, प्रत्येक रबर स्टॉपर के शीर्ष के माध्यम से दो छेद ड्रिल करें जो संशोधित सीरिंज के लिए फिट होने के लिए पर्याप्त चौड़ा हो और फिट होने के लिए पर्याप्त संकीर्ण हो।
      3. रबर डाट के छेद के माध्यम से संशोधित सीरिंज डालें.
      4. 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर संशोधित डाट को साफ और आटोक्लेव करें।
    3. बायोरिएक्टर असेंबली की तैयारी
      1. 70% इथेनॉल सभी स्टॉपकॉक, महिला लुअर लॉक एडाप्टर कनेक्टर, और अन्य गैर-ऑटोक्लेवबल बायोरिएक्टर सामग्री के साथ कीटाणुरहित, और 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव सभी टयूबिंग (लंबाई में काटने के बाद), स्टॉपर्स, ग्लास ऊन, और अन्य ऑटोक्लेवबल बायोरिएक्टर सामग्री।
      2. एक अंगूठी स्टैंड पर एक बाँझ बायोरिएक्टर (चित्रा 1 और चित्रा 2) सेट करें और इसे एक श्रृंखला पट्टा के साथ सुरक्षित करें। इसके अलावा एक पानी स्नान, एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप, मध्यम युक्त 8 एल कार्बोय (प्रोटोकॉल चरण 1.2 से), एक 3.5 एल बोतल (गैर नमूना पकड़ बोतल), और एक 500 एमएल बोतल (नमूना पकड़ बोतल) बाहर सेट.
      3. कारबॉय को रोकना
        1. एक संशोधित सिरिंज के साथ एक गुब्बारा सेट करें। सिरिंज के luer ताला टिप करने के लिए एक तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी कनेक्ट करें.
        2. गुब्बारा विधानसभा ले लो और एन2 के एक टैंक की टयूबिंग के लिए तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी कनेक्ट. वायुमंडल के लिए खुले छोर को अवरुद्ध करने के लिए तीन-तरफा स्टॉपकॉक को चालू करें।
        3. गैस टैंक खोलें और गुब्बारे को N2 से भरें। एक बार पूर्ण होने पर, गुब्बारे के अंत को अवरुद्ध करने के लिए तीन-तरफा स्टॉपकॉक को चालू करें। गैस टैंक बंद करें और तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी से टैंक टयूबिंग डिस्कनेक्ट.
        4. अनुक्रम में निम्नलिखित कनेक्ट करें: एक तीन-तरफा स्टॉपकॉक (संशोधित सिरिंज के साथ गुब्बारे का), एक दो-तरफा स्टॉपकॉक, एक महिला लुअर लॉक एडाप्टर कपलर, और संशोधित स्टॉपर की सीरिंज में से एक का लुअर लॉक टिप।
        5. अन्य सिरिंज के luer ताला टिप करने के लिए, एक दो तरह पानी निकलने की टोंटी कनेक्ट. संशोधित डाट विधानसभा पर दो तरह से पानी निकलने की टोंटी के दोनों वाल्व बंद करें.
        6. कारबॉय के अनमॉडिफाइड साइज #10 स्टॉपर को पकड़े हुए तार को अनट्विस्ट करें। संशोधित स्टॉपर असेंबली के साथ अनमॉडिफाइड स्टॉपर को जल्दी से बदलें और संशोधित स्टॉपर असेंबली को कारबॉय को सुरक्षित करने के लिए तार को पहले की तरह मोड़ें।
          नोट: यदि आत्मविश्वास और तैयार है, तो संशोधित स्टॉपर असेंबली का उपयोग मध्यम तैयारी के अंतिम चरण (चरण 1.2.2.7) में कार्बोय को रोकने के लिए किया जा सकता है।
        7. वायुमंडल के लिए खुले छोर को अवरुद्ध करने के लिए तीन-तरफा स्टॉपकॉक को चालू करें। अनुक्रम में दो तरह पानी निकलने की टोंटी खोलें. गुब्बारे की गैस और 8 एल कारबॉय का हेडस्पेस अब जुड़ा हुआ है।
      4. गैर-नमूनाकरण और नमूनाकरण कैच बोतलों को रोकना
        1. GL45 थ्रेड फिनिश वाली बोतलों के लिए संशोधित स्टॉपर आकार के साथ 3.5 L गैर-सैंपलिंग कैच बोतल को स्टॉपर करें, बोतल में फिट करने में मदद करने के लिए स्टॉपर के आधार पर 70% इथेनॉल लागू करें। GL45 ओपन-टॉप स्क्रू कैप के साथ बोतल को कैप करें।
        2. अनुक्रम में निम्नलिखित कनेक्ट करें: संशोधित सिरिंज के luer लॉक टिप के साथ एक गुब्बारा, एक तीन-तरफा स्टॉपकॉक, एक महिला luer लॉक एडाप्टर कपलर, और संशोधित स्टॉपर की सीरिंज में से एक का luer लॉक टिप। वायुमंडल के लिए सीधे खुले अंत बंद ब्लॉक करने के लिए तीन तरह पानी निकलने की टोंटी मुड़ें.
        3. अन्य सिरिंज के luer ताला टिप करने के लिए, एक महिला luer ताला एडाप्टर युग्मक कनेक्ट.
        4. 500 एमएल नमूना पकड़ बोतल के लिए उपरोक्त तीन चरणों को दोहराएं।
      5. टयूबिंग का सेटअप
        1. बायोरिएक्टर वॉटर जैकेट पोर्ट और वाटर बाथ होज़ बार्ब्स के बीच की दूरी को मापें। इस दूरी को फैलाने के लिए 3/16" (4.8 मिमी) आईडी, 3/8" (9.5 मिमी) आयुध डिपो सिलिकॉन टयूबिंग की दो लंबाई काटें।
        2. GL14 ओपन-टॉप स्क्रू कैप के साथ दो सीधे नली कनेक्टर इकट्ठा करें। दो टयूबिंग टुकड़े के एक छोर के लिए प्रत्येक संलग्न करते हैं.
        3. बायोरिएक्टर वॉटर जैकेट के बंदरगाहों पर स्क्रू कैप को मोड़ें। टयूबिंग के दूसरे सिरों को पानी के स्नान नली बार्ब्स से संलग्न करें ताकि पानी पानी के स्नान से बाहर निकल जाए, बायोरिएक्टर वॉटर जैकेट के नीचे प्रवेश करें, वॉटर जैकेट के शीर्ष पर बाहर निकलें, और पानी के स्नान पर वापस आ जाएं। टयूबिंग के सिरों के आसपास ज़िप संबंधों कस पानी स्नान नली barbs के लिए टयूबिंग सुरक्षित करने के लिए.
        4. VWR अल्ट्रा लो फ्लो वेरिएबल फ्लो मिनी-पंप के समान पंपों के लिए, पंप के माध्यम से 3/16" (4.8 मिमी) OD स्लॉटेड टयूबिंग असेंबली को थ्रेड करें।
        5. carboy टयूबिंग विधानसभा और क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप टयूबिंग विधानसभा के बीच की दूरी को मापें. इस दूरी को फैलाने के लिए 3/16" (4.8 मिमी) आईडी, 3/8" (9.5 मिमी) आयुध डिपो सिलिकॉन टयूबिंग की लंबाई काटें।
        6. टयूबिंग के एक छोर को कारबॉय टयूबिंग असेंबली की नली बार्ब में और दूसरे को पेरिस्टाल्टिक पंप टयूबिंग असेंबली के नली बार्ब में संलग्न करें, ताकि माध्यम कार्बोय से और पेरिस्टाल्टिक पंप के माध्यम से बह जाए।
        7. पेरिस्टाल्टिक पंप टयूबिंग विधानसभा और बायोरिएक्टर के नीचे बंदरगाह के बीच की दूरी को मापें। इस दूरी को फैलाने के लिए 3/16" (4.8 मिमी) आईडी, 3/8" (9.5 मिमी) आयुध डिपो सिलिकॉन टयूबिंग की लंबाई काटें।
        8. इस टयूबिंग के एक छोर को पेरिस्टाल्टिक पंप टयूबिंग असेंबली के नली बार्ब में संलग्न करें और ध्यान से दूसरे को बायोरिएक्टर के निचले बंदरगाह से संलग्न करें। कांच दरार नहीं है, लेकिन यह भी कनेक्शन सुरक्षित करने के लिए ख्याल रखते हुए, बायोरिएक्टर के नीचे बंदरगाह के लिए टयूबिंग सुरक्षित करने के लिए टयूबिंग के अंत के आसपास एक ज़िप टाई कस.
        9. लगभग 5" (127mm) लंबाई 3/16" (4.8 मिमी) ID, 3/8" (9.5 मिमी) OD सिलिकॉन टयूबिंग को मापें और काटें।
        10. एक महिला luer लॉक एडाप्टर कनेक्टर को तीन-तरफ़ा स्टॉपकॉक में संलग्न करें। टयूबिंग के लिए तीन तरह पानी निकलने की टोंटी के किसी भी छोर संलग्न करते हैं.
        11. GL14 ओपन-टॉप स्क्रू कैप के साथ एक एंगल्ड होज़ कनेक्टर को इकट्ठा करें। टयूबिंग के दूसरे छोर के लिए यह संलग्न.
        12. बायोरिएक्टर के सबसे ऊपरी ऊर्ध्वाधर बंदरगाह पर स्क्रू कैप को मोड़ें। बायोरिएक्टर की ओर इशारा करते हुए अंत को अवरुद्ध करने के लिए तीन-तरफा पानी निकलने की टोंटी को चालू करें।
        13. सबसे ऊपरी ऊर्ध्वाधर पोर्ट असेंबली और गैर-सैंपलिंग कैच बोतल असेंबली के बीच की दूरी को मापें। इस दूरी को फैलाने के लिए 3/16" (4.8 मिमी) आईडी, 3/8" (9.5 मिमी) आयुध डिपो सिलिकॉन टयूबिंग की लंबाई काटें। दो 1 एमएल luer ताला सीरिंज बंद flanges काटें और टयूबिंग के सिरों में उन्हें डालने.
        14. इस टयूबिंग असेंबली के एक छोर को सबसे ऊपरी ऊर्ध्वाधर पोर्ट असेंबली के तीन-तरफ़ा स्टॉपकॉक में संलग्न करें और दूसरे छोर को गैर-नमूनाकरण कैच बोतल असेंबली पर महिला लुएर लॉक एडाप्टर कनेक्टर से जोड़ दें।
        15. सबसे ऊपरी ऊर्ध्वाधर बंदरगाह विधानसभा और नमूना पकड़ बोतल विधानसभा के बीच की दूरी को मापें। इस दूरी को फैलाने के लिए 3/16" (4.8 मिमी) आईडी, 3/8" (9.5 मिमी) आयुध डिपो सिलिकॉन टयूबिंग की लंबाई काटें। दो 1 एमएल luer ताला सीरिंज बंद flanges काटें और टयूबिंग के सिरों में उन्हें डालने.
        16. इस टयूबिंग असेंबली के एक छोर को सबसे ऊपरी ऊर्ध्वाधर पोर्ट असेंबली के तीन-तरफ़ा स्टॉपकॉक में संलग्न करें और दूसरे को सैंपलिंग कैच बोतल असेंबली पर महिला लुअर लॉक एडाप्टर कनेक्टर से जोड़ दें।
    4. बायोरिएक्टर भरना
      1. एक सफेद रबर सेप्टम के साथ बायोरिएक्टर के GL18 बंदरगाहों में से एक को कैप करें। अन्य GL18 पोर्ट और GL18/GL14 आकार के PTFE के साथ शेष ऊर्ध्वाधर उजागर GL14 पोर्ट को सिलिकॉन सेप्टा (PTFE ग्लास का सामना करना पड़ रहा है) और ओपन टॉप स्क्रू कैप के साथ कैप करें।
      2. 50 सेमी लंबाई की छड़ के साथ, बायोरिएक्टर के आधार में 0.9 ग्राम ग्लास ऊन पैक करें।
      3. 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर रेत के आटोक्लेव 1.3 एल। एक फ़नल का उपयोग करके बायोरिएक्टर को रेत से भरें।
        नोट: पाठक के पर्यावरण और ब्याज के सूक्ष्मजीवों द्वारा सूचित अन्य तलछट प्रकारों को यहां प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
      4. बायोरिएक्टर के शीर्ष में एन2 के एक टैंक के लिए टयूबिंग प्लेस और 2 मिनट के लिए एन2 के साथ बायोरिएक्टर हेडस्पेस फ्लश. बायोरिएक्टर को #7-आकार के स्टॉपर और GL45 ओपन-टॉप स्क्रू कैप के साथ तुरंत कैप करें।
      5. गैर नमूना पकड़ बोतल से, टयूबिंग डिस्कनेक्ट और गुब्बारे की ओर इशारा करते हुए अंत बंद ब्लॉक करने के लिए तीन तरह पानी निकलने की टोंटी बारी. टयूबिंग को एन2 के टैंक से महिला लुअर लॉक एडाप्टर कनेक्टर से कनेक्ट करें और बायोरिएक्टर हेडस्पेस को 2 मिनट के लिए एन2 के साथ फ्लश करें। तुरंत टयूबिंग को फिर से कनेक्ट करें और वायुमंडल के लिए खुले अंत को अवरुद्ध करने के लिए तीन-तरफा स्टॉपकॉक लौटाएं।
      6. नमूना पकड़ने की बोतल के लिए उपरोक्त चरण को दोहराएं।
      7. नमूना पकड़ने की बोतल की ओर इशारा करते हुए अंत को अवरुद्ध करने के लिए बायोरिएक्टर के सबसे ऊपरी ऊर्ध्वाधर बंदरगाह के तीन-तरफा स्टॉपकॉक को चालू करें। बायोरिएक्टर में कारबॉय से तरल पंप करें। पंप को रोकें, और सैंपलिंग बोतल के गुब्बारे को वेंट करें, और आवश्यकतानुसार एन2 के साथ कार्बोय के गुब्बारे को भरें।
      8. एक बार बायोरिएक्टर माध्यम से भर गया है, पंप प्रवाह दर 0.6 एमएल / मिनट (मिनी पंप पर 40 के डिजिटल मूल्य) के लिए सेट.
        नोट: अन्य पाठक-वांछित प्रवाह दरों को यहां प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
      9. पानी के स्नान का तापमान निर्धारित करें, जैसा कि तालिका 1 या पाठक के हित के वातावरण द्वारा सूचित किया गया है।
        नोट: अध्ययन की बारीकियों के आधार पर इस बिंदु पर या बाद में इनोकुलम जोड़ा जा सकता है। यदि इस बिंदु पर टीका लगाया जा रहा है, तो चरण 3.2.4.10 पर आगे बढ़ें। यदि बाद में टीका लगाया जा रहा है, तो चरण 3.2.5 पर आगे बढ़ें।
      10. एक संग्रह बोतल या टीका संस्कृति की बोतल और एन2 की एक बंद बाँझ बोतल सेट करें। स्टॉपर्स पर 100% इथेनॉल ड्रिप करें और लाइटर का उपयोग करके उन्हें आग लगा दें।
      11. एक 60 एमएल सिरिंज पर एक 23 जी सुई इकट्ठा. एक बार स्टॉपर्स अब आग पर नहीं हैं, एन2 बोतल में सुई डालें और एन2 के ~ 50 एमएल आकर्षित. सुई निकालें।
      12. एन2 को छोड़ने के लिए प्लंजर पर धीरे-धीरे दबाएं। जैसे ही सिरिंज खाली है, संग्रह की बोतल में सुई डालें और पर्यावरण के नमूने के 50 एमएल आकर्षित. सुई निकालें।
      13. एक बाँझ लंबी धातु सुई (प्रवेशनी, लंबाई 31.5 सेमी) के लिए 23 जी सुई का आदान-प्रदान। बायोरिएक्टर के GL18 पोर्ट पर सफेद रबर सेप्टम के माध्यम से लंबी धातु की सुई डालें।
      14. तलछट में सुई पुश और inoculum इंजेक्षन. सुई निकालें।
    5. बायोरिएक्टर रखरखाव चलाना
      1. प्रत्येक दिन जब बायोरिएक्टर चल रहा है, तो निम्नलिखित कार्य करें:
        1. पानी के स्नान के स्तर की जाँच करें। यदि कम है, तो अधिक पानी जोड़ें (जंग और खनिज बिल्डअप को कम करके उपकरण दीर्घायु के लिए आसुत जल का उपयोग करें)।
        2. गैर-नमूना पकड़ने की बोतल के गुब्बारे की जाँच करें; एक पूर्ण गुब्बारा माध्यम के प्रवाह को बाधित करेगा। जब पूर्ण, कैच बोतल की ओर इशारा करते हुए अंत को अवरुद्ध करने के लिए तीन-तरफा स्टॉपकॉक को चालू करें। इसे खाली करने के लिए गुब्बारे को निचोड़ें; फिर, वायुमंडल के लिए खुले छोर को अवरुद्ध करने के लिए तीन-तरफा स्टॉपकॉक लौटाएं; गुब्बारा खाली होने तक दोहराएं।
        3. 8 एल कार्बोय के गुब्बारे की जाँच करें। यदि कम है, तो अनुक्रम में दो-तरफा स्टॉपकॉक को बंद करें और दो-तरफा स्टॉपकॉक से तीन-तरफा स्टॉपकॉक को डिस्कनेक्ट करें। चरण 3.2.3.3.2, 3.2.3.3.3, और 3.2.3.3.7 के बाद बैलून असेंबली को फिर से भरें और फिर से लगाएं।
        4. 8 एल कार्बोय में माध्यम के स्तर की जाँच करें। यदि कम है, तो एक और 8 एल कार्बोय इकट्ठा करें और प्रोटोकॉल चरण 1.2 के बाद अधिक माध्यम तैयार करें। और 3.2.3.3। पंप को रोकें, नली बार्ब बॉल वाल्व को बंद करें, पुराने कार्बोय को जल्दी से डिस्कनेक्ट करें, और नए कार्बोय को कनेक्ट करें।
          नोट: 0.6 एमएल/मिनट की प्रवाह दर के लिए, हर 9 दिनों में नए माध्यम की आवश्यकता होगी।
        5. गैर-नमूना पकड़ने की बोतल में माध्यम के स्तर की जाँच करें। यदि पूर्ण है, तो चरण 3.2.3.4.1 के अनुसार एक और गैर-नमूना कैच बोतल इकट्ठा करें। एन2 के साथ नई बोतल फ्लश, जल्दी से पुरानी बोतल से संशोधित सिरिंज और टयूबिंग के साथ गुब्बारे डिस्कनेक्ट, और नई बोतल से कनेक्ट.
        6. संशोधित स्टॉपर को पूर्ण गैर-सैंपलिंग कैच बोतल से निकालें। 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर तरल आटोक्लेव; फिर, पाठक की संस्थागत नीतियों के अनुसार तरल का निपटान करें। अगले उपयोग के लिए उन्हें तैयार करने के लिए गैर-नमूनाकरण कैच बोतल असेंबली के सभी टुकड़ों को साफ और आटोक्लेव करें।
      2. निम्न कार्य करके हर 7 (या पाठक-वांछित संख्या) दिनों में नमूना लें:
        1. गैर-नमूनाकरण कैच बोतल की ओर इशारा करते हुए अंत को अवरुद्ध करने के लिए बायोरिएक्टर के सबसे ऊपरी ऊर्ध्वाधर बंदरगाह के तीन-तरफा स्टॉपकॉक को चालू करें। 250 एमएल तरल लीजिए।
          नोट: 0.6 एमएल / मिनट की प्रवाह दर के लिए, 250 एमएल इकट्ठा ~ 7 घंटे लगेगा।
        2. नमूना पकड़ने की बोतल की ओर इशारा करते हुए अंत को अवरुद्ध करने के लिए बायोरिएक्टर के सबसे ऊपरी ऊर्ध्वाधर बंदरगाह के तीन-तरफा स्टॉपकॉक को लौटाएं। बायोरिएक्टर के सबसे ऊपरी ऊर्ध्वाधर बंदरगाह के तीन-तरफा स्टॉपकॉक से टयूबिंग और सैंपलिंग कैच बोतल को डिस्कनेक्ट करें।
        3. परीक्षण, भंडारण, और/या नमूना तरल के उचित निपटान के बाद, संशोधित सिरिंज के साथ गुब्बारे को छोड़कर नमूना पकड़ बोतल विधानसभा के सभी टुकड़े साफ. संशोधित सिरिंज और महिला लुअर लॉक एडाप्टर कनेक्टर के साथ गुब्बारे को छोड़कर 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर सभी टुकड़ों को आटोक्लेव करें। अगले नमूने के दिन के लिए फिर से इकट्ठा करें।
          नोट: यदि आवश्यक हो तो तेजी से मरम्मत और प्रतिस्थापन के लिए भागों, कैप्स, टयूबिंग और सेप्टा के डुप्लिकेट या ट्रिपल अतिरेक की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।

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Representative Results

यहां हम एक बोरहोल मिश्रित संस्कृति मध्यम तैयारी विधि और एक बायोरिएक्टर सेटअप विधि का उपयोग करके बायोरिएक्टर अध्ययन से परिणाम दिखाते हैं जैसा कि यहां वर्णित है। बोरहोल मिश्रित संस्कृति माध्यम को कार्बन स्रोत के रूप में ऑक्सीडेटिव हाइड्रोथर्मल विघटन (ओएचडी)13,14द्वारा संसाधित मकई के गोले के घोल के रूप में शामिल करने के लिए संशोधित किया गया था। संशोधित बोरहोल मिश्रित संस्कृति माध्यम 0.4 एमएल / मिनट की दर से 44 दिनों के लिए बायोरिएक्टर में पंप किया गया था। 23 दिन, संयुक्त राज्य अमेरिका के नेवादा के डेथ वैली क्षेत्र में बोरहोल बीएलएम -1 से प्राप्त एक इनोकुलम को15 जोड़ा गया था। बायोरिएक्टर से तरल नमूने 1, 8, 15, 22, 23 (टीकाकरण के बाद), 30, 37 और 44 दिनों में एक नमूना पकड़ने की बोतल में एकत्र किए गए थे।

इनोकुलम संस्कृति (और बायोरिएक्टर तलछट के पूर्व-इनोकुलम आटोक्लेव-जीवित निवासियों) की सामान्य स्थिति को ट्रैक करने के लिए, बायोरिएक्टर तरल नमूने प्रत्यक्ष सेल काउंट द्वारा देखे गए थे। नमूना तरल के प्रत्यक्ष सेल मायने रखता है एक Petroff-Hauser hemocytometer के साथ किया गया. बायोरिएक्टर के माइक्रोबियल सदस्यों की पहचान जानने के लिए, डीएनए को बायोरिएक्टर तरल नमूनों से निकाला गया था, और 16S आरआरएनए जीन का विश्लेषण अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) द्वारा किया गया था। एनजीएस डेटा को MiSeq SOP16 के बाद मोथुर का उपयोग करके इन-हाउस संसाधित किया गया था।

टीकाकरण से पहले, प्रत्यक्ष सेल गणना अक्सर 1.0 × 106 कोशिकाओं / एमएल की पहचान सीमा (बीडीएल) से नीचे थी। दिन 23 (टीकाकरण के बाद) में 2.6 × 106 कोशिकाओं/एमएल की कम कोशिका गणना थी, जबकि अगले दिनों 30, 37 और 44 में 1.0 × 107 कोशिकाओं/एमएल(चित्रा 3)से अधिक सेल काउंट थे। हालांकि सेल काउंट 1, 8 और 22 दिनों में बीडीएल थे, एनजीएस के लिए हर समय बिंदु से डीएनए निकाला गया था, जो ऑटोक्लेविंग के बाद भी तलछट में प्री-इनोकुलम सूक्ष्मजीवों की बेसल उपस्थिति का संकेत देता है। मौजूद प्रमुख जीनस (प्रत्येक ऑपरेशनल टैक्सोनोमिक यूनिट (ओटीयू) में रीड्स की संख्या से निर्धारित) 8, 15 और 22 दिनों में स्थिर था, और इसे जियोबैसिलस के रूप में पहचाना गया था। 23 दिन पर बीएलएम -1 इनोकुलम के साथ टीकाकरण के बाद, जियोबैसिलस अब हावी नहीं था, और नए प्रमुख जेनेरा मामूली रूप से मौजूद जेनेरा की भीड़ के साथ उत्पन्न हुए, जो अधिकांश भाग के लिए, अध्ययन के अंत तक उपस्थिति बनाए रखते थे (चित्र 4)। इनसे, हम निष्कर्ष निकालते हैं कि बीएलएम -1 इनोकुलम बायोरिएक्टर के भीतर एक सक्रिय और गतिशील रूप से स्थानांतरण संस्कृति थी।

एनजीएस डेटा के एक अतिरिक्त अध्ययन से "माइक्रोबियल डार्क मैटर" के सदस्यों का पता चला। "अवर्गीकृत" या "असंस्कृत" शब्दों वाले असाइन किए गए टैक्सोनोमिक नामों वाले ओटीयू का उपयोग "माइक्रोबियल डार्क मैटर" के सदस्यों वाले ओटीयू के प्रॉक्सी के रूप में किया गया था। एनजीएस डेटा को दिन 44 (बोरहोल बीएलएम -1 से सूक्ष्मजीवों के साथ पोस्ट-इनोक्यूलेशन का अंतिम दिन) के लिए इकट्ठा किया गया था और ओटीयू को शामिल नहीं करने के लिए फ़िल्टर किया गया था जो पूर्व-टीकाकरण डेटा (दिन 1, 8, 15, या 22) में पढ़ता था क्योंकि इन ओटीयू के इनोकुलम में होने की संभावना नहीं थी। फ़िल्टर किए गए दिन 44 एनजीएस डेटा में 1,844 ओटीयू और 3,396 रीड शामिल थे। इनमें से, 366 ओटीयू (20%) और 925 रीड (27%) को फाइलम स्तर पर अवर्गीकृत किया गया था, और 1252 ओटीयू (68%) और 2357 रीड (69%) जीनस स्तर पर अवर्गीकृत या असंस्कृत थे। हालांकि अल्पकालिक, इस प्रॉक्सी द्वारा, यह पायलट अध्ययन "माइक्रोबियल डार्क मैटर" के संस्कृति सदस्यों को पर्यावरण की दृष्टि से सूचित मीडिया के साथ बायोरिएक्टर की क्षमता का समर्थन करता है।

Figure 1
चित्र 1: एनारोबिक संवर्धन के लिए उपयोग किए जाने वाले कस्टम-डिज़ाइन किए गए बोरोसिलिकेट बायोरिएक्टर का योजनाबद्ध। (ए) एक तरफ से बायोरिएक्टर दृश्य। (इ) ्र-अक्ष के परितः ं को 90° (दक्षिणावर्त) घुमाने पर दृश्य दिखाई देता है)। (सी) बायोरिएक्टर का एक शीर्ष दृश्य। जैकेट डिजाइन पानी या तेल के साथ तापमान नियंत्रण के लिए अनुमति देता है। दो जैकेट बंदरगाहों को बी में दृश्य के दाईं ओर देखा जा सकता है। आंतरिक कक्ष को किसी भी प्रकार के तलछट से भरा जा सकता है या प्लवक संवर्धन के लिए तलछट से खाली छोड़ा जा सकता है। तीन नमूना बंदरगाहों ( ए में दृश्य के दाईं ओर देखा गया) बायोरिएक्टर कॉलम की विभिन्न गहराई पर सामग्री को निकालना संभव बनाता है। मानक 45, 18, और 14 जीएल उद्घाटन को टेफ्लॉन या ब्यूटाइल सेप्टा का उपयोग करके सील किया जा सकता है जो 1-6 महीने के लिए गैसटाइट सील रखेगा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सक्रिय बायोरिएक्टर विधानसभा। बाएं से दाएं फोटो में प्रस्तुत कांच के बने पदार्थ (ए) 8 एल कार्बोय, (बी) बायोरिएक्टर ( चित्र 1 देखें), और (सी) गैर-नमूना पकड़ने की बोतल हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: बायोरिएक्टर अध्ययन से प्रत्यक्ष सेल मायने रखता है। बायोरिएक्टर के भीतर माइक्रोबियल आबादी की निगरानी 0.02 मिमी पेट्रोफ-हॉसर हेमोसाइटोमीटर सेल गिनती कक्ष का उपयोग करके की गई थी। इनोकुलम को दिन 23 की शुरुआत में जोड़ा गया था। दिन 1, 8 और 22 के लिए सेल की गिनती पता लगाने की सीमा से नीचे थी। प्रत्यक्ष सेल गिनती की प्रभावी पहचान सीमा 1 × 106 कोशिकाओं / संक्षिप्तीकरण: b.d.l. = पता लगाने की सीमा से नीचे। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: बायोरिएक्टर अगली पीढ़ी अनुक्रमण। ओटीयू को स्टैक्ड बार ग्राफ में दर्शाया जाता है जो बायोरिएक्टर अध्ययन के प्रत्येक समय बिंदु से अद्वितीय ओटीयू से संबंधित रीड के प्रतिशत को दर्शाता है। अद्वितीय ओटीयू को एक जीनस कटऑफ पर उनके संबंधित वर्गीकरण को सौंपा गया था। जीनस 'अन्य' को प्रत्येक समय बिंदु में पढ़ने के 10% से कम सभी जेनेरा के रूप में परिभाषित किया गया है। प्रतिनिधित्व किए गए डीएनए रीड की कुल संख्या 506,358 है। प्रत्येक समय बिंदु के लिए पढ़ने की संख्या ग्राफ के शीर्ष पर सूचीबद्ध है। इनोकुलम को दिन 23 की शुरुआत में जोड़ा गया था। संक्षिप्ताक्षर: OTU = परिचालन वर्गीकरण इकाई। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

यौगिक मिट्टी मिश्रित संस्कृति के लिए राशि बोरहोल मिश्रित संस्कृति के लिए राशि बोरहोल पृथक मेथनोजेन के लिए राशि
आसुत जल 1000.0 एमएल 1000.0 एमएल 1000.0 एमएल
हेप्स 3.600 ग्रॅम - -
एमओपीएस - - 2.000 ग्रॅम
डहब्स2 ∙6 भ्2व् 0.400 ग्रॅम 0.400 ग्रॅम 0.400 ग्रॅम
केसीएल 0.500 ग्रॅम 0.250 ग्रॅम 0.500 ग्रॅम
एनएच4सीएल 0.268 ग्रॅम 0.268 ग्रॅम 0.268 ग्रॅम
ना2एसओ4 - 0.284 ग्रॅम 1.500 ग्रॅम
ना2एचपीओ4 ∙2 एच2ओ - - 0.356 ग्रॅम
पीएच 6 पर 1 एम केएच2पीओ4 1.0 एमएल 1.0 एमएल -
पीएच 9.4 पर 1 एम एच3बीओ3 1.0 एमएल 1.0 एमएल 1.0 एमएल
खनिजों का पता लगाएं 1.0 एमएल - 1.0 एमएल
विटामिन - - 1.0 एमएल
1 mg/mL सोडियम रेज़ज़ुरिन 0.4 एमएल 0.3 एमएल 0.4 एमएल
पीएच समायोजन करने के लिए - 7.0 7.0
पीएच समायोजन द्वारा - नाओह कोह
इनक्यूबेशन तापमान 25 डिग्री सेल्सियस 60 डिग्री सेल्सियस 47 डिग्री सेल्सियस

तालिका 1: मीडिया संरचना। प्रत्येक माध्यम के लिए यौगिकों और भौतिक मापदंडों की सूची। प्रस्तुत मीडिया भोला है; उनमें कार्बन और ऊर्जा स्रोत नहीं होते हैं क्योंकि ये पाठक के सूक्ष्मजीवों और रुचि के वातावरण द्वारा विशिष्ट हो सकते हैं और सूचित किए जाने चाहिए। संभावित कार्बन और ऊर्जा स्रोत परिवर्धन के विचारों के लिए चर्चा अनुभाग देखें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल (खंड 1) का मध्यम उत्पादन खंड मिलर और वोलिन17 की संशोधित हंगटे तकनीक के लिए इसकी संरचना का श्रेय देता है, जिसका व्यापक रूप से इसके प्रकाशन के बाद से उपयोग किया गया है। इस विस्तारित प्रोटोकॉल की व्यावहारिकता इसकी वर्णनात्मक प्रकृति और सूक्ष्मजीवों के स्वस्थानी अधिग्रहण के साथ युग्मन से आती है। पर्यावरण की दृष्टि से सूचित और नकली मीडिया युक्त संस्कृति की बोतलों का उपयोग "माइक्रोबियल डार्क मैटर" के सीटू-अधिग्रहित पूर्व सदस्यों में निम्नलिखित को सफलतापूर्वक संस्कृति के लिए किया गया है: एनारोबिक उपसतह बैक्टीरिया थर्मोएनारोसेप्ट्रम फ्रैक्टिकलिस स्ट्रेन डीआरआई 1318, कैल्डियाट्रिबैक्टीरियम इन्फेरामन्स स्ट्रेन एसआईयूसी 1 (परिग्रहण संख्या MT023787; तैयारी में पांडुलिपि), और एनारोथेर्मस हेफेस्टी तनाव SIUC3 (परिग्रहण संख्या MK618647; तैयारी में पांडुलिपि), और एनारोबिक उपसतह जीवाणु uncharacteristics तनाव DRI14 (परिग्रहण संख्या KR708540).

इस प्रोटोकॉल का एक फोकस यह है कि इसे सतह और उपसतह एनारोबिक वातावरण और सूक्ष्मजीवों के लिए अत्यधिक अनुकूलनीय बनाया गया है। सबसे पहले, मध्यम संरचना को ब्याज के पर्यावरण की संरचना को प्रतिबिंबित करने के लिए बदलने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है। उदाहरण के लिए, Na+ और Cl- दोनों के लिए 3,000 mg/L की आयनिक सांद्रता वाले वातावरण का अनुकरण करते समय NaCl के 3,000 mg/L को नुस्खा में जोड़ा जा सकता है; या 650 एमएल रेत और 650 एमएल शेल को बायोरिएक्टर में रखा जा सकता है जब बलुआ पत्थर से शेल के 1: 1 मात्रा अनुपात के साथ पर्यावरण का अनुकरण किया जाता है। दूसरा, मध्यम संरचना को ब्याज के विशिष्ट सूक्ष्मजीवों के विकास को प्रोत्साहित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। विशेष रूप से, इस पत्र में तीन मीडिया जैसे भोले मीडिया इस तरह के संशोधनों के लिए तैयार हैं और निर्भर हैं। कार्बन और ऊर्जा स्रोतों के उदाहरणों में फ्यूमरेट18, पेप्टोन18, सेलूलोज़ युक्त कार्बनिक पदार्थ19, एसीटेट20, खमीर निकालने19,20, ज़ाइलिटोल (तनाव SIUC1), फॉर्मेट (तनाव SIUC3), और अन्य संभावित स्रोत जैसे H2/CO2, साइट्रेट और ग्लूकोज। अंत में, वांछित अध्ययन के आधार पर मध्यम संरचना को बदला जा सकता है। उदाहरण के लिए, प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में वर्णित अध्ययन का मुख्य हित यह पता लगाना था कि प्रतिनिधि उपसतह एनारोबिक सूक्ष्मजीव एक अद्वितीय मिश्रित कार्बनिक घोल (ओएचडी13,14 द्वारा संसाधित मकई के गोले का एक घोल) का जवाब कैसे देंगे; इस प्रकार, इसके नुस्खा में अधिक पारंपरिक विकल्पों के बजाय यह कार्बन स्रोत शामिल था। विशिष्ट अध्ययनों के लिए अन्य संभावित संशोधनों में बायोरेमेडिएशन अध्ययन के लिए प्लास्टिक, एसिड और भारी धातुओं, या अन्य ज़ेनोबायोटिक्स के अलावा शामिल हैं; मूल्य वर्धित depolymerized उत्पाद अध्ययन के लिए सेलूलोज़ और प्लास्टिक जैसे पुनर्गणना कार्बन पॉलिमर के अलावा; और छोटे पैमाने पर खाद और अन्य कृषि अध्ययनों के लिए खाद और पौधों के कचरे को जोड़ना।

यदि किसी माध्यम का पोस्ट-रिडक्टेंट विश्लेषण वांछित है, जैसे पीएच, ऑक्सीकरण न्यूनीकरण क्षमता (ओआरपी), और घुलित ऑक्सीजन (डीओ) की माप, तो यह अप्रत्यक्ष रूप से मध्यम बोतलों की प्रतिनिधि संख्या का त्याग करके पूरा किया जा सकता है उस बैच के चरित्र को आत्मविश्वास से समझने के लिए। हवा में एक सीलबंद मध्यम बोतल को उजागर करने पर, यह दृढ़ता से अनुशंसा की जाती है कि ओआरपी और डीओ रीडिंग खोलने पर 1 मिनट के भीतर ली जाती है। गैर-ऑक्सीजन-निर्भर माप (जैसे, पीएच) प्रारंभिक उद्घाटन के बाद गैर-तत्काल लिया जा सकता है। फास्टिडियस एनारोबिक सूक्ष्मजीवों को आमतौर पर विकास के लिए -200 एमवी < ओआरपी मूल्यों की आवश्यकता होती है। यदि माध्यम का परिणाम > -200 mV और/या DO मान >0.40 mg/L, अतिरिक्त Na2S (0.1-0.2 g/L) या अन्य रिडक्टेंट (जैसे, टाइटेनियम साइट्रेट, L-सिस्टीन, एस्कॉर्बिक एसिड) का ORP मान होता है, तो माध्यम को और कम करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Resazurin अक्सर एक ऑक्सीजन सूचक के रूप में प्रयोग किया जाता है (इस प्रोटोकॉल के रूप में); हालांकि, यह अधिक सटीक रूप से एक रेडॉक्स संकेतक21 है, जो अप्रत्यक्ष रूप से ऑक्सीजन की उपस्थिति का संकेत देता है क्योंकि ऑक्सीजन एक समाधान की रेडॉक्स क्षमता को बदलता है। समाधान में रेज़्ज़ुरिन शुरू में नीले रंग का दिखाई देता है। एजेंटों को कम करने के संपर्क में, समाधान अपरिवर्तनीय रूप से गुलाबी रंग में बदल जाता है। जब समाधान को और कम किया जाता है, तो यह विपरीत रूप से रंगहीन हो जाता है और ऑक्सीकरण पर गुलाबी हो जाता है। लेखकों ने ऐसे उदाहरण देखे हैं जहां रेज़ुरिन युक्त कम मीडिया नीले से गुलाबी रंग में स्थानांतरित हो गया लेकिन रंगहीन में स्थानांतरित होने में विफल रहा। हालांकि, लेखकों ने यह भी देखा है कि इस तरह के मीडिया अक्सर ऑटोक्लेविंग के बाद रंगहीन हो जाते हैं, और मीडिया को उबालने और फ्लश करने में लगने वाले समय में वृद्धि आम तौर पर रिडक्टेंट्स जोड़ने के बाद रेसाज़ुरिन को अपने रंगहीन रूप में स्थानांतरित करने की अनुमति देती है। यदि वांछित है, तो माध्यम में ऑक्सीजन की एकाग्रता को भंग ऑक्सीजन जांच के साथ सत्यापित किया जा सकता है।

इन बायोरिएक्टरों और कस्टम-निर्मित ग्लास बायोरिएक्टरों को चलाने के लिए आवश्यक सभी सामग्री ~ $ 5K से अधिक नहीं थी (यह मानता है कि समर्थन उपकरण पहले से ही उपलब्ध हैं जैसे कि पानी के स्नान, पंप और इनक्यूबेटर)। ये एनारोबिक खेती तकनीक आर्थिक रूप से अनुकूल हैं, वाणिज्यिक स्वचालित बायोरिएक्टरों की तुलना में जो > $ 10K से शुरू हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, कई वाणिज्यिक बायोरिएक्टर एक बार उपयोग होने वाले रिएक्टर कंटेनरों पर स्विच कर रहे हैं, जो तुलना की गतिशीलता को बदलता है और छोटे अनुसंधान प्रयोगशालाओं / विश्वविद्यालयों के लिए लगातार बदलने के लिए लागत प्रभावी नहीं है। इसके अतिरिक्त, वाणिज्यिक प्रणालियों में विनिर्माण रासायनिक पूर्वाग्रह (उपयोग किए गए प्लास्टिक, गास्केट / फिटिंग पर तेल, या रासायनिक रूप से उपचारित पानी) हो सकते हैं जो बढ़ते तेज सूक्ष्मजीवों की सफलता को प्रभावित करेंगे। कम लागत, customizability, और बहुमुखी प्रतिभा एक अवायवीय पर्यावरण नमूना इकट्ठा करने के लिए, एक सूचित मीडिया है कि inoculated किया जा सकता है के साथ संयोजन में, जो अध्ययन के लिए संवर्धन पैदा में परिणाम, बहुत अद्वितीय सूक्ष्मजीवों को प्राप्त करने की संभावना बढ़ जाती है.

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक सूचना और परामर्श की वंशावली को स्वीकार करना चाहते हैं जिसने वर्षों से इन तकनीकों को प्रभावित/विकसित किया है। हैमिल्टन-ब्रेहम एक पूर्व स्नातक छात्र, पोस्टडॉक और वर्तमान प्रोफेसर के रूप में उन लोगों के प्रति आभार व्यक्त करते हैं जिन्होंने एनारोबिक तकनीकों को पढ़ाने के लिए समय निकाला: डॉ माइक एडम्स, डॉ गर्टी शुट, डॉ जिम एल्किंस, डॉ मिर्सिया पोडर, डॉ डुआने मोजर, और डॉ ब्रायन हेडलंड। नेचर कंजरवेंसी और अमेरिकन रिवर ने क्रमशः अनुदान G21-026-CON-P और AR-CE21GOS373 के माध्यम से इस काम का समर्थन किया। इस पत्र में व्यक्त की गई कोई भी राय, निष्कर्ष, निष्कर्ष या सिफारिशें लेखकों की हैं और जरूरी नहीं कि प्रकृति संरक्षण या अमेरिकी नदियों के विचारों को प्रतिबिंबित करें। इस काम को एसआईयू एडवांस्ड एनर्जी इंस्टीट्यूट से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, जो उन्नत ऊर्जा संसाधन बोर्ड के माध्यम से दिए गए धन को कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार करता है। एनजीएस एलसी साइंसेज द्वारा किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
General Materials
1 L borosillicate bottle Fisher Scientific
1 mL syringe with slip tip Fisher Scientific
10 mL glass pipette Fisher Scientific
100 mL culture bottle Fisher Scientifc
20 mm hand crimper Fisher Scientifc
23 G needle Fisher Scientifc
500 mL borosilicate bottle Fisher Scientific
Aluminum seal Fisher Scientifc
Cannula, 31.5 cm length Fisher Scientific
Cannula, 6 cm length Fisher Scientifc
Corer Giddings Machine Company  Assembled from company parts
Gas manifold Swagelok Assembled from many different parts
Lighter Lowe's
N2 gas Airgas
Nitrile gloves Fisher Scientific
Rubber stopper (for GL45 bottles) Glasgeratebau OCHS
Rubber stopper (for culture bottles) Ace Glass
Stirring hot plate Corning
Trace minerals ATCC
Vitamins ATCC
Bioreactor-specific Materials
#10 rubber stopper Ace Glass
#7 rubber stopper Fisher Scientifc
1 mL syringe with luer lock tip Fisher Scientifc
1/4" hose barb ball valve Amazon
10 mL syringe with luer lock tip Fisher Scientifc
3.5 L borosilicate bottle Fisher Scientific
5/16" - 1/4" hose barb adapter fitting Amazon
60 mL syringe with luer lock tip Fisher Scientifc
8 L borosillicate carboy Allen Glass
Angled hose connector for GL14 open top cap Ace Glass 7623-20
Balloon Party City
Borosillicate bioreactor Allen Scientific Glass Custom made upon request
Drill Lowe's
Female luer lock adapter coupler Amazon
GL14 open top cap Ace Glass 7621-04
GL18 open top cap Ace Glass 7621-08
GL45 open top cap Ace Glass
PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap Ace Glass 7625-06
PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap Ace Glass 7625-07
Ring stand Fisher Scientific
Ring stand chain clamp Amazon
Ring stand clamp Fisher Scientific
Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od Grainger 55YG13
Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od Grainger
Straight hose connector for GL14 open top cap Ace Glass 7623-22
Three-way stopcock Amazon
Two-way stopcock Amazon
Ultra low flow variable flow mini-pump VWR
Water bath Fisher Scientifc
White rubber septum for 13-18 mm od tubes Ace Glass 9096-49
Wire Lowe's
Zip tie Lowe's

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References

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