Análise da função do gene e Visualização de Cilia-Generated fluxo de fluidos em vesículas de Kupffer
Summary
Cílios gerado o fluxo de fluido na vesícula de Kupffer (KV) controla esquerda-direita padronização do embrião do peixe-zebra. Aqui, nós descrevemos uma técnica para modular a função do gene especificamente em células KV. Além disso, vamos mostrar como entregar partículas fluorescentes em KV para visualizar o fluxo de fluido.
Abstract
Órgãos internos como o coração, cérebro, intestino e desenvolver esquerda-direita (LR) assimetrias que são críticos para suas funções normais 1. Cílios móveis estão envolvidos no estabelecimento LR assimetria em embriões de vertebrados, incluindo rato, sapo, e zebrafish 2-6. Estes 'LR' cílios gerar fluxo de fluido assimétrica que é necessária para desencadear uma conservada assimétrica Nodal (TGF-β superfamília) cascata de sinalização na mesoderme da placa lateral esquerda, que é pensado para proporcionar informação LR padronização para o desenvolvimento de órgãos 7. Assim, para compreender os mecanismos subjacentes à padronização LR, é essencial identificar os genes que regulam a organização das células ciliadas LR, a motilidade e tempo de LR cílios e a sua capacidade de gerar um fluxo assimétrico robusto.
No embrião do peixe-zebra, cílios LR estão localizados na vesícula de Kupffer (KV) 2,4,5. KV é composta de uma única camada de células epiteliais monociliatedque encerram um lúmen cheias de líquido. Mapeamento de destino tem mostrado que KV é derivado a partir de um grupo de ~ 20-30 células conhecidas como células de precursor dorsal (DFC) que migram para a margem dorsal blastoderme, durante os estágios epiboly 8,9. Durante as fases iniciais somito, DFC cluster e diferenciam-se em células epiteliais ciliadas, para formar KV no tailbud do embrião 10,11. A capacidade de identificar e rastrear DFC em combinação com transparência óptica e rápido desenvolvimento do peixe-zebra-embrião zebrafish KV fazer um sistema excelente modelo para estudar as células ciliadas LR.
Curiosamente, os progenitores da linhagem de células DFC / KV reter pontes citoplasmáticas entre a célula de gema até 4 horas pós-fertilização (hpf), enquanto pontes entre o citoplasma de células de gema e de outras células embrionárias perto após 2 hpf 8. Aproveitando essas pontes citoplasmáticas, desenvolvemos uma estratégia de injeção de estágio específico para entregar morfolino oligonucleotides (MO) exclusivamente para SFD e knockdown da função de um gene alvo nestes 12 células. Esta técnica cria embriões quiméricos em que a função do gene é derrubados na linhagem DFC / KV desenvolvimento no contexto de um embrião de tipo selvagem. Para analisar o fluxo de fluido assimétrica na KV, injetamos microesferas fluorescentes para o lúmen KV e movimento recorde talão usando videomicroscopia 2. O fluxo do fluido é facilmente visualizado e pode ser quantificado seguindo o deslocamento do grânulo ao longo do tempo.
Aqui, o uso da fase específica DFC segmentada técnica knockdown do gene e a injecção de microesferas fluorescentes em KV para visualizar o fluxo, apresenta um protocolo que proporciona uma abordagem eficaz para caracterizar o papel de um gene específico durante o desenvolvimento e função KV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Usando estágio específicos injeções para atingir MO à linhagem de células DFC / KV é uma abordagem útil para o estudo de células-autonomia da função do gene e evitar fenótipos pleiotrópicos causados por knockdown do gene global. No entanto, essas injeções pode ser tecnicamente desafiadora. Injecção de MO entre os estágios de células 256 e 1000 células pode resultar em três resultados possíveis: 1) o MO permanece agregados no local da injecção, 2) se difunde ao longo do MO gema e entra DFC /…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Fiona Foley para suporte excelente laboratório e cuidados zebrafish. Este trabalho foi suportado uma comunhão AHA predoctoral a GW (11PRE5730027) e concede NHLBI para HJY (R01HL66292) e ADC (R01HL095690).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number |
| Standard Control oligo-Lissamine tagged | Gene Tools, LLC | |
| Custom Rock2b morpholino oligo | Gene Tools, LLC | |
| Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres | Polysciences, Inc. | 24054 |
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