L'analyse de la fonction des gènes et visualisation de Cilia généré par l'écoulement des fluides dans des vésicules de Kupffer

Summary

Cilia généré par l'écoulement du fluide dans des vésicules de Kupffer (KV) contrôle de gauche à droite structuration de l'embryon de poisson zèbre. Nous décrivons ici une technique permettant de moduler la fonction du gène spécifiquement dans les cellules KV. En outre, nous montrons comment livrer des billes fluorescentes dans KV de visualiser l'écoulement du fluide.

Abstract

Les organes internes comme le cœur, le cerveau et l'intestin développer gauche-droite (LR) asymétries qui sont critiques pour leurs fonctions normales ^1. Cils mobiles sont impliqués dans l'établissement LR asymétrie dans des embryons de vertébrés, y compris la souris, grenouille, poisson zèbre et ^2-6. Ces «cils LR engendre de l'écoulement du fluide asymétrique qui est nécessaire pour déclencher une asymétrie conservée Nodal (TGF-β superfamille) cascade de signalisation dans le mésoderme de la plaque latérale gauche, ce qui est pensé pour fournir des informations de motifs LR pour le développement des organes ^7. Ainsi, pour comprendre les mécanismes sous-jacents de motifs LR, il est essentiel d'identifier les gènes qui régulent l'organisation des cellules ciliées LR, la motilité et la longueur des cils LR et leur capacité à générer des flux robuste asymétrique.

Dans l'embryon du poisson zèbre, les cils LR sont situés dans des vésicules de Kupffer (KV) ^2,4,5. KV est constitué d'une seule couche de cellules épithéliales monociliatedqui entourent une lumière remplies de liquide. Cartographie destin a montré que KV est dérivé d'un groupe de ~ 20-30 cellules appelées cellules précurseur dorsales (SFD) qui migrent à la marge blastoderme dorsal pendant les étapes épibolie ^8,9. Au cours des phases précoces de somites, le cluster DFC et se différencient en cellules épithéliales ciliées pour former KV dans le bourgeon caudal de l'embryon ^10,11. La capacité d'identifier et de suivre les SFD en combinaison avec transparence optique et le développement rapide de l'embryon du poisson zèbre zèbre faire-KV un excellent modèle pour étudier les cellules ciliées LR.

Fait intéressant, les progéniteurs de la lignée cellulaire DFC / KV conserver des ponts cytoplasmiques entre la cellule vitelline jusqu'à 4 heures après la fécondation (HPF), tandis que les ponts cytoplasmiques entre la cellule vitelline et d'autres cellules embryonnaires près au bout de 2 hpf ^8. Profitant de ces ponts cytoplasmiques, nous avons développé une stratégie d'injection spécifique du stade de livrer morpholino oligonucleotides (MO) uniquement aux SFD et démontable de la fonction d'un gène ciblé dans ces cellules ^12. Cette technique crée des embryons chimères dans lesquelles la fonction du gène est renversé dans la lignée DFC / KV développement dans le contexte d'un embryon de type sauvage. Pour analyser l'écoulement du fluide asymétrique KV, on injecte des microbilles fluorescentes dans la lumière KV et enregistrement de mouvement de billes utilisant la vidéomicroscopie ^2. L'écoulement du fluide est facilement visualisée et peut être quantifiée en suivant le déplacement perle au fil du temps.

Ici, en utilisant la phase spécifique DFC ciblée technique inactivation génique et l'injection de microbilles fluorescentes dans KV à visualiser la circulation, nous présentons un protocole qui fournit une approche efficace pour caractériser le rôle d'un gène particulier au cours du développement et de la fonction KV.

Protocol

Vue d'ensemble de la phase spécifiques injections embryon du poisson zèbre Oligonucléotides antisens morpholino (MO), qui se lient à un ARNm cible et perturber l'expression des protéines à partir de ce compte rendu, sont largement utilisés dans inactivation génique (perte de fonction) des études chez le poisson zèbre 13,14. Outils Gene, LLC offre des OM qui sont marqués soit avec carboxyfluorescéine (émet la fluorescence verte) ou lissamine (émet la fluorescence…

Representative Results

Spécifiques au stade injections MO fournir une approche utile pour analyser la fonction des gènes dans des compartiments spécifiques de l'embryon. La figure 1 présente un diagramme des stratégies d'injection utilisés pour tester la fonction des gènes dans des PLC / KV cellules et comment introduire des billes fluorescentes de visualiser l'écoulement du fluide dans KV. La distribution des MO fluorescente succès spécifiques au stade embryons injectés est représenté schématiquemen…

Discussion

L'utilisation spécifiques au stade injections de cibler MO à la lignée cellulaire DFC / KV est une approche utile pour étudier des cellules autonomie de la fonction des gènes et de phénotypes pléiotropes éviter causés par inactivation génique globale. Toutefois, ces injections peuvent être techniquement difficile. L'injection de MO entre les étapes 256-cellulaires et 1.000 cellules peut aboutir à trois résultats possibles: 1) la MO reste agrégées au site d'injection, 2) les diffuse à travers…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number
Standard Control oligo-Lissamine tagged	Gene Tools, LLC
Custom Rock2b morpholino oligo	Gene Tools, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres	Polysciences, Inc.	24054