ניתוח של תפקוד גן ויזואליזציה של זרימת נוזל צילה שנוצרה בשלפוחיות של Kupffer
Summary
זרימת cilia שנוצר נוזל בשלפוחיות של Kupffer (KV) שולטת דפוסים של שמאל וימין של עובר דג הזברה. כאן, אנו מתארים טכניקה לווסת תפקוד גן ספציפי בתאי KV. בנוסף, אנו מראים כיצד לספק חרוזי ניאון לKV לדמיין זרימת נוזל.
Abstract
איברים פנימיים כגון לב, מוח, מעיים ולפתח סימטריות שמאל ימין (LR) כי הם קריטיים עבור הפונקציות הרגילות שלהם 1. ריסים ניעתי מעורבים בהקמת LR אסימטריה בעוברי החולייתנים, כוללים עכבר, צפרדע, ודג זברה 2-6. "הריסים" הללו LR לייצר זרימת נוזל סימטרית שיש צורך לעורר סימטרי קטרי משומר (TGF-β superfamily) איתות מפל במזודרם צלחת הרוחב מהשמאל, שהוא חשב לספק מידע דפוסי LR לפיתוח איברים 7. לכן, כדי להבין את המנגנונים בבסיס דפוסי LR, זה חיוני לזיהוי גנים ששולטים בארגון של תאי ריסי LR, תנועתיות ואורך ריסי LR והיכולת שלהם לייצר תזרים חזק סימטרי.
בעובר דג הזברה, ריסי LR נמצאים בשלפוחית של Kupffer (KV) 2,4,5. KV מורכב משכבה אחת של תאי האפיתל monociliatedשמצרפים לום מלא נוזל. מיפוי הגורל הראה כי KV נגזר מקבוצה של 20-30 ~ תאים המכונית תאי גב Forerunner (DFCs) שנודדים בשולי blastoderm הגבו במהלך שלבי epiboly 8,9. במהלך השלבים מוקדמים somite, אשכול DFCs ולהתמיין לתאי אפיתל ריסים כדי ליצור KV בtailbud של העובר 10,11. היכולת לזהות ולעקוב אחר DFCs-בשילוב עם שקיפות אופטית והתפתחות מהירה של עובר דג זברת דג הזברה KV-להפוך את מערכת מודל מצוינת ללמוד תאי ריסי LR.
מעניין, אבות של המשפחה של תאי DFC / KV לשמור גשרי cytoplasmic בין תא החלמון עד 4 לאחר הפרית שעה (hpf), ואילו גשרי cytoplasmic בין תא החלמון והתאים עובריים אחרים הקרוב לאחר 2 hpf 8. ניצול של גשרי cytoplasmic אלה, פתחו אסטרטגית הזרקת שלב ספציפית, כדי לספק morpholino oligonucleotides (MO) באופן בלעדי לDFCs ומציאת הפונקציה של גן מטרה בתאים 12 אלה. טכניקה זו יוצרת עוברי chimeric שבתפקוד הגן הוא הפיל אותי בשושלת DFC / KV פיתוח בהקשר של עובר פראי מסוג. כדי לנתח את זרימת נוזל סימטרית בKV, אנחנו מזריקים microbeads ניאון לKV הלום ותנועת חרוז שיא באמצעות videomicroscopy 2. זרימת נוזל בקלות ודמיין ניתן לכמת על ידי מעקב עקירת חרוז לאורך זמן.
הנה, באמצעות טכניקת במה הספציפית DFC ממוקד מציאת הגן וההזרקה של microbeads ניאון לKV לדמיין זרימה, אנו מציגים פרוטוקול המספק גישה יעילה כדי לאפיין את תפקידו של גן מסוים בזמן ההתפתחות ותפקוד KV.
Protocol
Representative Results
Discussion
שימוש בזריקות שלב ספציפיים כדי למקד MO למשפחה של תאי DFC / KV הוא גישה שימושית ללמוד תא האוטונומיה של תפקוד גן ולהימנע פנוטיפים pleiotropic נגרמים על ידי מציאת גנים העולמית. עם זאת, הזריקות האלה יכולות להיות מאתגרות מבחינה טכנית. הזרקה של MO בין שלבי 256-תא והתא 1000 עלולה לגרום לשל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים על תמיכת פיונה פולי מעבדה מצוינת וטיפול דג זברה. עבודה זו נתמכה על מלגת AHA predoctoral לGW (11PRE5730027) ומענקי NHLBI לHJY (R01HL66292) ורשות לפיתוח ירושלים (R01HL095690).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number |
| Standard Control oligo-Lissamine tagged | Gene Tools, LLC | |
| Custom Rock2b morpholino oligo | Gene Tools, LLC | |
| Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres | Polysciences, Inc. | 24054 |
References
- Sutherland, M. J., Ware, S. M. Disorders of left-right asymmetry: heterotaxy and situsinversus. Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 151C (4), 307-317 (2009).
- Essner, J. J., Amack, J. D., Nyholm, M. K., Harris, E. B., Yost, H. J. Kupffer’s vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut. Development. 132 (6), 1247-1260 (2005).
- Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
- Essner, J. J., et al. Conserved function for embryonic nodal cilia. Nature. 418 (6893), 37-38 (2002).
- Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer’s vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132 (8), 1907-1921 (2005).
- Schweickert, A., et al. Cilia-driven leftward flow determines laterality in Xenopus. Curr. Biol. 17 (1), 60-66 (2007).
- Tabin, C. J. The key to left-right asymmetry. Cell. 127 (1), 27-32 (2006).
- Cooper, M. S., D’Amico, L. A. A cluster of noninvolutingendocytic cells at the margin of the zebrafish blastoderm marks the site of embryonic shield formation. Dev. Biol. 180 (1), 184-198 (1996).
- Melby, A. E., Warga, R. M., Kimmel, C. B. Specification of cell fates at the dorsal margin of the zebrafish gastrula. Development. 122 (7), 2225-2237 (1996).
- Amack, J. D., Wang, X., Yost, H. J. Two T-box genes play independent and cooperative roles to regulate morphogenesis of ciliated Kupffer’s vesicle in zebrafish. Dev. Biol. 310 (2), 196-210 (2007).
- Oteiza, P., Koppen, M., Concha, M. L., Heisenberg, C. P. Origin and shaping of the laterality organ in zebrafish. Development. 135 (16), 2807-2813 (2008).
- Amack, J. D., Yost, H. J. The T box transcription factor no tail in ciliated cells controls zebrafish left-right asymmetry. Curr. Biol. 14 (8), 685-690 (2004).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat. Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
- Kimmel, C. B., Law, R. D. Cell lineage of zebrafish blastomeres. I. Cleavage pattern and cytoplasmic bridges between cells. Dev. Biol. 108 (1), 78-85 (1985).
- Arrington, C. B., Yost, H. J. Extra-embryonic syndecan 2 regulates organ primordia migration and fibrillogenesis throughout the zebrafish embryo. Development. 136 (18), 3143-3152 (2009).
- Caron, A., Xu, X., Lin, X. Wnt/beta-catenin signaling directly regulates Foxj1 expression and ciliogenesis in zebrafish Kupffer’s vesicle. Development. 139 (3), 514-524 (2012).
- Wang, G., et al. The Rho kinase Rock2b establishes anteroposterior asymmetry of the ciliated Kupffer’s vesicle in zebrafish. Development. 138 (1), 45-54 (2011).
- Aamar, E., Dawid, I. B. Sox17 and chordin are required for formation of Kupffer’s vesicle and left-right asymmetry determination in zebrafish. Dev. Dyn. 239 (11), 2980-2988 (2010).
- Neugebauer, J. M., Amack, J. D., Peterson, A. G., Bisgrove, B. W., Yost, H. J. FGF signalling during embryo development regulates cilia length in diverse epithelia. Nature. 458 (7238), 651-654 (2009).
- Schneider, I., et al. Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right patterning. Dev. Biol. 348 (1), 22-33 (2010).
- Matsui, T., et al. Canopy1, a positive feedback regulator of FGF signaling, controls progenitor cell clustering during Kupffer’s vesicle organogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), 9881-9886 (2011).
- Shu, X., et al. Na,K-ATPase alpha2 and Ncx4a regulate zebrafish left-right patterning. Development. 134 (10), 1921-1930 (2007).
- Esguerra, C. V. Ttrap is an essential modulator of Smad3-dependent Nodal signaling during zebrafish gastrulation and left-right axis determination. Development. 134 (24), 4381-4393 (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning. Development. 135 (1), 75-84 (2008).
- Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish. Development. 138 (2), 291-302 (2011).
- Matsui, T., Bessho, Y. Left-right asymmetry in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. , (2012).
