El análisis de la función génica y visualización de los cilios-generó un flujo de líquido en la vesícula Kupffer
Summary
Los cilios generada por el flujo de líquido en la vesícula Kupffer (KV) controla de izquierda a derecha del patrón del embrión de pez cebra. Aquí se describe una técnica para modular la función de genes específicamente en células KV. Además, se muestra cómo entregar perlas fluorescentes en KV para visualizar el flujo de fluido.
Abstract
Los órganos internos como el corazón, el cerebro y el intestino desarrollar izquierda-derecha (LR) las asimetrías que son críticos para sus funciones normales 1. Cilios Motile están involucrados en el establecimiento de LR asimetría en embriones de vertebrados, incluyendo ratón, rana, pez cebra y 2-6. Estos 'cilios LR, generar un flujo de fluido asimétrico, que es necesario para desencadenar una conservadas nodal asimétrica (TGF-β superfamilia) cascada de señalización en el mesodermo de la placa lateral izquierda, que se cree que proporcionan información LR patrones para el desarrollo de órganos 7. Por lo tanto, para entender los mecanismos subyacentes a los patrones LR, es esencial para identificar los genes que regulan la organización de las células ciliadas LR, la motilidad y la longitud de los cilios LR y su capacidad para generar el flujo asimétrico robusto.
En el embrión de pez cebra, LR cilios se encuentran en la vesícula Kupffer (KV) 2,4,5. KV se compone de una sola capa de células epiteliales monociliatedque encierran un lumen lleno de líquido. Mapeo de destino ha demostrado que KV se deriva de un grupo de ~ 20-30 células conocidas como células precursoras dorsales (CFD) que migran en el margen blastodermo dorsal durante las etapas epibolia 8,9. Durante las etapas tempranas somite, cluster CFD y se diferencian en células epiteliales ciliadas para formar KV en la tailbud del embrión 10,11. La capacidad de identificar y rastrear las CFD-en combinación con la transparencia óptica y el rápido desarrollo del pez cebra embriones de pez cebra KV hacer un excelente sistema modelo para estudiar las células ciliadas LR.
Curiosamente, los progenitores del linaje de células DFC / KV retener puentes citoplasmáticos entre la célula de yema de hasta 4 horas después de la fertilización (hpf), mientras que los puentes citoplásmicos entre la célula de yema y otras células embrionarias después de cerrar 2 hpf 8. Aprovechando estos puentes citoplasmáticos, hemos desarrollado una estrategia de inyección etapa específica para entregar morfolino oligonucleotides (MO) exclusivamente a las CFD y desmontables la función de un gen diana en estas 12 células. Esta técnica crea embriones quiméricos en los que se tocaron la función de genes en el linaje DFC / KV desarrollo en el contexto de un embrión de tipo salvaje. Para el análisis de flujo de fluidos asimétrica en KV, inyectamos microesferas fluorescentes en la luz y el movimiento KV registro perla usando videomicroscopy 2. El flujo de fluido se visualiza fácilmente y se puede cuantificar mediante el seguimiento de desplazamiento talón con el tiempo.
Aquí, utilizando la etapa específica de DFC orientada técnica gen desmontables y la inyección de microesferas fluorescentes en KV para visualizar el flujo, se presenta un protocolo que proporciona un enfoque eficaz para caracterizar el papel de un gen en particular durante el desarrollo y la función KV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Usando etapa específica de inyecciones para apuntar MO con el linaje celular DFC / KV es un enfoque útil para el estudio de células autonomía de la función de genes y fenotipos pleiotrópicos evitar causados por caída génica global. Sin embargo, estas inyecciones pueden ser técnicamente difícil. La inyección de MO entre las etapas de 256 y 1.000 células por células puede dar lugar a tres resultados posibles: 1) el MO sigue siendo agregadas en el sitio de inyección, 2) se difunde en toda la yema de MO …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Fiona Foley para el apoyo y la atención excelente laboratorio de pez cebra. Este trabajo recibió el apoyo de una beca predoctoral para AHA GW (11PRE5730027) y las subvenciones a HJY NHLBI (R01HL66292) y JDA (R01HL095690).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number |
| Standard Control oligo-Lissamine tagged | Gene Tools, LLC | |
| Custom Rock2b morpholino oligo | Gene Tools, LLC | |
| Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres | Polysciences, Inc. | 24054 |
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