JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

Analyse van gen-functie en visualisatie van Cilia-gegenereerde Fluid Flow in Blaasjes Kupffer's

Published: March 31, 2013
doi:
10.3791/50038
, ,
1Department of Cell and Developmental Biology, State University of New York,Upstate Medical University, 2Department of Neurobiology and Anatomy, Eccles Institute of Human Genetics,University of Utah

Summary

Cilia-gegenereerde vloeistofstroom in Blaasjes Kupffer's (KV) regelt links-rechts patroonvorming van de zebravis embryo. We beschrijven een techniek voor het moduleren genfunctie specifiek in KV cellen. Verder tonen we hoe fluorescerende kralen leveren in KV om vloeistofstroming visualiseren.

Abstract

Interne organen zoals het hart, hersenen, darm en ontwikkelen links-rechts (LR) asymmetrie die essentieel zijn voor hun normale functie 1. Beweeglijke cilia zijn betrokken bij het ​​vaststellen van LR asymmetrie in gewervelde embryo's, met inbegrip van de muis, kikker, en zebravis 2-6. Deze 'LR' cilia genereren asymmetrische vloeistofstroom die nodig is om een geconserveerde asymmetrische Nodal (TGF-β superfamilie) signaalcascade in de linker laterale plaat mesoderm, waarvan men denkt dat LR patronen informatie voor ontwikkelende organen 7 activeren. Dus begrijpen mechanismen LR patroon, is het essentieel om genen te identificeren die de organisatie van LR gecilieerde cellen, de motiliteit en de lengte van LR cilia en hun vermogen om robuuste asymmetrische stromen genereren reguleren.

In de zebravisembryo zijn LR cilia in vesicle Kupffer's (KV) 2,4,5. KV bestaat uit een enkele laag van epitheelcellen monociliateddat een met vloeistof gevulde lumen omsluiten. Fate mapping is gebleken dat KV is afgeleid van een groep van ~ 20-30 cellen bekend als dorsale voorloper cellen (DFC) die migreren op de dorsale blastoderm marge in epiboly fasen 8,9. Tijdens de vroege stadia somiet, om DFC's cluster en differentiëren tot trilharen epitheelcellen vormen KV in de tailbud van het embryo 10,11. De mogelijkheid om te identificeren en te volgen DFC-in combinatie met optische transparantie en de snelle ontwikkeling van de zebravis embryo-maken zebravis KV een uitstekend modelsysteem om LR trilharen cellen te bestuderen.

Interessant, voorvaderen van de DFC / KV cellijn te behouden cytoplasmatische bruggen tussen de dooier cel tot 4 uur na de bevruchting (HPF), terwijl cytoplasmatische bruggen tussen de dooier cel en andere embryonale cellen dicht na 2 hpf 8. Maken van deze cytoplasmatische bruggen hebben we een stadium-specifieke injectie strategie morfolino oligonucle leverenotides (MO) uitsluitend DFC en knockdown de functie van een gerichte gen in deze cellen 12. Deze techniek zorgt voor chimerisch embryo's in welk gen functie wordt naar beneden geklopt in de DFC / KV afkomst ontwikkelen in het kader van een wild-type embryo. Om asymmetrische stroming analyseren KV, we injecteren fluorescerende microbolletjes in de KV lumen en opnemen kraal beweging met behulp van videomicroscopie 2. Fluïdumstroom gemakkelijk gevisualiseerd en kan worden gekwantificeerd door het volgen bead verplaatsing in de tijd.

Hier, met het stadium-specifieke DFC-targetgen knockdown techniek en injectie van fluorescerende microbolletjes in KV stromen visualiseren we een protocol dat een effectieve benadering van de rol van een bepaald gen te karakteriseren tijdens KV ontwikkeling en functie biedt.

Protocol

Overzicht van Stage-specifieke zebravisembryo Injecties Antisense oligonucleotiden morfolino (MO), die binden aan een doelwit-mRNA en eiwitexpressie verstoren van die transcript, worden veel gebruikt in gen knockdown (loss-of-function) studies in zebravis 13,14. Gene Tools, LLC biedt MO's die zijn voorzien van tag met ofwel carboxyfluoresceïne (zendt groene fluorescentie) of lissamine (zendt rode fluorescentie) om MO te detecteren in geïnjecteerde embryo's met behulp van fl…

Representative Results

Stadiumspecifieke MO injecties geven een nuttige benadering voor genfunctie analyse in specifieke compartimenten van de embryo. Figuur 1 toont een stroomschema van de injectie strategieën om genfunctie testen DFC / KV cellen en hoe fluorescerende kralen introduceren fluïdumstroming visualiseren in KV. De verdeling van fluorescentie in MO succesvolle stadium-specifieke geïnjecteerde embryo's is schematisch weergegeven in de figuren 1D-F en levende embryo's in Figuur 2….

Discussion

Met behulp van fase-specifieke injecties om MO te richten op de DFC / KV cellijn is een bruikbare benadering van de cel-autonomie van gen-functie te bestuderen en te voorkomen dat pleiotrope fenotypes veroorzaakt door de opwarming gen knockdown. Toch kunnen deze injecties zijn technisch uitdagend. Injectie van MO tussen de 256-cel en 1.000 cellen fasen kan resulteren in drie mogelijkheden: 1) de MO blijft geaggregeerd op de injectieplaats, 2) de MO diffundeert in de dooier en gaat DFC / KV cellen of 3) de MO diffundeert…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Fiona Foley voor uitstekende lab ondersteuning en zebravis zorg. Dit werk werd ondersteund een AHA predoctorale beurs GW (11PRE5730027) en NHLBI subsidies aan HJY (R01HL66292) en JDA (R01HL095690).

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number
Standard Control oligo-Lissamine tagged Gene Tools, LLC
Custom Rock2b morpholino oligo Gene Tools, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres Polysciences, Inc. 24054
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutherland, M. J., Ware, S. M. Disorders of left-right asymmetry: heterotaxy and situsinversus. Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 151C (4), 307-317 (2009).
  2. Essner, J. J., Amack, J. D., Nyholm, M. K., Harris, E. B., Yost, H. J. Kupffer’s vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut. Development. 132 (6), 1247-1260 (2005).
  3. Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
  4. Essner, J. J., et al. Conserved function for embryonic nodal cilia. Nature. 418 (6893), 37-38 (2002).
  5. Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer’s vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132 (8), 1907-1921 (2005).
  6. Schweickert, A., et al. Cilia-driven leftward flow determines laterality in Xenopus. Curr. Biol. 17 (1), 60-66 (2007).
  7. Tabin, C. J. The key to left-right asymmetry. Cell. 127 (1), 27-32 (2006).
  8. Cooper, M. S., D’Amico, L. A. A cluster of noninvolutingendocytic cells at the margin of the zebrafish blastoderm marks the site of embryonic shield formation. Dev. Biol. 180 (1), 184-198 (1996).
  9. Melby, A. E., Warga, R. M., Kimmel, C. B. Specification of cell fates at the dorsal margin of the zebrafish gastrula. Development. 122 (7), 2225-2237 (1996).
  10. Amack, J. D., Wang, X., Yost, H. J. Two T-box genes play independent and cooperative roles to regulate morphogenesis of ciliated Kupffer’s vesicle in zebrafish. Dev. Biol. 310 (2), 196-210 (2007).
  11. Oteiza, P., Koppen, M., Concha, M. L., Heisenberg, C. P. Origin and shaping of the laterality organ in zebrafish. Development. 135 (16), 2807-2813 (2008).
  12. Amack, J. D., Yost, H. J. The T box transcription factor no tail in ciliated cells controls zebrafish left-right asymmetry. Curr. Biol. 14 (8), 685-690 (2004).
  13. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat. Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
  14. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  15. Kimmel, C. B., Law, R. D. Cell lineage of zebrafish blastomeres. I. Cleavage pattern and cytoplasmic bridges between cells. Dev. Biol. 108 (1), 78-85 (1985).
  16. Arrington, C. B., Yost, H. J. Extra-embryonic syndecan 2 regulates organ primordia migration and fibrillogenesis throughout the zebrafish embryo. Development. 136 (18), 3143-3152 (2009).
  17. Caron, A., Xu, X., Lin, X. Wnt/beta-catenin signaling directly regulates Foxj1 expression and ciliogenesis in zebrafish Kupffer’s vesicle. Development. 139 (3), 514-524 (2012).
  18. Wang, G., et al. The Rho kinase Rock2b establishes anteroposterior asymmetry of the ciliated Kupffer’s vesicle in zebrafish. Development. 138 (1), 45-54 (2011).
  19. Aamar, E., Dawid, I. B. Sox17 and chordin are required for formation of Kupffer’s vesicle and left-right asymmetry determination in zebrafish. Dev. Dyn. 239 (11), 2980-2988 (2010).
  20. Neugebauer, J. M., Amack, J. D., Peterson, A. G., Bisgrove, B. W., Yost, H. J. FGF signalling during embryo development regulates cilia length in diverse epithelia. Nature. 458 (7238), 651-654 (2009).
  21. Schneider, I., et al. Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right patterning. Dev. Biol. 348 (1), 22-33 (2010).
  22. Matsui, T., et al. Canopy1, a positive feedback regulator of FGF signaling, controls progenitor cell clustering during Kupffer’s vesicle organogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), 9881-9886 (2011).
  23. Shu, X., et al. Na,K-ATPase alpha2 and Ncx4a regulate zebrafish left-right patterning. Development. 134 (10), 1921-1930 (2007).
  24. Esguerra, C. V. Ttrap is an essential modulator of Smad3-dependent Nodal signaling during zebrafish gastrulation and left-right axis determination. Development. 134 (24), 4381-4393 (2007).
  25. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  26. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  27. Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
  28. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  29. Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning. Development. 135 (1), 75-84 (2008).
  30. Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish. Development. 138 (2), 291-302 (2011).
  31. Matsui, T., Bessho, Y. Left-right asymmetry in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. , (2012).

Tags

Keywords: Gene FunctionCiliaKupffer’s VesicleLeft-right AsymmetryFluid FlowZebrafishDorsal Forerunner CellsMorpholino KnockdownVideomicroscopy
check_url/kr/50038?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D. Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer’s Vesicle. J. Vis. Exp. (73), e50038, doi:10.3791/50038 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image