Analyse av gen-funksjon og visualisering av Cilia-generert Væskestrøm i Kupffer sin Vesikkel

Summary

Cilia-genererte strømning i Kupffer sin Vesikkel (KV) styrer venstre-høyre mønster av sebrafisk embryo. Her beskriver vi en teknikk å modulere genfunksjon spesifikt i kV celler. I tillegg viser vi hvordan å levere fluorescerende perler inn KV å visualisere fluidstrømning.

Abstract

Indre organer som hjerte, hjerne, og gut utvikle venstre-høyre (LR) asymmetrier som er kritiske for sine normale funksjoner ^en. Bevegelige flimmerhårene er involvert i å etablere LR asymmetri i virveldyr embryoer, inkludert mus, frosk, og sebrafisk ^2-6. Disse "LR cilia 'generere asymmetrisk væskestrømmen som er nødvendig for å utløse en konservert asymmetrisk Nodal (TGF-β superfamily) signaliserer cascade i venstre lateral plate mesoderm, som er tenkt å gi LR mønster for utformingen organer ^7. Derfor, for å forstå mekanismene bak LR mønster, er det viktig å identifisere gener som regulerer organiseringen av LR ciliated celler, motilitet og lengden LR cilia og deres evne til å generere robuste asymmetrisk flyt.

I sebrafisk embryo, er LR flimmerhårene ligger i Kupffer sin vesikkel (KV) ^2,4,5. KV består av et enkelt lag av monociliated epitelcellersom omslutter en væskefylt hulrom. Fate kartlegging har vist at KV er avledet fra en gruppe av ~ 20-30 celler kjent som dorsal forløperen celler (DFCS) som vandrer på dorsal blastoderm marginen under epiboly stadier ^8,9. Under tidlig somitt stadier, til DFCS klynge og skille ut ciliated epitelceller danne KV i tailbud av embryoet ^10,11. Evnen til å identifisere og spore DFCS-i kombinasjon med optisk åpenhet og rask utvikling av sebrafisk embryo-make sebrafisk KV en utmerket modellsystem for å studere LR ciliated celler.

Interessant, stamfedre av DFC / KV celle avstamning beholde cytoplasmatiske broer mellom eggeplomme celle opp til 4 timers post-fertilisering (HPF), mens cytoplasmatiske broer mellom eggeplomme celle og andre embryonale celler tett etter to HPF ^8. Dra nytte av disse cytoplasmatiske broer, har vi utviklet en scene-spesifikk injeksjon strategi om å levere morfolino oligonucleotides (MO) utelukkende DFCS og knockdown funksjonen til en målrettet genet i disse cellene ^12. Denne teknikken skaper kimære embryoer som gen-funksjon er slått ned i DFC / KV avstamning utvikling i sammenheng med en vill-type embryo. Å analysere asymmetrisk strømning i KV, injiserer vi fluorescerende mikroperler i KV lumen og ta perle bevegelse ved hjelp videomicroscopy ^2. Fluidstrømmen er lett visualisert og kan kvantifiseres ved å spore perle fortrengning over tid.

Her, ved hjelp av scenen-spesifikk DFC målrettede genet knockdown teknikk og injeksjon av fluorescerende mikroperler inn KV å visualisere flyten presenterer vi en protokoll som gir en effektiv tilnærming for å karakterisere rollen av en bestemt gen under KV utvikling og funksjon.

Protocol

Oversikt over Stage-spesifikke sebrafisk embryo injeksjoner Antisens Morpholino oligonukleotider (MO), som binder seg til en målrettet mRNA og forstyrre protein uttrykk fra at avskrift, er mye brukt i gene knockdown (tap-av-funksjon) studier i sebrafisk 13,14. Gene Tools, tilbyr LLC MOS som er merket med enten karboksyfluorescens (avgir grønn fluorescens) eller lissamine (avgir rød fluorescens) for å oppdage MO i injisert embryoer med fluorescerende mikroskopi. Ved å injisere MO…

Representative Results

Stage-spesifikke MO injeksjoner gi en nyttig tilnærming å analysere genfunksjon i bestemte avdelinger av embryoet. Figur 1 viser et flytskjema over de injeksjon strategier benyttes for å teste genfunksjon i DFC / KV celler og hvordan å introdusere fluorescerende perler å visualisere fluidstrømning i KV. Fordelingen av fluorescerende MO i vellykkede stadium-spesifikke injisert embryoer er vist skjematisk i figurene 1D-F og i levende embryoer i Figur 2. En mislykket…

Discussion

Bruke scene-spesifikke injeksjoner for å målrette MO til DFC / KV celle avstamning er en god metode for å studere celle-autonomi genfunksjon og unngå mitogen fenotyper forårsaket av global gene knockdown. Imidlertid kan disse injeksjonene være teknisk utfordrende. Injeksjon av MO mellom 256-celle og 1000-celle stadier kan resultere i tre mulige utfall: 1) MO forblir samlet på injeksjonsstedet, 2) Mo diffunderer gjennom eggeplomme og går DFC / KV celler eller 3) Mo diffunderer gjennom eggeplomme og inngår DFC / …

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number
Standard Control oligo-Lissamine tagged	Gene Tools, LLC
Custom Rock2b morpholino oligo	Gene Tools, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres	Polysciences, Inc.	24054