Analisi della funzione del gene e visualizzazione di Cilia-Generated flusso di fluido in vescicole di Kupffer
Summary
Cilia generato il flusso del fluido in vescicole di Kupffer (KV) controlla sinistra-destra patterning dell'embrione zebrafish. Qui, si descrive una tecnica per modulare la funzione del gene specificamente in cellule KV. Inoltre, mostriamo come fornire perline fluorescenti in KV per visualizzare il flusso del fluido.
Abstract
Gli organi interni come il cuore, il cervello, e nell'intestino sviluppare sinistra-destra (LR) asimmetrie che sono fondamentali per le loro normali funzioni 1. Ciglia mobili sono coinvolti nella creazione LR asimmetria negli embrioni dei vertebrati, tra cui mouse, rana, e zebrafish 2-6. Questi 'cilia LR "generano flusso asimmetrico fluido che è necessario per attivare una conservata asimmetrica Nodal (TGF-β superfamiglia) di segnalazione cascata nel mesoderma piastra laterale sinistra, che è pensato per fornire informazioni patterning LR per lo sviluppo di organi 7. Così, per comprendere i meccanismi sottostanti patterning LR, è essenziale per identificare i geni che regolano l'organizzazione delle cellule ciliate LR, la motilità e la lunghezza delle ciglia LR e la loro capacità di generare robusto flusso asimmetrico.
In zebrafish, ciglia LR si trovano in vescicole di Kupffer (KV) 2,4,5. KV è costituito da un singolo strato di cellule epiteliali monociliatedche racchiudono un lume piene di liquido. Mappatura destino KV ha dimostrato che è derivato da un gruppo di ~ 20-30 cellule conosciute come cellule precursore dorsali (DFCS) che migrano al margine blastoderm dorsale durante fasi epiboly 8,9. Durante le fasi iniziali somite, cluster DFCS e differenziarsi in cellule epiteliali ciliate per formare KV nel tailbud dell'embrione 10,11. La capacità di identificare e tenere traccia di DFCS-in combinazione con trasparenza ottica e il rapido sviluppo del pesce zebra dell'embrione-make zebrafish KV un sistema ottimo modello per studiare le cellule ciliate LR.
È interessante notare che, progenitori della DFC / KV linea cellulare mantenere ponti citoplasmatici tra la cellula uovo fino a 4 ore post-fecondazione (HPF), mentre ponti citoplasmatici tra la cellula uovo e altre cellule embrionali vicino dopo 2 HPF 8. Approfittando di questi ponti citoplasmatici, abbiamo sviluppato una fase specifica strategia di iniezione per fornire morfolino oligonucleotides (MO) esclusivamente a DFCS smontabili e la funzione di un gene mirato in queste cellule 12. Questa tecnica crea embrioni chimerici in cui viene buttato funzione genica giù nella DFC / KV lignaggio sviluppare nel contesto di un embrione wild-type. Per analizzare il flusso asimmetrico fluido in KV, iniettiamo microsfere fluorescenti nel lume KV e movimento del disco perlina con videomicroscopia 2. Flusso del fluido è facilmente visualizzato e può essere quantificata inseguimento spostamento tallone nel tempo.
Qui, con lo stadio-specifico DFC-targeting tecnica knockdown gene e iniezione di microsfere fluorescenti in KV per visualizzare il flusso, presentiamo un protocollo che fornisce un approccio efficace per caratterizzare il ruolo di un particolare gene durante lo sviluppo e la funzione KV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizzo di fase-specifici iniezioni di indirizzare MO al DFC / KV linea cellulare è un approccio utile per lo studio delle cellule-autonomia della funzione del gene e di evitare fenotipi pleiotropici causati da knockdown gene globale. Tuttavia, queste iniezioni possono essere tecnicamente impegnativo. Iniezione di MO tra le fasi 256-cellula e cellula-1000 può portare a tre possibili esiti: 1) la MO rimane aggregati nel sito di iniezione, 2) si diffonde MO tutto il tuorlo ed entra DFC / KV cellule o 3) il MO si diffon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Fiona Foley per il sostegno e la cura eccellente laboratorio zebrafish. Questo lavoro è stato finanziato una borsa di studio predoctoral AHA a GW (11PRE5730027) e le sovvenzioni a HJY NHLBI (R01HL66292) e JDA (R01HL095690).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number |
| Standard Control oligo-Lissamine tagged | Gene Tools, LLC | |
| Custom Rock2b morpholino oligo | Gene Tools, LLC | |
| Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres | Polysciences, Inc. | 24054 |
References
- Sutherland, M. J., Ware, S. M. Disorders of left-right asymmetry: heterotaxy and situsinversus. Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 151C (4), 307-317 (2009).
- Essner, J. J., Amack, J. D., Nyholm, M. K., Harris, E. B., Yost, H. J. Kupffer’s vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut. Development. 132 (6), 1247-1260 (2005).
- Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
- Essner, J. J., et al. Conserved function for embryonic nodal cilia. Nature. 418 (6893), 37-38 (2002).
- Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer’s vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132 (8), 1907-1921 (2005).
- Schweickert, A., et al. Cilia-driven leftward flow determines laterality in Xenopus. Curr. Biol. 17 (1), 60-66 (2007).
- Tabin, C. J. The key to left-right asymmetry. Cell. 127 (1), 27-32 (2006).
- Cooper, M. S., D’Amico, L. A. A cluster of noninvolutingendocytic cells at the margin of the zebrafish blastoderm marks the site of embryonic shield formation. Dev. Biol. 180 (1), 184-198 (1996).
- Melby, A. E., Warga, R. M., Kimmel, C. B. Specification of cell fates at the dorsal margin of the zebrafish gastrula. Development. 122 (7), 2225-2237 (1996).
- Amack, J. D., Wang, X., Yost, H. J. Two T-box genes play independent and cooperative roles to regulate morphogenesis of ciliated Kupffer’s vesicle in zebrafish. Dev. Biol. 310 (2), 196-210 (2007).
- Oteiza, P., Koppen, M., Concha, M. L., Heisenberg, C. P. Origin and shaping of the laterality organ in zebrafish. Development. 135 (16), 2807-2813 (2008).
- Amack, J. D., Yost, H. J. The T box transcription factor no tail in ciliated cells controls zebrafish left-right asymmetry. Curr. Biol. 14 (8), 685-690 (2004).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat. Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
- Kimmel, C. B., Law, R. D. Cell lineage of zebrafish blastomeres. I. Cleavage pattern and cytoplasmic bridges between cells. Dev. Biol. 108 (1), 78-85 (1985).
- Arrington, C. B., Yost, H. J. Extra-embryonic syndecan 2 regulates organ primordia migration and fibrillogenesis throughout the zebrafish embryo. Development. 136 (18), 3143-3152 (2009).
- Caron, A., Xu, X., Lin, X. Wnt/beta-catenin signaling directly regulates Foxj1 expression and ciliogenesis in zebrafish Kupffer’s vesicle. Development. 139 (3), 514-524 (2012).
- Wang, G., et al. The Rho kinase Rock2b establishes anteroposterior asymmetry of the ciliated Kupffer’s vesicle in zebrafish. Development. 138 (1), 45-54 (2011).
- Aamar, E., Dawid, I. B. Sox17 and chordin are required for formation of Kupffer’s vesicle and left-right asymmetry determination in zebrafish. Dev. Dyn. 239 (11), 2980-2988 (2010).
- Neugebauer, J. M., Amack, J. D., Peterson, A. G., Bisgrove, B. W., Yost, H. J. FGF signalling during embryo development regulates cilia length in diverse epithelia. Nature. 458 (7238), 651-654 (2009).
- Schneider, I., et al. Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right patterning. Dev. Biol. 348 (1), 22-33 (2010).
- Matsui, T., et al. Canopy1, a positive feedback regulator of FGF signaling, controls progenitor cell clustering during Kupffer’s vesicle organogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), 9881-9886 (2011).
- Shu, X., et al. Na,K-ATPase alpha2 and Ncx4a regulate zebrafish left-right patterning. Development. 134 (10), 1921-1930 (2007).
- Esguerra, C. V. Ttrap is an essential modulator of Smad3-dependent Nodal signaling during zebrafish gastrulation and left-right axis determination. Development. 134 (24), 4381-4393 (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning. Development. 135 (1), 75-84 (2008).
- Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish. Development. 138 (2), 291-302 (2011).
- Matsui, T., Bessho, Y. Left-right asymmetry in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. , (2012).
