JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

تحليل وظائف الجينات والتخيل ولدت سيليا من تدفق السوائل في حويصلة كوبفر

Published: March 31, 2013
doi:
10.3791/50038
, ,
1Department of Cell and Developmental Biology, State University of New York,Upstate Medical University, 2Department of Neurobiology and Anatomy, Eccles Institute of Human Genetics,University of Utah

Summary

أهداب ولدت في تدفق السوائل حويصلة كوبفر (KV) تسيطر على اليسار واليمين الزخرفة الجنين الزرد. هنا، نحن تصف تقنية لتعديل وظيفة الجين في الخلايا على وجه التحديد KV. وبالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا كيفية توصيل الخرز الفلورسنت في KV لتصور تدفق السوائل.

Abstract

الأعضاء الداخلية مثل القلب والمخ والقناة الهضمية وتطوير اليسار واليمين (LR) عدم التماثل التي تعتبر بالغة الأهمية لمهامهم العادية 1. ويشارك في تأسيس أهداب متحركة LR التباين في الأجنة الفقارية، بما في ذلك الماوس، الضفدع، والزرد 2-6. هذه 'أهداب LR' غير المتماثلة توليد تدفق السوائل ما هو ضروري لاشعال الحفظ غير المتماثلة العقدية (TGF-β الفصيلة) يشير شلال في الأديم المتوسط ​​الجانبي الأيسر لوحة، والتي يعتقد على توفير المعلومات LR الزخرفة لتطوير أجهزة 7. وبالتالي، لفهم الآليات الكامنة وLR الزخرفة، لا بد من تحديد الجينات التي تنظم تنظيم خلايا مهدبة LR، والحركة وطول أهداب LR وقدرتها على توليد التدفق غير المتماثلة قوية.

في الجنين الزرد، وتقع في الحويصلة LR ​​أهداب كوبفر (KV) 2،4،5. وتتألف من KV طبقة واحدة من الخلايا الطلائية monociliatedأن أرفق التجويف مملوءة بسائل. وقد أظهرت الخرائط التي مشتق مصير KV من مجموعة من الخلايا المعروفة باسم 20-30 ~ رائد الخلايا الظهرية (DFCs) التي تهاجر في الهامش الأريمة الظهرية خلال مراحل اكتفار 8،9. خلال المراحل المبكرة الجسيدة، DFCs العنقودية وتفرق في الخلايا الظهارية مهدبة لتشكيل KV في tailbud الجنين 10،11. القدرة على تحديد وتعقب DFCs في تركيبة مع الشفافية البصرية والتطور السريع في الزرد الجنين، جعل الزرد KV نظام نموذجا ممتازا لدراسة الخلايا المهدبة LR.

ومن المثير للاهتمام، من سلالة الأسلاف الخلية DFC / KV الاحتفاظ الجسور بين الخلية السيتوبلازمية صفار تصل إلى 4 ساعة بعد الإخصاب (HPF)، في حين الجسور حشوية بين الخلية والخلايا الجنينية صفار أخرى قريبة بعد 2 HPF 8. الاستفادة من هذه الجسور حشوية، وضعنا استراتيجية حقن المرحلة الخاصة لتقديم morpholino oligonucleotides (MO) حصريا لDFCs وضربة قاضية وظيفة الجين المستهدف في هذه الخلايا 12. هذه التقنية تخلق أجنة خيالية التي طرقت ظيفة الجين عليها في النسب DFC / KV النامية في سياق الجنين من النوع البري. غير المتماثلة لتحليل تدفق السوائل في KV، ونحن حقن microbeads الفلورسنت في التجويف KV وسجل الحركة باستخدام حبة videomicroscopy 2. هو تصور تدفق السوائل بسهولة ويمكن كميا من خلال تتبع التشريد حبة مع مرور الوقت.

هنا، وذلك باستخدام مرحلة محددة ضربة قاضية الجينات DFC التي تستهدف تقنية وحقن microbeads الفلورسنت في KV لتصور تدفق سنتطرق لبروتوكول يوفر نهجا فعالا لتوصيف دور جينات معينة أثناء نمو KV وظيفة.

Protocol

نظرة عامة على مسارح محددة حقن الأجنة الزرد [أليغنوكليوتيد] العقاقير morpholino (MO)، الذي ربط إلى مرنا وتعطيل استهداف بروتين تعبير عن ذلك النص، وتستخدم على نطاق واسع في ضربة قاضية الجين (الخسارة من وظيفة) دراسات في الزرد 13،14. أدوات ا…

Representative Results

المرحلة الخاصة الحقن MO توفر نهجا مفيدا لتحليل وظيفة الجين في حجرات خاصة للجنين. الشكل 1 يمثل الرسم البياني للاستراتيجيات الحقن المستخدمة لاختبار وظيفة الجين في DFC / KV الخلايا وكيفية إدخال الخرز الفلورسنت لتصور تدفق السوائل في KV. يظهر توزيع MO الفلورية في مرحل?…

Discussion

باستخدام الحقن مرحلة محددة لاستهداف MO لنسب الخلية DFC / KV هو نهج مفيد لدراسة الخلية للحكم الذاتي وظيفة الجين وتجنب الظواهر عديد المظاهر الناجمة عن ضربة قاضية الجينات العالمي. ومع ذلك، يمكن أن يكون تحديا هذه الحقن من الناحية الفنية. حقن MO بين المراحل 256-الخلية و 1،000 خلية …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر فيونا فولي للحصول على الدعم والرعاية ممتازة مختبر الزرد. وأيد هذا العمل زمالة AHA predoctoral لGW (11PRE5730027) والمنح NHLBI لHJY (R01HL66292) والنقابة (R01HL095690).

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number
Standard Control oligo-Lissamine tagged Gene Tools, LLC
Custom Rock2b morpholino oligo Gene Tools, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres Polysciences, Inc. 24054
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutherland, M. J., Ware, S. M. Disorders of left-right asymmetry: heterotaxy and situsinversus. Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 151C (4), 307-317 (2009).
  2. Essner, J. J., Amack, J. D., Nyholm, M. K., Harris, E. B., Yost, H. J. Kupffer’s vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut. Development. 132 (6), 1247-1260 (2005).
  3. Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
  4. Essner, J. J., et al. Conserved function for embryonic nodal cilia. Nature. 418 (6893), 37-38 (2002).
  5. Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer’s vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132 (8), 1907-1921 (2005).
  6. Schweickert, A., et al. Cilia-driven leftward flow determines laterality in Xenopus. Curr. Biol. 17 (1), 60-66 (2007).
  7. Tabin, C. J. The key to left-right asymmetry. Cell. 127 (1), 27-32 (2006).
  8. Cooper, M. S., D’Amico, L. A. A cluster of noninvolutingendocytic cells at the margin of the zebrafish blastoderm marks the site of embryonic shield formation. Dev. Biol. 180 (1), 184-198 (1996).
  9. Melby, A. E., Warga, R. M., Kimmel, C. B. Specification of cell fates at the dorsal margin of the zebrafish gastrula. Development. 122 (7), 2225-2237 (1996).
  10. Amack, J. D., Wang, X., Yost, H. J. Two T-box genes play independent and cooperative roles to regulate morphogenesis of ciliated Kupffer’s vesicle in zebrafish. Dev. Biol. 310 (2), 196-210 (2007).
  11. Oteiza, P., Koppen, M., Concha, M. L., Heisenberg, C. P. Origin and shaping of the laterality organ in zebrafish. Development. 135 (16), 2807-2813 (2008).
  12. Amack, J. D., Yost, H. J. The T box transcription factor no tail in ciliated cells controls zebrafish left-right asymmetry. Curr. Biol. 14 (8), 685-690 (2004).
  13. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat. Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
  14. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  15. Kimmel, C. B., Law, R. D. Cell lineage of zebrafish blastomeres. I. Cleavage pattern and cytoplasmic bridges between cells. Dev. Biol. 108 (1), 78-85 (1985).
  16. Arrington, C. B., Yost, H. J. Extra-embryonic syndecan 2 regulates organ primordia migration and fibrillogenesis throughout the zebrafish embryo. Development. 136 (18), 3143-3152 (2009).
  17. Caron, A., Xu, X., Lin, X. Wnt/beta-catenin signaling directly regulates Foxj1 expression and ciliogenesis in zebrafish Kupffer’s vesicle. Development. 139 (3), 514-524 (2012).
  18. Wang, G., et al. The Rho kinase Rock2b establishes anteroposterior asymmetry of the ciliated Kupffer’s vesicle in zebrafish. Development. 138 (1), 45-54 (2011).
  19. Aamar, E., Dawid, I. B. Sox17 and chordin are required for formation of Kupffer’s vesicle and left-right asymmetry determination in zebrafish. Dev. Dyn. 239 (11), 2980-2988 (2010).
  20. Neugebauer, J. M., Amack, J. D., Peterson, A. G., Bisgrove, B. W., Yost, H. J. FGF signalling during embryo development regulates cilia length in diverse epithelia. Nature. 458 (7238), 651-654 (2009).
  21. Schneider, I., et al. Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right patterning. Dev. Biol. 348 (1), 22-33 (2010).
  22. Matsui, T., et al. Canopy1, a positive feedback regulator of FGF signaling, controls progenitor cell clustering during Kupffer’s vesicle organogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), 9881-9886 (2011).
  23. Shu, X., et al. Na,K-ATPase alpha2 and Ncx4a regulate zebrafish left-right patterning. Development. 134 (10), 1921-1930 (2007).
  24. Esguerra, C. V. Ttrap is an essential modulator of Smad3-dependent Nodal signaling during zebrafish gastrulation and left-right axis determination. Development. 134 (24), 4381-4393 (2007).
  25. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  26. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  27. Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
  28. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  29. Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning. Development. 135 (1), 75-84 (2008).
  30. Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish. Development. 138 (2), 291-302 (2011).
  31. Matsui, T., Bessho, Y. Left-right asymmetry in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. , (2012).

Tags

Keywords: Gene FunctionCiliaKupffer’s VesicleLeft-right AsymmetryFluid FlowZebrafishDorsal Forerunner CellsMorpholino KnockdownVideomicroscopy
check_url/kr/50038?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D. Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer’s Vesicle. J. Vis. Exp. (73), e50038, doi:10.3791/50038 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image