クッパー胞における遺伝子機能と繊毛発生する流体の流れの可視化の分析
Summary
クッパー胞の繊毛で生成された流体の流れ（KV）はゼブラフィッシュ胚の左右パターン形成を制御します。ここでは、KVの細胞に特異的に遺伝子の機能を調節するための手法について説明します。また、流体の流れを可視化するためにKVに蛍光ビーズを提供する方法を示しています。
Abstract
例えば、心臓、脳、腸などの内臓が正常な機能にとって重要である1左右（LR）非対称性を開発しています。運動性繊毛はLRの確立に関与しているマウス、カエル、ゼブラフィッシュ2月6日を含む、脊椎動物の胚の非対称性。これらの'のLR繊毛は'器官7を開発するためのLRパターニング情報を提供すると考えられている左側側板中胚葉、内カスケードのシグナル伝達に保存された非対称節点（TGF-βスーパーファミリー）をトリガすることが必要である非対称の流体の流れを生成します。このように、LRのパターニングのメカニズムを理解するためには、それはLR繊毛細胞の組織、LRの繊毛の運動性と長さと堅牢な非対称フローを生成する能力を制御する遺伝子を同定することが不可欠である。
ゼブラフィッシュ胚に、LR繊毛でクッパー胞（KV）2,4,5に配置されています。 KVはmonociliated上皮細胞の単層で構成されていますそれは液体で満たされた腔を囲みます。運命のマッピングはKVが被包ステージ8,9の間に背の胚盤葉縁に移行背先駆細胞（DFCが）として知られている〜20から30細胞群に由来することが示されている。初期の体節の段階では、DFCは、クラスタと繊毛上皮細胞への分化は、胚10,11の尾芽にKVを形成する。ゼブラフィッシュの光学的透明性と迅速な開発とDFCはインの組み合わせを特定して追跡する能力ゼブラKV LR繊毛細胞を研究するための優れたモデル系胚作る。
興味深いことに、DFC / KV細胞系列の前駆細胞は卵黄細胞と2 HPF 8後の近い他の胚細胞の間に細胞質の橋のに対し、最大4時間、受精後（HPF）に卵黄細胞の間に細胞質の橋を保持します。これらの細胞質の橋を生かし、我々は、モルホリノoligonucleを提供するためにステージ固有の注射戦略を策定DFCは、ノックダウン、これらのセル12における標的遺伝子の機能にもっぱらotides（MO）。この手法は、遺伝子の機能が野生型胚の文脈で発展DFC / KV系統でノックダウンさせたキメラ胚を作成します。 KVにおける不斉の流体の流れを分析するために、我々は、KVルーメンとビデオ顕微鏡2を使用してレコードビーズ運動に蛍光マイクロビーズを注入します。流体の流れを簡単に可視化され、時間をかけてビーズの変位を追跡することにより定量することができる。
ここでは、ステージ固有のDFC-標的遺伝子ノックダウン技術と流れを可視化するためのKVへの蛍光ビーズの注入を使用して、我々は、KVの発達と機能の間の特定の遺伝子の役割を特徴付けるための効果的なアプローチを提供するプロトコルを提案する。
Protocol
Representative Results
Discussion
DFC / KV細胞系譜にMOをターゲットにステージ固有の注射を使用すると、遺伝子機能の細胞自律性を検討し、全体的な遺伝子ノックダウンによって引き起こされる多面的な表現型を回避するための有用なアプローチである。しかし、これらの注射は技術的に挑戦することができます。 1）MOは卵黄全体2）MOの拡散、注射部位で集計ままおよびDFC / KVセルまたは3に入る）MO：256セル、1,000細胞ステー…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、優れた研究室のサポートやゼブラフィッシュのケアのためのフィオナ·フォーリーに感謝します。この作品は、GWにAHAの博士号を取得する前のフェローシップ（11PRE5730027）とHJY（R01HL66292）と防衛庁（R01HL095690）へNHLBIの助成金をサポートされていました。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number |
| Standard Control oligo-Lissamine tagged | Gene Tools, LLC | |
| Custom Rock2b morpholino oligo | Gene Tools, LLC | |
| Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres | Polysciences, Inc. | 24054 |
References
- Sutherland, M. J., Ware, S. M. Disorders of left-right asymmetry: heterotaxy and situsinversus. Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 151C (4), 307-317 (2009).
- Essner, J. J., Amack, J. D., Nyholm, M. K., Harris, E. B., Yost, H. J. Kupffer’s vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut. Development. 132 (6), 1247-1260 (2005).
- Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
- Essner, J. J., et al. Conserved function for embryonic nodal cilia. Nature. 418 (6893), 37-38 (2002).
- Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer’s vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132 (8), 1907-1921 (2005).
- Schweickert, A., et al. Cilia-driven leftward flow determines laterality in Xenopus. Curr. Biol. 17 (1), 60-66 (2007).
- Tabin, C. J. The key to left-right asymmetry. Cell. 127 (1), 27-32 (2006).
- Cooper, M. S., D’Amico, L. A. A cluster of noninvolutingendocytic cells at the margin of the zebrafish blastoderm marks the site of embryonic shield formation. Dev. Biol. 180 (1), 184-198 (1996).
- Melby, A. E., Warga, R. M., Kimmel, C. B. Specification of cell fates at the dorsal margin of the zebrafish gastrula. Development. 122 (7), 2225-2237 (1996).
- Amack, J. D., Wang, X., Yost, H. J. Two T-box genes play independent and cooperative roles to regulate morphogenesis of ciliated Kupffer’s vesicle in zebrafish. Dev. Biol. 310 (2), 196-210 (2007).
- Oteiza, P., Koppen, M., Concha, M. L., Heisenberg, C. P. Origin and shaping of the laterality organ in zebrafish. Development. 135 (16), 2807-2813 (2008).
- Amack, J. D., Yost, H. J. The T box transcription factor no tail in ciliated cells controls zebrafish left-right asymmetry. Curr. Biol. 14 (8), 685-690 (2004).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat. Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
- Kimmel, C. B., Law, R. D. Cell lineage of zebrafish blastomeres. I. Cleavage pattern and cytoplasmic bridges between cells. Dev. Biol. 108 (1), 78-85 (1985).
- Arrington, C. B., Yost, H. J. Extra-embryonic syndecan 2 regulates organ primordia migration and fibrillogenesis throughout the zebrafish embryo. Development. 136 (18), 3143-3152 (2009).
- Caron, A., Xu, X., Lin, X. Wnt/beta-catenin signaling directly regulates Foxj1 expression and ciliogenesis in zebrafish Kupffer’s vesicle. Development. 139 (3), 514-524 (2012).
- Wang, G., et al. The Rho kinase Rock2b establishes anteroposterior asymmetry of the ciliated Kupffer’s vesicle in zebrafish. Development. 138 (1), 45-54 (2011).
- Aamar, E., Dawid, I. B. Sox17 and chordin are required for formation of Kupffer’s vesicle and left-right asymmetry determination in zebrafish. Dev. Dyn. 239 (11), 2980-2988 (2010).
- Neugebauer, J. M., Amack, J. D., Peterson, A. G., Bisgrove, B. W., Yost, H. J. FGF signalling during embryo development regulates cilia length in diverse epithelia. Nature. 458 (7238), 651-654 (2009).
- Schneider, I., et al. Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right patterning. Dev. Biol. 348 (1), 22-33 (2010).
- Matsui, T., et al. Canopy1, a positive feedback regulator of FGF signaling, controls progenitor cell clustering during Kupffer’s vesicle organogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), 9881-9886 (2011).
- Shu, X., et al. Na,K-ATPase alpha2 and Ncx4a regulate zebrafish left-right patterning. Development. 134 (10), 1921-1930 (2007).
- Esguerra, C. V. Ttrap is an essential modulator of Smad3-dependent Nodal signaling during zebrafish gastrulation and left-right axis determination. Development. 134 (24), 4381-4393 (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning. Development. 135 (1), 75-84 (2008).
- Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish. Development. 138 (2), 291-302 (2011).
- Matsui, T., Bessho, Y. Left-right asymmetry in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. , (2012).
