電子分光イメージングと組み合わせたminiSOGタグ付きのDNA修復タンパク質の可視化（ESI）
Summary
Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.
Abstract
光学分解能透過型電子顕微鏡における特定のタンパク質の集団を同定する課題には限界が細胞生物学における障害となっています。多くの現象は、簡略化システムインビトロ分析により説明と完全に理解されるために、特に1nmから0.1μmの間の範囲内で、 その場で追加の構造情報を必要とすることはできません。ここで、電子分光イメージング、タンパク質および核酸の分布の同時マッピングを可能にする、透過電子顕微鏡法、および発現タグ、miniSOGは、DNA二本鎖切断修復巣の構造と組織を研究するために組み合わされます。
Introduction
近年1以上の光学顕微鏡の大幅な進歩にもかかわらず、細胞生物学者は、まだ解像度のギャップに苦しんでいます。これは、巨大分子複合体の協調相互作用を伴う基本的な細胞プロセスにおける構造と機能の関係の理解を制限する（例えば、クロマチンリモデリング、DNA修復、RNA転写およびDNA複製で）。透過電子顕微鏡（TEM）は、必要な分解能を提供だが、それはまた、視覚化構造の生化学的組成を決定することができる一方で、特定のタンパク質を標識するために、構造的にできないので、これらのプロセスを定義するために挑戦してきました。核構造を区別するのに役立つ内部の膜が存在しない場合には、核が特に困難となっています。電子分光イメージング（ESI）は、DNA、RNA、およびPROTの同時検出および区別を可能にすることにより、これらの制限のいくつかを解決しますEINベースの核構造2-5。
電子分光イメージング。
電子顕微鏡での高感度と分解能で元素の分布をマッピングするためには、非弾性的に試料6の要素の内殻電子との相互作用を介して散乱された電子を選択画像分光計を使用することができます。エネルギーの要素固有の量が試料中の原子のイオン化の結果として失われるので、これらの電子は、電子顕微鏡に取り付けられた分光計を用いて分離し、可視化することができます。このように、試料と相互作用した電子のスペクトルの分析は、 試料 7の元素組成に関する定性的および定量的情報を明らかにする。試料を通過する際にエネルギーを失わない電子は、電子エネルギー損失の「ゼロ損失ピーク」に見出されますスペクトル。これらの電子の存在量は、試料の質量、密度および厚さに関係し、試料に衝突または試料を通過する間にエネルギーを失うことなく、試料を通過する電子から構成されています。この情報は、試料8中に存在する特定の元素の原子数の絶対的な定量化のために有用であり得ます。
生物学的サンプルは不十分TEMの入射ビーム中の電子を偏向する光素子の大部分から構成されているため、重金属塩を使用する染色方法は、試料のコントラストを生成するために適用されなければなりません。これらの造影剤の多くの特異性および特異性が可能な複数の染色を可視化することができないことがないことは、核の研究において、従来の電子顕微鏡の値を制限しています。 ESIは、特に細胞核の構造の研究のために、従来のTEMを超える大きな利点を持っています。これは、タンパク質複合体の核タンパク質複合体を区別するために、および核酸のそれらの濃度に基づいて、種々の核タンパク質複合体を解決するためのDNA-及びRNAを含む高分子複合体のリンが豊富な性質を利用することが可能です。残りの生物学的物質は、窒素の存在量に基づいて画像化することができます。異なる解剖学的構造内のマッピングだけでこの2つの要素とそれらの分布と相対量の分析は、核に関する多くの情報を提供してくれます。例えば、それは、クロマチンとリン存在量を示すマップでリボソームを同定することは容易です。 interchromatin空間、核膜孔複合体、および核小体は、一方で、簡単に窒素マップ画像で検出することができます。
ミニ一重項酸素発生システム（miniSOG）
それが取るので、ESIは、 その場でのクロマチン構造で勉強するための強力な技術を表していますリンと窒素の元素組成における特性の比の利点は、元素組成は、通常、タンパク質複合体の異なる集団の間で区別するために使用することができません。ナノメートル範囲の小さな金粒子で標識された抗体は、広く、個々の分子の位置をマッピングするために使用されてきました。金粒子は、通常、二次抗体に結合しているので、一次抗体によって検出されるエピトープの周囲に約20nmの円周内に表示されます。埋め込み後の試料では、抗体は、セクションの表面に露出されるエピトープを検出することができます。それは、抗原の存在を証明し、細胞の特定の解剖学的構造に関連することが可能であるがエピトープの大部分が樹脂によって覆い隠されているので、得られた情報は、不完全です。全体を通して、抗原へのアクセスを許可し、蛍光顕微鏡検査のために使用されるものと同様のプロトコルを使用する技術を、事前に埋め込みサンプルの全体の深さが、典型的には脂質膜の除去を必要とアルデヒドで固定することができない成分を除去する抗体が細胞に侵入することを可能にするために必要とされる透過化のステップ。また、超微細構造の保存のための好適なアルデヒド固定液、グルタルアルデヒドは、一般的にエピトープを破壊し、その結果、パラホルムアルデヒドは、一般的に必要とされます。これは、タンパク質 – タンパク質架橋にあまり効果的です。金ナノ粒子で標識された抗体の別の欠点は、金が弱いコントラストを有するサンプルの興味深い構造の詳細を隠すことができ、強いコントラストを作成し、非常に電子密度の高い材料であることです。
発現したタンパク質タグとして緑色蛍光タンパク質（GFP）の出現は、細胞生物学の質問に答えるために、蛍光顕微鏡の使用を変えてきました。小さ な蛍光ドメインを有するタンパク質をタグ付けすることは、生体内でその分布のマッピングを可能にします</eM>の構造を変更することができる透過性手順を必要とせずに。電子顕微鏡法に細胞内のタンパク質の分布をマッピングするためにタンパク質タグを使用してエレガントな原理を変換するために、システムは、関心のある構造に近い信号を生成し、TEMのコントラストを生成することができることが必要でした。重合したジアミノベンジジンは、しばしば、抗体結合を検出するために、組織学に使用される染色あります。この染色は、通常、二次抗体にコンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を用いて堆積されます。反応は信頼性の高い結果を生成するが、HRPは、 セル 9の細胞質ゾルに触媒活性ではありません。その解像度はナノゴールド法10よりも悪いようにHRPの反応生成物も生成部位から離れて拡散することができます。これらの問題を回避するために、フラッシュ/ ReAsHシステムが11を開発しました。これは、テトラシステインモチーフを保有する組換え融合タンパク質で構成されています。このモチーフは、との結合ができますbiarsenic蛍光団。励起されると、結合したFlashやReAsHは、標識タンパク質の現場ですぐに沈殿するポリマーへの反応性の高い一重項酸素を生成するので、photoconvertジアミノベンジジン（DAB）することができます。 DABポリマーは、電子密度で四酸化オスミウムで染色することができ、TEMでの組換え融合タンパク質の分布をマッピングするために使用することができます。
2011年には、シュウら 10は、蛍光灯や448 nmの青色光で励起されたとき、多くの一重項酸素ラジカルを生成することが可能であるシロイヌナズナのフラビンタンパク質由来の小さな106アミノ酸の融合タグで構成されていminiSOGシステムを発表しました。それらの一重項酸素ラジカルは11免疫標識された抗体よりもかなり近いタグタンパク質の表面に近くポリマーを形成する光酸化ジアミノベンジジンを使用することができます。フラッシュ/ ReAsHシステムは、フルオロをもたらす必要があるがクロムと光変換を行う前に、細胞へのジアミノベンジジン、miniSOGシステムのみジアミノベンジジン、光を必要とし、加えて、ジアミノベンジジンを重合で約2倍の効果があります。ここで、miniSOGはDNA修復フォーカスの超微細構造をマッピングするために、ESIと組み合わせて使用されます。
DNA修復巣（DRF）
彼らは転座と遺伝情報の損失につながることができますので、未修復のDNA二本鎖切断は、細胞への深刻な脅威をもたらします。今度は、これが老化、癌、及び細胞死をもたらすことができます。 DNA二本鎖切断修復に関与している多くのタンパク質は、DNA二本鎖切断12-14の周りに組み立てる病巣に蓄積します。それらの機能は不明であるが、それらは、DNA二本鎖切断を含み、DNA二本鎖切断修復の部位である、核内の部位を表します。
DNA修復FOC私（DRF）は、蛍光顕微鏡によって特徴付けられており、それらはDNA損傷12,15のためのバイオマーカーとして役立ちます。これらは、二本鎖切断のサイズに大量の相対的であり、最近の超解像顕微鏡研究は、それぞれ16を集中内の分子のサブ区画のいくつかの証拠を明らかにまで比較的均質と考えられました。これらの部位は組織化されている方法を理解するために、互いに対して基礎となる生物学的構造のすべてを可視化することが必要です。これは、蛍光顕微鏡検査によって達成さが、電子顕微鏡17,18を介して可能であることはできません。ここでは、この方法は、DNA二本鎖切断修復の超微細構造を探索するために、この組み合わせアプローチの可能性を示すためにminiSOG法により電子分光イメージングを組み合わせることが記載されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ESIは、それが具体的にリンが豊富な領域をマッピングすることが可能であるため、核内でクロマチンとリボの異なる状態を調べるための優れたツールとして機能することができます。それは深く、電子顕微鏡によって得ることができる詳細の量を増大し、非特異的な対照的な方法に依存していません。 ESIの1つの欠点は、同じ加速電圧で、従来のTEMより薄いセクションを必要とすることです?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Roger Tsien for providing us with the miniSOG constructs. Dr. Xuejun Sun for help with the TEM. Lisa Lem, and Peter Shipple from the Cross Cancer Institute for supplying oxygen. Hilmar Strickfaden holds a postdoctoral fellowship by the Alberta Cancer foundation and was supported by the Bayrische Forschungsallianz. This work was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research and Alberta Cancer Foundation.
Materials
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Gridded 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-2-14-CGRD | not made for immersion objectives |
| LR White: acryl resin | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Osmium Tetroxide | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | might even work with older versions | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | might even work with older versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesium 137 radiation source "MARK 1" | (J.L. Shepherd & Associated) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Diatome | ||
| Trimming Knife ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydrate | emsdiasum | 12300 | Caution Toxic! |
| Glutaraldehyde EM Grade 8% | emsdiasum | 16020 | Caution Toxic! |
| Sodium phosphate dibasic | emsdiasum | 21180 | |
| Sodium phosphate monobasic | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldehyde | emsdiasum | 19202 | |
| Osmium tetroxide 4% solution | emsdiasum | 19150 | |
| Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Hydrochloric Acid | Fisherbrand | A142-212 | |
| Sodium Hydroxide Solution 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygen | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Potassium cyanide | Sigma | 207810 | Caution Toxic! |
| Ethanol | emsdiasum | 15058 | Caution Toxic! |
| Razor blade Single Edge Carbon Steel | emsdiasum | 71960 | Caution Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | lifetechnologies | 16000-044 | |
| G418 | lifetechnologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Transmission Electron Microscope 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Energy filter | Gatan |
References
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