Analys av geners funktion och Visualisering av Cilia-genererade vätskeflöde i Kupffer s vesikel
Summary
Cilia genererade vätskeflöde i Kupffer s vesikel (KV) styr vänster-höger mönstring av zebrafisk embryot. Här beskriver vi en teknik för att modulera genfunktion specifikt i KV celler. Dessutom visar vi hur man levererar fluorescerande pärlor i KV att visualisera vätskeflöde.
Abstract
Inre organ som hjärta, hjärna och tarm utvecklar vänster-höger (LR) asymmetrier som är kritiska för deras normala funktioner 1. Rörliga flimmerhår är involverade i upprättandet LR asymmetri i ryggradsdjur embryon, inklusive mus, groda, och zebrafisk 2-6. Dessa "LR cilier 'generera asymmetrisk fluidflöde som är nödvändig för att utlösa en konserverad asymmetrisk Nodal (TGF-β superfamiljen) signaleringskaskad i den vänstra sidoplattan mesoderm, vilket är tänkt att ge LR mönstring information för att utveckla organ 7. Således, för att förstå mekanismerna bakom LR mönstring, är det viktigt att identifiera gener som reglerar organisationen av LR cilierade celler, motilitet och längd LR cilier och deras förmåga att generera robusta asymmetriska flödet.
I zebrafisk embryo är LR cilier ligger i Kupffer s vesikler (KV) 2,4,5. KV består av ett enda skikt av monociliated epitelcellersom innesluter en vätskefyllda hålrum. Ödet kartläggning har visat att KV är härledd från en grupp av ~ 20-30 celler kända som dorsala föregångaren celler (DFCS) som migrerar vid den dorsala BLASTODERM marginalen under epiboly stegen 8,9. Under tidiga somit stadier, till DFCS kluster och differentierar till cilierade epitelceller bilda KV i tailbud av embryot 10,11. Förmågan att identifiera och spåra DFCS-i kombination med optisk transparens och snabb utveckling av zebrafisk embryo-make zebrafisk KV en utmärkt modell för att studera LR cilierade celler.
Intressant stamfäder DFC / KV cellhärstamning behåller cytoplasmiska broar mellan äggula cellen upp till 4 timmar efter befruktning (HPF), medan cytoplasmiska broar mellan äggulan cellen och andra embryonala celler nära efter 2 HPF 8. Med utnyttjande av dessa cytoplasmiska broar, utvecklade vi en scen-specifik injektion strategi att leverera morfolino oligonucleotides (MO) uteslutande DFCS och knockdown funktionen av en riktad gen i dessa celler 12. Denna teknik skapar chimära embryon som genfunktion slås ned i DFC / KV härstamning utvecklas inom ramen för en vildtyp embryo. För att analysera asymmetrisk vätskeflöde i KV, injicera vi fluorescerande mikropärlor till KV lumen och spela pärla rörelse med videomicroscopy 2. Fluidflöde är lätt visualiseras och kan kvantifieras genom att spåra vulst förskjutning över tiden.
Här, med hjälp av steg-specifika DFC-riktad teknik gen ÖVERVÄLDIGANDE och injektion av fluorescerande mikropärlor i KV att visualisera flödet presenterar vi ett protokoll som ger en effektiv metod för att karakterisera den roll en speciell gen under KV utveckling och funktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Använda steg-specifika injektioner att rikta MO till DFC / KV cellhärstamning är en användbar metod för att studera cell-autonomi geners funktion och undvika pleiotropa fenotyper som orsakas av den globala gen knockdown. Dock kan dessa injektioner vara tekniskt utmanande. Injektion av MO mellan de 256-cell och 1.000-cell steg kan resultera i tre möjliga utfall: 1) MO förblir aggregeras vid injektionsstället, 2) Mo diffunderar hela gulan och går DFC / KV celler eller 3) i MO diffunderar i hela gulan och går in …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Fiona Foley för utmärkt labb stöd och zebrafisk vård. Detta arbete stöddes en AHA predoctoral gemenskap GW (11PRE5730027) och NHLBI bidrag till HJY (R01HL66292) och JDA (R01HL095690).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number |
| Standard Control oligo-Lissamine tagged | Gene Tools, LLC | |
| Custom Rock2b morpholino oligo | Gene Tools, LLC | |
| Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres | Polysciences, Inc. | 24054 |
References
- Sutherland, M. J., Ware, S. M. Disorders of left-right asymmetry: heterotaxy and situsinversus. Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 151C (4), 307-317 (2009).
- Essner, J. J., Amack, J. D., Nyholm, M. K., Harris, E. B., Yost, H. J. Kupffer’s vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut. Development. 132 (6), 1247-1260 (2005).
- Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
- Essner, J. J., et al. Conserved function for embryonic nodal cilia. Nature. 418 (6893), 37-38 (2002).
- Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer’s vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132 (8), 1907-1921 (2005).
- Schweickert, A., et al. Cilia-driven leftward flow determines laterality in Xenopus. Curr. Biol. 17 (1), 60-66 (2007).
- Tabin, C. J. The key to left-right asymmetry. Cell. 127 (1), 27-32 (2006).
- Cooper, M. S., D’Amico, L. A. A cluster of noninvolutingendocytic cells at the margin of the zebrafish blastoderm marks the site of embryonic shield formation. Dev. Biol. 180 (1), 184-198 (1996).
- Melby, A. E., Warga, R. M., Kimmel, C. B. Specification of cell fates at the dorsal margin of the zebrafish gastrula. Development. 122 (7), 2225-2237 (1996).
- Amack, J. D., Wang, X., Yost, H. J. Two T-box genes play independent and cooperative roles to regulate morphogenesis of ciliated Kupffer’s vesicle in zebrafish. Dev. Biol. 310 (2), 196-210 (2007).
- Oteiza, P., Koppen, M., Concha, M. L., Heisenberg, C. P. Origin and shaping of the laterality organ in zebrafish. Development. 135 (16), 2807-2813 (2008).
- Amack, J. D., Yost, H. J. The T box transcription factor no tail in ciliated cells controls zebrafish left-right asymmetry. Curr. Biol. 14 (8), 685-690 (2004).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat. Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
- Kimmel, C. B., Law, R. D. Cell lineage of zebrafish blastomeres. I. Cleavage pattern and cytoplasmic bridges between cells. Dev. Biol. 108 (1), 78-85 (1985).
- Arrington, C. B., Yost, H. J. Extra-embryonic syndecan 2 regulates organ primordia migration and fibrillogenesis throughout the zebrafish embryo. Development. 136 (18), 3143-3152 (2009).
- Caron, A., Xu, X., Lin, X. Wnt/beta-catenin signaling directly regulates Foxj1 expression and ciliogenesis in zebrafish Kupffer’s vesicle. Development. 139 (3), 514-524 (2012).
- Wang, G., et al. The Rho kinase Rock2b establishes anteroposterior asymmetry of the ciliated Kupffer’s vesicle in zebrafish. Development. 138 (1), 45-54 (2011).
- Aamar, E., Dawid, I. B. Sox17 and chordin are required for formation of Kupffer’s vesicle and left-right asymmetry determination in zebrafish. Dev. Dyn. 239 (11), 2980-2988 (2010).
- Neugebauer, J. M., Amack, J. D., Peterson, A. G., Bisgrove, B. W., Yost, H. J. FGF signalling during embryo development regulates cilia length in diverse epithelia. Nature. 458 (7238), 651-654 (2009).
- Schneider, I., et al. Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right patterning. Dev. Biol. 348 (1), 22-33 (2010).
- Matsui, T., et al. Canopy1, a positive feedback regulator of FGF signaling, controls progenitor cell clustering during Kupffer’s vesicle organogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), 9881-9886 (2011).
- Shu, X., et al. Na,K-ATPase alpha2 and Ncx4a regulate zebrafish left-right patterning. Development. 134 (10), 1921-1930 (2007).
- Esguerra, C. V. Ttrap is an essential modulator of Smad3-dependent Nodal signaling during zebrafish gastrulation and left-right axis determination. Development. 134 (24), 4381-4393 (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning. Development. 135 (1), 75-84 (2008).
- Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish. Development. 138 (2), 291-302 (2011).
- Matsui, T., Bessho, Y. Left-right asymmetry in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. , (2012).
