Visualização de miniSOG Proteínas Tagged reparo de DNA em combinação com Electron espectroscópica Imagem (ESI)

Summary

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Abstract

Os limites para a resolução óptica e o desafio de identificar populações específicas de proteínas em microscopia eletrônica de transmissão têm sido obstáculos na biologia celular. Muitos fenómenos não pode ser explicado por meio de análise in vitro em sistemas simplificados e necessitam de informação estrutural adicional in situ, em particular na gama entre 1 nm e 0,1 um, a fim de ser completamente compreendida. Aqui, imagens espectroscópicas elétron, uma técnica de microscopia eletrônica de transmissão que permite o mapeamento simultâneo da distribuição de proteínas e ácidos nucleicos, e uma tag de expressão, miniSOG, são combinados para estudar a estrutura e organização do DNA de fita dupla focos reparo ruptura.

Introduction

Apesar dos avanços significativos em microscopia de luz nos últimos anos ^1, biólogos celulares continuam a sofrer de uma lacuna na resolução. Isto limita a compreensão das relações estrutura-função em processos celulares fundamentais que envolvem a interacção coordenada entre complexos macromoleculares (por exemplo, na remodelação da cromatina, a reparação do ADN, a transcrição de ARN e ADN de replicação). Embora microscópios de electrões de transmissão (MET) é fornecer a resolução necessária, tem sido um desafio para definir estes processos estruturalmente por causa da incapacidade de marcar as proteínas específicas, enquanto também é capaz de determinar a composição bioquímica das estruturas visualizadas. Na ausência de membranas internas para ajudar a diferenciar estruturas nucleares, o núcleo tem sido particularmente difícil. Electron espectroscópica imagiologia (ESI) resolve algumas destas limitações, permitindo a detecção e diferenciação simultâneas de ADN, ARN, e Protein baseada em estruturas nucleares ^2-5.

Electron imagens espectroscópicas:

Para mapear distribuições elementares em alta sensibilidade e resolução do microscópio eletrônico, pode-se usar um espectrômetro de imagem que seleciona os elétrons que foram inelasticamente espalhadas através de interações com electrões de interiores de um elemento na amostra ^6. Devido quantidades específicas do elemento de energia são perdidos em consequência de ionização de átomos presentes na amostra, estes electrões pode ser separada e visualizada utilizando um espectrómetro que está ligado ao microscópio electrónico. Assim, a análise do espectro dos electrões que interagiram com o espécime revela informação qualitativa e quantitativa sobre a composição elementar da amostra ^7. Os electrões que não perdem energia ao passar através da amostra encontram-se na "perda do pico a zero" da perda de energia dos electrõesespectro. A abundância destes electrões está relacionada com a massa, densidade e espessura do espécime e é composta de electrões que passam através do espécime, sem colidir com a amostra ou a perda de energia durante a passagem através da amostra. Esta informação pode ser útil para a quantificação absoluta do número de átomos de um elemento específico presente na amostra ^8.

Uma vez que as amostras biológicas consistem principalmente em elementos leves que mal desviar os electrões no feixe incidente do MET, utilizando métodos de coloração de metal pesado sais têm de ser aplicadas, a fim de gerar contraste na amostra. A falta de especificidade da maior parte destes agentes de contraste e a incapacidade para visualizar mais do que uma mancha, onde é possível a especificidade tem limitado o valor de microscopia electrónica convencional no estudo do núcleo. ESI tem vantagens significativas sobre MET convencional, nomeadamente para o estudo das estruturas do núcleo da célula.É possível explorar a natureza rica em fósforo de ADN e de complexos macromoleculares contendo ARN para distinguir os complexos nucleoproteicos de complexos de proteínas e diferentes para resolver os complexos nucleoproteicos com base na sua densidade de ácidos nucleicos. O restante material biológico pode ser trabalhada com base na sua abundância de azoto. Mapeamento apenas estes dois elementos e análise de sua distribuição e abundância relativa dentro de estruturas anatômicas diferentes nos fornece uma série de informações sobre o núcleo. Por exemplo, é fácil de identificar cromatina e os ribossomas no mapa representam abundância de fósforo. O espaço interchromatin, complexos de poros nucleares, e corpos nucleares, por outro lado, pode ser facilmente detectada na imagem do mapa de azoto.

Mini sistema gerador de oxigênio singlete (miniSOG)

Enquanto ESI representa uma técnica poderosa para estudar na estrutura da cromatina situ porque tomarA vantagem dos índices característicos na composição elementar entre fósforo e nitrogênio, a composição elementar não pode normalmente ser usado para discriminar entre diferentes populações de complexos de proteínas. Os anticorpos marcados com partículas de ouro pequenas na gama nanométrica têm sido amplamente utilizados para mapear a localização de moléculas individuais. Uma vez que a partícula de ouro está geralmente ligado a um anticorpo secundário, que aparece dentro de uma circunferência de cerca de 20 nm, em torno do epitopo detectada pelo anticorpo primário. Em amostras de pós-incorporação, anticorpos pode detectar apenas os epítopos expostos à superfície das secções. Embora seja possível para provar a presença de um antigénio e relacioná-la com uma determinada estrutura anatómica da célula, a informação que é obtida é incompleta, uma vez que a maioria dos epitopos são obscurecidos por resina. As técnicas que utilizam protocolos semelhantes aos usados ​​para a microscopia de fluorescência pré-incorporação, permitir o acesso a todo antigéniostoda a profundidade da amostra, mas as etapas permeabilização que são necessários para permitir que o anticorpo para penetrar a célula normalmente requerem a remoção de membranas lipídicas e remover componentes que não podem ser fixados por aldeídos. Além disso, o fixador de aldeído preferido para a preservação ultraestrutura, glutaraldeído, comumente destrói epitopos e, consequentemente, paraformaldeído é normalmente necessária. Esta é menos eficaz a reticulação da proteína-proteína. Outra desvantagem de que os anticorpos são marcados com uma nanopartícula de ouro é que o ouro é um material muito denso de electrões que criam uma forte contraste que podem obscurecer detalhes estruturais interessantes da amostra, o que tem mais fraco contraste.

O surgimento da proteína fluorescente verde (GFP) como uma marca de proteína expressa transformou a utilização de microscopia de fluorescência para responder a perguntas em biologia celular. Marcação de uma proteína com um domínio pequeno fluorescente permite o mapeamento de sua distribuição in vivo </em> sem a necessidade de procedimentos de permeabilização que podem alterar a estrutura. A fim de traduzir o princípio elegante de usar etiquetas proteicas para mapear distribuições de proteína numa célula para microscopia de electrões, foi necessário um sistema que é capaz de produzir um sinal para fechar a estrutura de interesse e gerar contraste na MET. Diaminobenzidina polimerizada é um corante que é muitas vezes usado em histologia para detectar a ligação do anticorpo. Este corante é geralmente depositado utilizando peroxidase de rábano (HRP) conjugado com um anticorpo secundário. Embora a reacção produz um resultado fiável, a HRP não é cataliticamente activo no citosol de células ^9. Os produtos da reacção de HRP pode também difundir para longe do local de geração de modo que a sua resolução é pior do que o método nanogold ^10. Para contornar esses problemas, o Sistema de Flash / ReAsH foi desenvolvido ^11. É constituída por proteínas de fusão recombinantes que possuem um motivo tetraciste�a. Este motivo permite a ligação deum fluoróforo biarsenic. Quando excitado, o flash ligado ou ReAsH é capaz de gerar o oxigénio singeleto altamente reactivo e portanto photoconvert diaminobenzidina (DAB) num polímero que precipita imediatamente no local das proteínas marcadas. O polímero DAB pode ser coradas com tetróxido de ósmio, que é de electrões denso e, portanto, pode ser utilizada para mapear a distribuição da proteína de fusão recombinante em MET.

Em 2011, Shu et al. ^10, apresentado o sistema miniSOG, que consiste de uma pequena 106 amino ácidos tag de fusão derivada de uma flavoproteína de Arabidopsis que é fluorescente e capaz de criar muitos radicais de oxigénio singleto quando excitado com luz azul de 448 nm. Esses radicais oxigénio singuleto pode ser usado para oxidar foto-diaminobenzidina para formar polímeros sobre e perto da superfície da proteína marcada, que é consideravelmente mais estreita do que os anticorpos marcados por imuno ^11. Enquanto o sistema de flash / ReAsH requer trazendo o flúorcromo eo diaminobenzidina para as células antes de fazer a fotoconversão, o sistema requer apenas miniSOG diaminobenzidina e luz e, além disso é de cerca de duas vezes mais eficaz na polimerização de diaminobenzidina. Aqui, miniSOG é empregada em combinação com ESI, a fim de mapear a ultra-estrutura de reparo do DNA focos.

Reparo do DNA focos (DRF)

DNA reparado rupturas de filamentos duplos representam uma séria ameaça para a célula, uma vez que pode levar a translocações e perda de informação genética. Por sua vez, isto pode levar a senescência, cancro, e morte celular. Muitas proteínas que estão envolvidas na reparação de DNA dupla vertente pausa acumular em focos que montar em torno de um DNA dupla vertente quebrar ^12-14. Embora sua função não é conhecida, eles representam o site no núcleo que contém o DNA quebra de cadeia dupla e é o local de DNA dupla vertente de reparação pausa.

Reparo do DNA foci (DRF) foram caracterizados por microscopia de fluorescência e que servem como biomarcadores para o dano ao DNA ^12,15. Eles são em massa em relação ao tamanho da ruptura de fita dupla e foram consideradas relativamente homogénea até recentes estudos de microscopia de super-resolução revelou alguma evidência de sub-compartimentação de moléculas dentro de cada foco ^16. A fim de compreender como estes locais são organizadas, é necessário visualizar todas as estruturas biológicas subjacentes em relação ao outro. Isso não pode ser alcançado por microscopia de fluorescência, mas é possível através de microscopia eletrônica de ^17,18. Aqui, é descrito um método que combina eletrônica espectroscópica de imagem com o método miniSOG para ilustrar o potencial dessa abordagem combinada para explorar a ultra-estrutura de reparo de DNA de fita dupla ruptura.

Protocol

1. Geração de Celulares linhas de miniSOG Cresça U2OS (osteossarcoma humano) as células num prato de 35 mm contendo 2 ml de baixo teor de glucose meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que é suplementado com soro a 10% de bovino fetal (FBS) a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2 atmosfera. Transfectar as células quando estas são 80% confluentes por lipofecção com qualidade transfecção purificada (A269 / 280 1,8-2,0 rácio) construções de plasmídeo conten…

Representative Results

ESI Comparando as imagens ESI do núcleo (Figura 1) com as imagens de TEM convencionais (por exemplo, a Figura 7-1) revela um aumento dramático nas estruturas anatómicas que podem ser facilmente distinguidas. As cristas de cromatina aparecem em amarelo e é bastante fácil de identificar os chromocenters em células de ratinho. Nucléolos pode ser facilmente distinguida da cromatina por sua estrutura rodada e cor …

Discussion

ESI pode servir como uma ferramenta excelente para examinar diferentes estados de cromatina e ribonucleoproteínas no núcleo, porque é capaz de mapear especificamente áreas que são ricos em fósforo. É profundamente aumenta a quantidade de detalhe que pode ser obtida por um microscópio electrónico, e não é dependente de métodos de contraste não específicos. Uma desvantagem de ESI é que ele requer secções mais finas do que MET convencional com a mesma voltagem de aceleração. Isso pode ser superado por tr…

Materials

35 mm glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Gridded 35 mm glass bottom dishes	MatTek	P35G-2-14-CGRD	not made for immersion objectives
LR White: acryl resin	emsdiasum	14381
LR White accelerator	emsdiasum	14385
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets	Sigma	D5905
Slim Bar Grids 300 Mesh	SPI	1161123
Tungsten-Point Lab Pen	emsdiasum	41148
Osmium Tetroxide	emsdiasum	19100
Carbon Coater 208carbon	Cressington
Ultra microtome Leica EM UC6	Leica
Photoshop CS5	Adobe		might even work with older versions
Digital Micrograph V.2.30	Gatan		might even work with older versions
Hoechst 33342	Sigma	H-1399
Effectene	Quiagen
MiniSOG-Constructs	Tsien-Lab		tsienlab@yahoo.com
MDC1 miniSOG mCherry
53BP1 miniSOG mCherry
Rad52 miniSOG mCherry
cesium 137 radiation source "MARK 1"	(J.L. Shepherd & Associated)
ImageJ/FiJi	open source		http://fiji.sc/Fiji
2 ml Eppendorf tubes	Fisherbrand	05-408-146
Diamond Knife ultra 35°	Diatome
Trimming Knife ultratrim	Diatome
Sodium cacodylate trihydrate	emsdiasum	12300	Caution Toxic!
Glutaraldehyde EM Grade 8%	emsdiasum	16020	Caution Toxic!
Sodium phosphate dibasic	emsdiasum	21180
Sodium phosphate monobasic	emsdiasum	21190
Paraformaldehyde	emsdiasum	19202
Osmium tetroxide 4% solution	emsdiasum	19150
Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M	Zeiss
Hydrochloric Acid	Fisherbrand	A142-212
Sodium Hydroxide Solution 10M	Fluka	72068
Oxygen	Medigas
3-Amino-1,2,4-triazole	Sigma	A8056
Potassium cyanide	Sigma	207810	Caution Toxic!
Ethanol	emsdiasum	15058	Caution Toxic!
Razor blade Single Edge Carbon Steel	emsdiasum	71960	Caution Sharp!
DMEM	Sigma	D 5546
FBS	lifetechnologies	16000-044
G418	lifetechnologies	11811-023
DMSO	Sigma	D2650
Transmission Electron Microscope 200 kV	JEOL	2100
GIF Tridiem 863 Energy filter	Gatan