Visualisatie van miniSOG Tagged DNA reparatie-eiwitten in combinatie met Electron spectroscopische beeldvorming (ESI)

Summary

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Abstract

De grenzen van optische resolutie en de uitdaging van het identificeren van specifieke eiwit bevolkingsgroepen in transmissie elektronenmicroscopie zijn obstakels in de celbiologie geweest. Veel verschijnselen kunnen niet verklaard worden door in vitro analyse in vereenvoudigde systemen en aanvullende structurele informatie nodig in situ, in het bijzonder in het traject tussen 1 nm en 0,1 urn, teneinde te worden begrepen. Hier, elektronen spectroscopische beeldvorming, een transmissie elektronenmicroscopie techniek die gelijktijdig in kaart brengen van de verdeling van eiwitten en nucleïnezuren mogelijk maakt, en een uitdrukking tag, miniSOG, worden gecombineerd om de structuur en organisatie van DNA double-strand break repair foci bestuderen.

Introduction

Ondanks de aanzienlijke vooruitgang in het licht microscopie afgelopen jaren ^1, cel-biologen nog steeds last van een hiaat in de resolutie. Dit beperkt begrip van de structuur-functie relaties in de fundamentele cellulaire processen die de gecoördineerde wisselwerking tussen macromoleculaire complexen omvatten (bijvoorbeeld in chromatine remodeling, reparatie van DNA, RNA transcriptie en DNA-replicatie). Hoewel transmissie elektronenmicroscopen (TEM) s de vereiste resolutie, het moeilijk is geweest om deze processen structureel vanwege het onvermogen definiëren eiwitten te labelen terwijl ook in staat om de biochemische samenstelling van de gevisualiseerde structuren te bepalen. Aangezien interne membranen te differentiëren nucleaire structuren, is de kern bijzonder uitdagend. Electron spectroscopische beeldvorming (ESI) lost sommige beperkingen doordat de gelijktijdige detectie en differentiatie van DNA, RNA en protein-gebaseerde nucleaire structuren ^2-5.

Elektron spectroscopische beeldvorming:

Om elementaire verdeling met hoge gevoeligheid en resolutie van de elektronenmicroscoop kaart, kan men een beeldspectrometer dat elektronen die inelastisch verstrooid door interactie met binnenschaal elektronen van een element in het monster ⁶ selecteert gebruiken. Omdat element-specifieke hoeveelheden energie verloren als gevolg van ionisatie van atomen in het monster, kunnen deze elektronen worden gescheiden en gevisualiseerd met behulp van een spectrometer die de elektronenmicroscoop is bevestigd. Aldus analyse van het spectrum van de electronen die interactie met het monster laat kwalitatieve en kwantitatieve informatie over de elementaire samenstelling van het monster ^7. Elektronen die geen energie verliezen bij het passeren van het monster zijn te vinden in de "nul-verlies piek" van het elektron energieverliesspectrum. De overvloed van deze elektronen is gerelateerd aan de massa, de dichtheid en dikte van het monster en bestaat uit elektronen die door het monster zonder te botsen met het monster of verlies van energie tijdens passage door het monster. Deze informatie kan nuttig zijn voor absolute kwantificering van het aantal atomen van een bepaald element aanwezig in het monster ⁸ zijn.

Omdat biologische monsters voornamelijk uit lichte elementen die slecht afbuigen de elektronen in de invallende bundel van de TEM, kleuringen die zware metaalzouten hebben om contrast in het monster te genereren worden toegepast. Het gebrek aan specificiteit van de meeste van deze contrastmiddelen en het onvermogen om meer dan één vlek indien specificiteit mogelijk zichtbaar is de waarde van conventionele elektronenmicroscopie beperkt in de studie van de kern. ESI heeft belangrijke voordelen ten opzichte van conventionele TEM, met name voor de studie van structuur van de celkern.Het is mogelijk om de fosfor-rijke natuur van DNA- en RNA-bevattende macromoleculaire complexen benutten nucleoproteïne complexen eiwitcomplexen onderscheiden en verschillende nucleoproteïne complexen op basis van hun dichtheid van nucleïnezuren lossen. Het resterende biologisch materiaal kan worden afgebeeld op basis van de overvloed aan stikstof. Mapping alleen deze twee elementen en de analyse van hun verspreiding en relatieve rijkdom binnen de verschillende anatomische structuren geeft ons veel informatie over de kern. Zo is het gemakkelijk om chromatine en de ribosomen in de kaart die fosfor overvloed identificeren. De interchromatin ruimte, porie complexen nucleaire en nucleaire organen, daarentegen, kan gemakkelijk worden gedetecteerd in beeld stikstof map.

Mini singlet zuurstof generator systeem (miniSOG)

Terwijl ESI is een krachtige techniek voor een studie in situ chromatinestructuur omdat nemens voordeel van de kenmerkende verhoudingen in elementaire samenstelling tussen fosfor en stikstof, de elementaire samenstelling kan normaliter worden gebruikt om te discrimineren tussen verschillende populaties van eiwitcomplexen. Antilichamen gelabeld met kleine gouddeeltjes in het nanobereik zijn op grote schaal gebruikt om de locatie van individuele moleculen in kaart. Aangezien de gouddeeltje gewoonlijk verbonden is aan een secundair antilichaam, verschijnt binnen een omtrek van ongeveer 20 nm rond gedetecteerd door het primaire antilichaam epitoop. Bij post-inbedding samples kunnen antilichamen alleen de epitopen die zijn blootgesteld aan het oppervlak van de secties detecteren. Hoewel het mogelijk is de aanwezigheid van een antigeen te bewijzen en relateren aan een bepaalde anatomische structuur van de cel, de informatie die wordt verkregen onvolledig is, aangezien de meeste epitopen worden verduisterd door hars. Pre-inbedding technieken die vergelijkbaar protocollen die voor fluorescentiemicroscopie gebruiken, toegang tot antigenen toestaan ​​gedurendede gehele diepte van het monster maar de permeabilisatie stappen die nodig zijn om het antilichaam aan de cel penetreren vereisen typisch verwijderd lipidemembranen en componenten die niet aldehyden kunnen worden vastgesteld verwijderen. Bovendien is de voorkeur aldehyde fixeermiddel voor ultrastructuur behoud, glutaaraldehyde, gewoonlijk vernietigt epitopen en dientengevolge is paraformaldehyde typisch vereist. Dit is minder effectief bij eiwit-eiwit crosslinking. Een ander nadeel van antilichamen die zijn gemerkt met een gouden nanodeeltjes is dat goud een elektronen-dicht materiaal dat een sterk contrast interessante structurele details van het monster, die zwakker contrast heeft kunnen verhullen ontstaat.

De opkomst van het groen fluorescerend eiwit (GFP) als een expressie gebracht eiwit tag heeft getransformeerd het gebruik van fluorescentiemicroscopie om vragen te beantwoorden in de celbiologie. Tagging een eiwit met een kleine fluorescerende domein maakt mapping van de verdeling ervan in vivo </em> zonder dat permeabilisatie procedures die de structuur kan veranderen. Om het elegante principe van het gebruik eiwitlabels eiwit distributies kaart in een cel elektronenmicroscopie vertalen, is een systeem nodig dat in staat is een signaal dichtbij de structuur van belang te produceren en het genereren contrast in de TEM. Gepolymeriseerde diaminobenzidine is een vlek die vaak wordt gebruikt in de histologie voor de opsporing van antilichamen binden. Deze vlek wordt gewoonlijk neergeslagen terwijl mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd aan een secundair antilichaam. Hoewel de reactie produceert een betrouwbaar resultaat, HRP is katalytisch actief op het cytosol van cellen ^9. De reactieproducten van HRP kan diffunderen weg van de plaats van productie zodat de resolutie is slechter dan nanogold methode ^10. Om deze problemen te omzeilen, werd de flitser / ReAsH ontwikkeld ^11. Het bestaat uit recombinante fusie-eiwitten die een tetracysteine ​​motief bezitten. Dit motief maakt de binding vaneen biarsenic fluorofoor. Bij opwinding, het gebonden Flash of ReAsH staat is de zeer reactieve singlet zuurstof en dus photoconvert diaminobenzidine (DAB) in een polymeer dat direct op de plaats van de gemerkte eiwitten precipiteert genereren. De DAB polymeer kan worden gekleurd met osmiumtetroxide, wat electron dichtheid en dus kunnen worden gebruikt om de verdeling van het recombinante fusie-eiwit in de TEM in kaart.

In 2011, Shu et al. ¹⁰ heeft de miniSOG systeem, dat bestaat uit een kleine 106 aminozuren fusion tag afgeleid van een flavoproteïne van Arabidopsis die fluorescent en kan vele singlet zuurstofradicalen te maken bij excitatie met 448 nm blauw licht. Deze singlet zuurstof radicalen kan worden gebruikt voor foto-oxideren diaminobenzidine polymeren aan en nabij het ​​oppervlak van de gelabelde eiwitten, die aanzienlijk dichter dan immunogoud gemerkte antilichamen ¹¹ te vormen. Terwijl de flitser / ReAsH systeem vereist waardoor de fluorchroom en diaminobenzidine in de cellen voordat u de photoconversion het miniSOG vereist alleen diaminobenzidine en licht en bovendien is ongeveer tweemaal zo doeltreffend polymeriseren diaminobenzidine. Hier miniSOG wordt toegepast in combinatie met ESI om de ultrastructuur van DNA herstel foci in kaart.

DNA-herstel foci (DRF)

Ongerepareerde DNA dubbele breuken vormen een ernstige bedreiging voor de cel omdat ze kunnen leiden tot translocaties en verlies van genetische informatie. Op zijn beurt kan leiden tot veroudering, kanker, en celdood. Veel eiwitten die betrokken zijn bij DNA dubbele breuken reparatie ophopen in brandpunten die monteren rond een DNA dubbele streng te breken ^12-14. Hoewel hun functie niet bekend is, vertegenwoordigen zij de plaats in de kern die de DNA dubbele streng breuk bevat en de plaats van DNA dubbele streng breuk reparatie.

DNA-reparatie foci (DRF) zijn gekarakteriseerd door fluorescentiemicroscopie en zij dienen als biomarkers voor DNA schade ^12,15. Ze zijn enorm ten opzichte van de grootte van het dubbelstrengs breuken en waren betrekkelijk homogeen beschouwd zolang Language superresolutietechnieken studies toonden aanwijzingen van sub-compartimentering van moleculen binnen iedere ¹⁶ gericht. Om te begrijpen hoe deze plaatsen zijn georganiseerd, dient te visualiseren alle onderliggende biologische structuren ten opzichte van elkaar. Dit kan niet worden bereikt door fluorescentiemicroscopie maar kan door elektronenmicroscopie ^17,18. Hier wordt een methode beschreven die elektronen spectroscopische beeldvorming combineert met de miniSOG methode om het potentieel van deze gecombineerde aanpak illustreren aan de ultrastructuur van DNA double-strand break repair verkennen.

Protocol

1. Generatie van miniSOG Cell-lijnen Groei U2OS (humane osteosarcoom) -cellen in een 35 mm schotel met 2 ml van laag glucose Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) dat is aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO 2 atmosfeer. Transfecteren de cellen wanneer ze 80% samenvloeiing door lipofectie met gezuiverd transfectie kwaliteit (A269 / 280-verhouding 1,8-2,0) plasmide constructen die de sequenties voor miniSOG en mCherr…

Representative Results

ESI Vergelijking van de ESI beelden van de nucleus (figuur 1) van de conventionele TEM beelden (bijvoorbeeld figuur 7-1) toont een dramatische toename van anatomische structuren die gemakkelijk onderscheiden kan worden. De chromatine richels verschijnen in het geel en het is heel gemakkelijk om de chromocenters in muizen cellen te identificeren. Nucleoli gemakkelijk te onderscheiden van hun door chromatine structuur en verschillende…

Discussion

ESI kan dienen als een uitstekend hulpmiddel voor de behandeling van verschillende staten van chromatine en ribonucleoproteins in de kern, omdat het in staat is om specifiek in kaart gebieden die rijk zijn aan fosfor zijn. Het verhoogt diep de hoeveelheid detail die kan worden verkregen met een elektronenmicroscoop en is niet afhankelijk van aspecifieke zeer uiteenlopende methoden. Een nadeel van ESI is dat het vereist dunnere dan conventionele TEM tegelijk versnellingsspanning. Dit kan worden ondervangen door met serie…

Materials

35 mm glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Gridded 35 mm glass bottom dishes	MatTek	P35G-2-14-CGRD	not made for immersion objectives
LR White: acryl resin	emsdiasum	14381
LR White accelerator	emsdiasum	14385
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets	Sigma	D5905
Slim Bar Grids 300 Mesh	SPI	1161123
Tungsten-Point Lab Pen	emsdiasum	41148
Osmium Tetroxide	emsdiasum	19100
Carbon Coater 208carbon	Cressington
Ultra microtome Leica EM UC6	Leica
Photoshop CS5	Adobe		might even work with older versions
Digital Micrograph V.2.30	Gatan		might even work with older versions
Hoechst 33342	Sigma	H-1399
Effectene	Quiagen
MiniSOG-Constructs	Tsien-Lab		tsienlab@yahoo.com
MDC1 miniSOG mCherry
53BP1 miniSOG mCherry
Rad52 miniSOG mCherry
cesium 137 radiation source "MARK 1"	(J.L. Shepherd & Associated)
ImageJ/FiJi	open source		http://fiji.sc/Fiji
2 ml Eppendorf tubes	Fisherbrand	05-408-146
Diamond Knife ultra 35°	Diatome
Trimming Knife ultratrim	Diatome
Sodium cacodylate trihydrate	emsdiasum	12300	Caution Toxic!
Glutaraldehyde EM Grade 8%	emsdiasum	16020	Caution Toxic!
Sodium phosphate dibasic	emsdiasum	21180
Sodium phosphate monobasic	emsdiasum	21190
Paraformaldehyde	emsdiasum	19202
Osmium tetroxide 4% solution	emsdiasum	19150
Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M	Zeiss
Hydrochloric Acid	Fisherbrand	A142-212
Sodium Hydroxide Solution 10M	Fluka	72068
Oxygen	Medigas
3-Amino-1,2,4-triazole	Sigma	A8056
Potassium cyanide	Sigma	207810	Caution Toxic!
Ethanol	emsdiasum	15058	Caution Toxic!
Razor blade Single Edge Carbon Steel	emsdiasum	71960	Caution Sharp!
DMEM	Sigma	D 5546
FBS	lifetechnologies	16000-044
G418	lifetechnologies	11811-023
DMSO	Sigma	D2650
Transmission Electron Microscope 200 kV	JEOL	2100
GIF Tridiem 863 Energy filter	Gatan