تصور miniSOG معلم البروتينات إصلاح الحمض النووي في الجمع مع الكترون طيفية تصوير (ESI)
Summary
Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.
Abstract
وكانت حدود لقرار بصري وتحدي تحديد السكان بروتين معين في المجهر الإلكتروني انتقال العقبات في علم الأحياء الخلوي. العديد من الظواهر لا يمكن تفسيره في المختبر تحليل نظم مبسطة وتحتاج المعلومات الهيكلية إضافية في الموقع، وخاصة في نطاق بين 1 نانومتر و 0.1 ميكرون، من أجل أن تكون مفهومة تماما. هنا، والتصوير الطيفي الإلكترون، وهي تقنية المجهر الإلكتروني النافذ الذي يسمح رسم الخرائط في وقت واحد لتوزيع البروتينات والأحماض النووية، وعلامة التعبير، miniSOG، يتم الجمع بين لدراسة بنية وتنظيم DNA مزدوج الجديلة إصلاح كسر البؤر.
Introduction
وعلى الرغم من التقدم الكبير في المجهر الضوئي خلال السنوات الأخيرة 1، خلية علماء الأحياء لا تزال تعاني من فجوة في القرار. هذا يحد من فهم العلاقات هيكل الوظائف في العمليات الخلوية الأساسية التي تنطوي على تفاعل منسق بين المجمعات الجزيئات (على سبيل المثال، في إعادة لونين، وإصلاح DNA، RNA النسخ والتكرار DNA). على الرغم من المجاهر الإلكترونية الإرسال (TEM) ق تقديم القرار المطلوب، فقد كان تحديا لتعريف هذه العمليات من الناحية الهيكلية بسبب عدم القدرة على تسمية بروتينات معينة في حين يجري أيضا قادرة على تحديد التركيب الكيميائي الحيوي للهياكل تصور. في غياب الأغشية الداخلية للمساعدة في التفريق الهياكل النووية، كانت نواة تحديا من نوع خاص. الإلكترون الطيفية التصوير (ESI) يحل بعض هذه القيود من خلال السماح للكشف في وقت واحد والتفريق بين DNA، RNA، والبروتوكول الاضافيهياكل النووية 2-5 عين المستندة إلى
الإلكترون التصوير الطيفي:
من أجل خريطة توزيعات عنصري في حساسية عالية ودقة في المجهر الإلكتروني، يمكن للمرء استخدام مطياف التصوير التي يختار الإلكترونات التي تشتتت inelastically من خلال التفاعل مع الإلكترونات قذيفة الداخلية عنصر في العينة 6. بسبب فقدان كميات عنصر معين من الطاقة نتيجة للتأين الذرات في العينة، وهذه الإلكترونات يمكن فصلها وتصور باستخدام مطياف التي يتم تركيبها على المجهر الالكتروني. وهكذا، تحليل الطيف من الإلكترونات التي تفاعلت مع العينة يكشف عن معلومات نوعية وكمية عن التركيب العنصري للعينة 7. تم العثور على الإلكترونات التي لا تفقد الطاقة عندما تمر العينة في "عدم الخسارة الذروة" من فقدان الطاقة الإلكترونالطيف. يرتبط وفرة من هذه الإلكترونات إلى الكتلة والكثافة وسمك العينة، وتتألف من الإلكترونات التي تمر من خلال عينة من دون الاصطدام مع العينة أو فقدان الطاقة أثناء مرورها من خلال العينة. يمكن أن تكون هذه المعلومات مفيدة لتقدير المطلق للأعداد ذرات عنصر معين موجود في العينة 8.
منذ العينات البيولوجية تتكون في معظمها من العناصر الخفيفة التي تحرف سيئة الإلكترونات في شعاع حادثة TEM، وأساليب تلطيخ باستخدام أملاح المعادن الثقيلة يجب أن تطبق من أجل توليد التباين في العينة. عدم وجود خصوصية لمعظم هذه العوامل المتناقضة وعدم القدرة على تصور وصمة عار أكثر من حيث خصوصية ممكنة قد حد من قيمة المجهر الإلكتروني التقليدية في دراسة النواة. ESI له مزايا هامة على TEM التقليدية، وخاصة لدراسة هياكل نواة الخلية.فمن الممكن لاستغلال الطبيعة الفسفور الغني DNA- والمجمعات الجزيئات التي تحتوي على الحمض النووي الريبي للتمييز مجمعات البروتين النووي من المجمعات البروتين ولحل مجمعات البروتين النووي مختلفة على أساس كثافتها من الأحماض النووية. ولا يمكن تصوير المواد البيولوجية المتبقية على أساس وفرة من النيتروجين. رسم الخرائط فقط هذين العنصرين وتحليل توزيعها والوفرة النسبية داخل هياكل تشريحية مختلفة توفر لنا الكثير من المعلومات حول النواة. على سبيل المثال، فإنه من السهل تحديد لونين وريبوسوم في الخريطة تمثل وفرة الفوسفور. مساحة interchromatin والمجمعات المسام النووية، والهيئات النووية، من ناحية أخرى، يمكن أن يتم الكشف بسهولة في الخريطة النيتروجين الصورة.
مصغرة النظام مولد الاوكسجين القميص (miniSOG)
في حين ESI يمثل تقنية قوية لدراسة الموقع هيكل لونين في ليستغرقالصورة الاستفادة من نسب مميزة في التركيب العنصري بين الفوسفور والنيتروجين وتكوين عنصر لا يمكن في العادة يستخدم للتمييز بين مجموعات مختلفة من المجمعات البروتين. الأجسام المضادة المسمى مع جزيئات الذهب الصغيرة في نطاق نانومتر وقد استخدمت على نطاق واسع لرسم خريطة للموقع الجزيئات الفردية. منذ عادة يتم إرفاق الجسيمات الذهب إلى الضد الثانوية، وسوف تظهر ضمن محيط من حوالي 20 نانومتر حول حاتمة الكشف عنها بواسطة الأجسام المضادة الأولية. في عينات بعد التضمين، يمكن أن الأجسام المضادة كشف فقط الحواتم التي يتم كشفها على سطح الأجزاء. في حين أنه من الممكن أن يثبت وجود مستضد وربطها بنية تشريحية معينة من الخلايا، فإن المعلومات التي يتم الحصول عليها غير كاملة، حيث يتم حجب معظم الحواتم التي كتبها الراتنج. التقنيات التي تستخدم بروتوكولات مماثلة لتلك المستخدمة في مضان المجهري قبل التضمين، تسمح بالوصول إلى المستضدات في جميع أنحاءعمق الكامل للعينة لكن الخطوات permeabilization المطلوبة للسماح للأجسام المضادة لاختراق الخلية عادة ما تتطلب إزالة الأغشية الدهنية وإزالة المكونات التي لا يمكن إصلاحها من خلال الألدهيدات. وعلاوة على ذلك، تثبيتي ألدهيد المفضل للحفاظ التركيب الدقيق، غلوتارالدهيد، ويدمر عادة الحواتم، وبالتالي مطلوب امتصاص العرق عادة. هذا هو أقل فعالية في البروتين البروتين يشابك. عيب آخر من الأجسام المضادة التي وصفت مع جسيمات متناهية الصغر الذهب أن الذهب هو مادة الإلكترون كثيفة جدا أن يخلق تناقضا واضحا أن يمكن أن يحجب تفاصيل الهيكلية مثيرة للاهتمام من العينة، والتي على النقيض أضعف.
ظهور البروتين الفلوري الأخضر (GFP) كما علامة البروتين أعرب حولت استخدام المجهر مضان الإجابة على الأسئلة في علم الأحياء الخلوي. علامات بروتين مع مجال الفلورسنت صغير يسمح رسم خرائط لتوزيعه في الجسم الحي </eم> دون الحاجة إلى إجراءات permeabilization التي يمكن أن تغير هيكل. من أجل ترجمة مبدأ أنيقة من استخدام علامات البروتين لخريطة توزيع البروتين في خلية لالمجهر الإلكتروني، وبحاجة إلى نظام قادر على إنتاج وثيقة إشارة إلى بنية الفائدة وتوليد التباين في TEM. diaminobenzidine بلمرة وصمة التي كثيرا ما تستخدم في الأنسجة للكشف عن الأجسام المضادة ملزمة. وعادة ما يتم إيداع هذه وصمة عار باستخدام البيروكسيديز الفجل (HRP) مترافق إلى الضد الثانوية. على الرغم من أن رد فعل ينتج نتيجة موثوق بها، HRP غير نشطة تحفيزيا في العصارة الخلوية للخلايا 9. هذه المنتجات يمكن أن رد فعل HRP أيضا منتشر بعيدا من موقع جيل بحيث حلها هو أسوأ من طريقة nanogold 10. من أجل تجاوز هذه المشاكل، تم تطوير نظام فلاش / ReAsH 11. وهو يتألف من البروتينات الانصهار المؤتلف التي تمتلك عزر tetracysteine. هذا عزر يسمح ملزمة للوfluorophore biarsenic. عندما متحمس، ومضة المربوطة أو ReAsH قادر على توليد الأكسجين القميص شديدة التفاعل وdiaminobenzidine بالتالي photoconvert (DAB) إلى البوليمر الذي يترسب على الفور في موقع البروتينات الموسومة. يمكن أن تكون ملطخة البوليمر DAB مع رباعي أكسيد الأوزميوم، وهي كثيفة الإلكترون وبالتالي يمكن استخدامها لخريطة توزيع انصهار بروتين المؤتلف في TEM.
في عام 2011، شو وآخرون 10 قدم نظام miniSOG، والذي يتألف من 106 الأمينية الصغيرة علامة الأحماض الانصهار مشتقة من بروتين فلافيني من نبات الأرابيدوبسيس هذا هو فلوري وقادرة على خلق العديد من المتطرفين الأكسجين القميص عندما متحمس مع 448 الضوء الأزرق نانومتر. تلك الجذور الأكسجين القميص يمكن أن تستخدم لالصور أكسدة diaminobenzidine لتشكيل البوليمرات في وبالقرب من سطح البروتين الموسومة، والتي هي أقرب بكثير من الأجسام المضادة المسمى immunogold 11. في حين أن نظام فلاش / ReAsH يتطلب يصل الفلوريةالكروم وdiaminobenzidine إلى خلايا قبل القيام photoconversion، ونظام miniSOG يتطلب سوى diaminobenzidine والضوء وبالإضافة إلى ذلك حوالي الفعال مرتين كما في البلمرة diaminobenzidine. هنا، يعمل miniSOG في تركيبة مع ESI من أجل رسم خريطة التركيب الدقيق للإصلاح الحمض النووي البؤر.
إصلاح الحمض النووي بؤر (DRF)
DNA دون اصلاح فواصل حبلا مزدوجة تشكل تهديدا خطيرا للخلية لأنها يمكن أن تؤدي إلى نقل المواقع وفقدان المعلومات الوراثية. وهذا بدوره يمكن أن يؤدي إلى الشيخوخة، والسرطان، وموت الخلايا. العديد من البروتينات التي تشارك في الحمض النووي المزدوج إصلاح كسر حبلا تتراكم في البؤر التي تجمع حول حبلا مزدوج DNA كسر 12-14. على الرغم من وظيفتها غير معروف، إلا أنها تمثل الموقع في النواة التي تحتوي على الحمض النووي المزدوج كسر حبلا وغير موقع من الحمض النووي حبلا مزدوجة إصلاح كسر.
إصلاح الحمض النووي لجنة مسؤولي المنتدىوقد اتسمت ط (DRF) بواسطة المجهر مضان وأنها بمثابة المؤشرات الحيوية للتلف الحمض النووي 12،15. فهي نسبية كبيرة لحجم كسر مزدوج الجديلة واعتبرت متجانسة نسبيا حتى كشفت الدراسات الحديثة المجهر فائقة الدقة بعض الأدلة على التقسيم الفرعي للجزيئات في كل تركيز 16. من أجل فهم كيفية تنظيم هذه المواقع، لا بد من تصور كل من الهياكل البيولوجية الأساسية بالنسبة لبعضها البعض. لا يمكن أن يتحقق ذلك عن طريق الفحص المجهري مضان ولكن من الممكن من خلال المجهر الإلكتروني 17،18. هنا، يتم وصف أسلوب يجمع بين الإلكترون التصوير الطيفي مع أسلوب miniSOG لتوضيح إمكانات هذا النهج جنبا إلى جنب لاستكشاف التركيب الدقيق للDNA مزدوج الجديلة إصلاح كسر.
Protocol
Representative Results
Discussion
ESI يمكن أن تكون بمثابة أداة ممتازة لفحص حالات مختلفة من لونين وribonucleoproteins في النواة لأنه قادر على خريطة المناطق التي هي غنية في الفوسفور على وجه التحديد. وهو يعزز بشكل كبير من كمية التفاصيل التي يمكن الحصول عليها عن طريق المجهر الالكتروني وليس اعتمادا على الأساليب الم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Roger Tsien for providing us with the miniSOG constructs. Dr. Xuejun Sun for help with the TEM. Lisa Lem, and Peter Shipple from the Cross Cancer Institute for supplying oxygen. Hilmar Strickfaden holds a postdoctoral fellowship by the Alberta Cancer foundation and was supported by the Bayrische Forschungsallianz. This work was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research and Alberta Cancer Foundation.
Materials
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Gridded 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-2-14-CGRD | not made for immersion objectives |
| LR White: acryl resin | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Osmium Tetroxide | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | might even work with older versions | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | might even work with older versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesium 137 radiation source "MARK 1" | (J.L. Shepherd & Associated) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Diatome | ||
| Trimming Knife ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydrate | emsdiasum | 12300 | Caution Toxic! |
| Glutaraldehyde EM Grade 8% | emsdiasum | 16020 | Caution Toxic! |
| Sodium phosphate dibasic | emsdiasum | 21180 | |
| Sodium phosphate monobasic | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldehyde | emsdiasum | 19202 | |
| Osmium tetroxide 4% solution | emsdiasum | 19150 | |
| Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Hydrochloric Acid | Fisherbrand | A142-212 | |
| Sodium Hydroxide Solution 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygen | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Potassium cyanide | Sigma | 207810 | Caution Toxic! |
| Ethanol | emsdiasum | 15058 | Caution Toxic! |
| Razor blade Single Edge Carbon Steel | emsdiasum | 71960 | Caution Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | lifetechnologies | 16000-044 | |
| G418 | lifetechnologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Transmission Electron Microscope 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Energy filter | Gatan |
References
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
- Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus. Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).
- Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture. Molecular biology of the cell. 10, 2051 (1999).
- Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging. Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).
- Leapman, R. D., Ornberg, R. L. Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology. Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).
- Simon, G. T. Electron spectroscopic imaging. Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).
- Egerton, R. . Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , (2011).
- Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps. Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).
- Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope. Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS biology. 9, e1001041 (2011).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).
- Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).
- Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).
- Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).
- Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci. Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).
- Kruhlak, M. J., et al. Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks. The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).
- Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines. Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).
- Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ. Methods in enzymology. , 375-456 (2004).
- Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair. Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).
- Mortusewicz, O., et al. Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites. J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).
- Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Frontiers in genetics. 4, 135 (2013).
- Lukas, C., et al. 53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress. Nature. 13, 243-253 (2011).
- Harrigan, J. A., et al. Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells. The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).
- Aronova, M. A., et al. Reprint of ‘Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST). J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).
- Fussner, E., et al. Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming. The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).
- Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin. Cell cycle. 10, 308-322 (2011).
