Analyse der Genfunktion und Visualisierung von Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer-Vesicle
Summary
Cilia-generated Fluidströmung in Kupffer-Vesikel (KV) steuert links-rechts Strukturierung des Zebrafisch-Embryos. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Modulation Genfunktion spezifisch in Zellen KV. Darüber hinaus zeigen wir, wie fluoreszierende Kügelchen in KV liefern Strömung zu visualisieren.
Abstract
Inneren Organen wie Herz, Gehirn und Darm entwickeln Links-Rechts-(LR) Asymmetrien, die kritisch für ihre normale Funktion 1 sind. Motile Zilien sind bei der Festlegung LR Asymmetrie in Wirbeltierembryonen, einschließlich Maus, Frosch und Zebrafisch 2-6 beteiligt. Diese "LR Zilien, Generate asymmetrischen Fluidströmung, die erforderlich sind, um eine konservierte asymmetrischen Nodal (TGF-β-Superfamilie) Signalkaskade in der linken Seitenplatte Mesoderm, die vermutlich LR Strukturieren Informationen zum Entwickeln Organen 7 bereitzustellen wird auslösen soll. Somit, um Mechanismen LR Strukturieren zu verstehen, ist es wichtig, Gene, die die Organisation des LR Flimmerzellen, die Motilität und die Länge von LR Zilien und ihrer Fähigkeit, stabile asymmetrische Strömung erzeugen regulieren identifizieren.
In der Zebrafisch-Embryos werden LR Flimmerhärchen in Kupffer-Vesikel (KV) 2,4,5 entfernt. KV ist aus einer einzigen Schicht von Epithelzellen umfaßt monociliateddass ein mit Flüssigkeit gefüllten Hohlraum umschließen. Schicksal Mapping hat gezeigt, dass KV aus einer Gruppe von ~ 20-30 Zellen als dorsalen Vorläuferzellen (DFCs), die an der dorsalen Rand Blastoderm wandern während epiboly Stufen 8,9 bekannt abgeleitet ist. Während der frühen Somiten Stufen, um DFCs Cluster und differenzieren sich in Flimmerepithelzellen KV in der Schwanzknospe des Embryos 10,11 bilden. Die Fähigkeit, zu identifizieren und zu verfolgen DFCs-in Kombination mit optischen Transparenz und rasche Entwicklung des Zebrafisch-Embryos-make Zebrafisch KV ein hervorragendes Modell System LR Flimmerzellen studieren.
Interessanterweise behalten Vorläuferzellen des DFC / KV Zellstammbaums cytoplasmatischen Brücken zwischen dem Eigelb Zelle bis zu 4 Stunden nach der Befruchtung (HPF), während zytoplasmatische Brücken zwischen dem Eigelb Zelle und andere embryonalen Zellen schließen nach 2 hpf 8. Unter Ausnutzung dieser zytoplasmatischen Brücken, entwickelten wir ein Stadium-spezifische Injektion Strategie Morpholino Oligonucleotide liefernotides (MO) ausschließlich DFCs und Knockdown die Funktion eines gerichteten Gens in diesen Zellen 12. Diese Technik schafft chimären Embryos in dem Genfunktion in dem DFC / KV Linie entwickeln im Kontext eines Wildtyp-Embryos wird geklopft. Um asymmetrische Strömung in KV analysieren, injizieren wir fluoreszierenden Mikrokügelchen in den KV Lumen und aufzeichnen bead Bewegung mit Videomikroskopie 2. Fluidströmung einfach visualisiert und können durch die Verfolgung bead Verschiebung im Laufe der Zeit quantifiziert werden.
Hier mit dem stufenspezifischen DFC-Zielgens Knockdown Technik und Injektion von fluoreszierenden Mikrokugeln in KV zu fließen visualisieren stellen wir ein Protokoll, das einen effektiven Ansatz, um die Rolle eines bestimmten Gens während KV Entwicklung und Funktion charakterisieren bereitstellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit stage-spezifischen Injektionen MO dem DFC / KV Zelllinie Ziel ist ein nützlicher Ansatz zur Zell-Autonomie der Genfunktion zu studieren und zu vermeiden pleiotrope Phänotypen verursacht durch die globale Gen knockdown. Allerdings können diese Injektionen technisch anspruchsvoll. Injektion von MO zwischen den 256-Zelle und 1000-Zellen-Stufen können in drei möglichen Ergebnissen führen: 1) die MO bleibt aggregiert an der Injektionsstelle, 2) die MO diffundiert während des Eigelbs und tritt DFC / KV Zellen oder …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Fiona Foley für exzellente lab Unterstützung und Zebrafisch Pflege. Diese Arbeit wurde eine AHA Promotionsstipendium GW (11PRE5730027) und NHLBI Zuschüsse HJY (R01HL66292) und JDA (R01HL095690) unterstützt.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number |
| Standard Control oligo-Lissamine tagged | Gene Tools, LLC | |
| Custom Rock2b morpholino oligo | Gene Tools, LLC | |
| Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres | Polysciences, Inc. | 24054 |
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