Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)
Summary
Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.
Abstract
Die Grenzen der optischen Auflösung und der Herausforderung der Identifizierung von spezifischen Proteinpopulationen in der Transmissionselektronenmikroskopie wurden Hindernisse in der Zellbiologie. Viele Phänomene können durch in vitro-Analyse, ein vereinfachtes System erläutert und benötigen zusätzliche Strukturinformationen in situ, insbesondere im Bereich zwischen 1 nm und 0,1 & mgr; m, um vollständig zu verstehen. Hier Elektronen spektroskopische Bildgebung, eine Transmissions-Elektronenmikroskopie-Technik, die gleichzeitige Abbildung der Verteilung der Proteine und Nukleinsäuren ermöglicht, und ein Ausdruck tag, miniSOG, kombiniert werden, um die Struktur und Organisation der DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur-Foci studieren.
Introduction
Trotz der erheblichen Fortschritte in der Lichtmikroskopie in den letzten Jahren 1, Zellbiologen leiden immer noch unter einer Lücke in Auflösung. Dies begrenzt Verständnis der Struktur-Funktionsbeziehungen in grundlegenden zellulären Prozesse, die eine koordinierte Zusammenspiel von makromolekularen Komplexen beinhalten (zB in Chromatin-Remodeling, DNA-Reparatur, die RNA-Transkription und DNA-Replikation). Obwohl Transmissions-Elektronenmikroskopen (TEM) s die erforderliche Auflösung, es schwierig war, diese Prozesse strukturell wegen der Unfähigkeit zu definieren, um bestimmte Proteine zu markieren gleichzeitig in der Lage, die biochemische Zusammensetzung der visualisierten Strukturen zu bestimmen. In Abwesenheit von internen Membranen zur Unterscheidung der Kernstrukturen wurde der Kern eine besonders anspruchsvolle Aufgabe. Elektronenspektroskopie-Bildgebung (ESI) löst einige dieser Beschränkungen, indem sie den gleichzeitigen Nachweis und die Differenzierung von DNA, RNA und protein-basierten Kernstrukturen 2-5.
Electron spektroskopischen Bildgebung:
Um elementaren Verteilungen mit hoher Empfindlichkeit und Auflösung im Elektronenmikroskop abzubilden, kann man ein Bildgebungsspektrometer, die Elektronen, die unelastisch durch Wechselwirkungen mit Innenschale Elektronen eines Elements in der Probe 6 wurde zerstreut wählt verwenden. Weil elementspezifischen Energiemengen als Folge der Ionisation von Atomen in der Probe verloren geht, können diese Elektronen getrennt und visualisiert unter Verwendung eines Spektrometers, das Elektronenmikroskop befestigt werden. Somit Analyse des Spektrums der Elektronen, die mit der Probe in Wechselwirkung getreten zeigt die qualitative und quantitative Informationen über die elementare Zusammensetzung der Probe 7. Elektronen, die keine Energie verlieren, wenn die durch die Probe werden in der "Null-Verlust-Spitze" des Elektronen-Energieverlust gefundenSpektrum. Die Fülle dieser Elektronen zu der Masse, Dichte und Dicke der Probe bezogen ist und der Elektronen, die durch die Probe passieren, ohne mit der Probe oder Energie beim Durchgang durch die Probe zu verlieren besteht. Diese Information kann für die absolute Quantifizierung der Anzahl von Atomen eines bestimmten Elements in der vorliegenden Probe 8 ist.
Da biologische Proben bestehen hauptsächlich von Lichtelementen, die schlecht in den einfallenden Strahl der TEM lenken die Elektronen, Färbeverfahren unter Verwendung von Schwermetallsalzen werden müssen, um den Kontrast in der Probe zu erzeugen, aufgebracht werden. Die mangelnde Spezifität der meisten dieser Kontrastmittel und die Unfähigkeit, mehr als ein Fleck, wo Spezifität möglich visualisieren hat den Wert der herkömmlichen Elektronenmikroskopie bei der Untersuchung des Kerns beschränkt. ESI hat signifikante Vorteile gegenüber herkömmlichen TEM, insbesondere für die Untersuchung von Strukturen des Zellkerns.Es ist möglich, die phosphorreichen Natur der DNA- und RNA-enthaltenden makromolekularen Komplexen auszunutzen Nucleoprotein-Komplexe aus Protein-Komplexe zu unterscheiden und verschiedene Nucleoproteinkomplexen ihre Dichte von Nukleinsäuren zu lösen. Der verbleibende biologische Material kann auf der Grundlage seiner Fülle von Stickstoff abgebildet werden. Mapping nur diese beiden Elemente und Analyse von deren Verteilung und relative Häufigkeit innerhalb der verschiedenen anatomischen Strukturen bietet uns eine Vielzahl von Informationen über den Zellkern. Zum Beispiel ist es einfach, Chromatin und den Ribosomen in der Karte darstellt Phosphor Fluss identifizieren. Die interchromatin Raum Kernporenkomplexe und Kernkörper, andererseits leicht in der Stickstoffkartenbild detektiert werden.
Mini Singulett-Sauerstoff-Generator-System (miniSOG)
Während ESI stellt eine leistungsfähige Technik, um in situ Chromatinstruktur zu studieren, weil es,s Vorteil der charakteristischen Verhältnisse in elementare Zusammensetzung von Phosphor und Stickstoff, kann die Elementzusammensetzung in der Regel nicht verwendet werden, um zwischen den verschiedenen Populationen von Protein-Komplexen zu unterscheiden. Antikörper mit kleinen Goldpartikel im Nanometerbereich markiert wurden allgemein verwendet, um die Lage der einzelnen Moleküle abzubilden. Da die Goldpartikel in der Regel zu einem sekundären Antikörper gebunden ist, wird es in einem Umkreis von etwa 20 nm auf der durch den primären Antikörper nachgewiesen Epitop angezeigt. In Posteinbettungsproben können Antikörper nur die Epitope, die an der Oberfläche der Abschnitte freiliegen detektieren. Während es möglich ist, die Anwesenheit eines Antigens nachzuweisen und in Beziehung zu einer bestimmten anatomischen Struktur der Zelle, die Information, die erhalten wird, nicht vollständig ist, da die meisten der Epitope durch Harz verdeckt. Pre-Einbettungstechniken, die ähnliche Protokolle zu denen für die Fluoreszenzmikroskopie verwendet verwenden, erlauben den Zugriff auf Antigene in ganzdie gesamte Tiefe der Probe, aber die Permeabilisierung Schritte, die erforderlich sind, damit der Antikörper an die Zelle eindringen erfordern typischerweise die Entfernung von Lipidmembranen und Komponenten, die nicht durch Aldehyde fixiert werden können, zu entfernen. Darüber hinaus ist die bevorzugte Aldehyd Fixiermittel für Ultra Konservierung, Glutaraldehyd, üblicherweise zerstört Epitopen und folglich wird Paraformaldehyd in der Regel erforderlich. Dies ist weniger effektiv bei der Protein-Protein-Vernetzung. Ein weiterer Nachteil von Antikörpern, die mit einer Gold-Nanoteilchen bezeichnet werden, ist, daß Gold ein sehr elektronendichtes Material, das einen starken Kontrast, die interessante strukturelle Details der Probe, die schwächeren Kontrast hat verschleiern kann erzeugt.
Die Entstehung des grünen fluoreszierenden Proteins (GFP) als ein exprimiertes Protein-Tag hat die Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie, um Fragen in der Zellbiologie Antwort umgewandelt. Tagging ein Protein mit einem kleinen Leuchtstoff Domäne ermöglicht Abbildung von seiner Verteilung in vivo </em> ohne Permeabilisierung Verfahren, die die Struktur verändern können. Um die elegante Prinzip der Verwendung von Protein-Tags, um die Proteinverteilungen Karte in einer Zelle Elektronenmikroskopie zu übersetzen, wurde ein System benötigt, das in der Lage ist, ein Signal in der Nähe der Struktur von Interesse produzieren und erzeugen Kontrast in der TEM ist. Polymerisierten Diaminobenzidin ist ein Flecken, die oft in der Histologie verwendet wird, um Antikörper nachzuweisen verbindlich. Diese Färbung wird üblicherweise unter Verwendung von Meerrettichperoxidase (HRP) an einen sekundären Antikörper konjugiert abgeschieden. Obwohl die Reaktion ein zuverlässiges Ergebnis ist HRP nicht in das Cytosol der Zellen 9 katalytisch aktiv. Die Reaktionsprodukte von HRP kann auch diffundieren weg von der Stelle der Erzeugung, so dass ihre Auflösung ist schlechter als der Nanogold-Verfahren 10. Um diese Probleme zu umgehen, wurde der Flash / ReAsH System 11 entwickelt. Es besteht von rekombinanten Fusionsproteinen, die ein Tetracysteinmotiv Motiv besitzen. Dieses Motiv ermöglicht die Bindung vona biarsenic Fluorophor. Wenn sie erregt werden, wird das gebundene Flash oder ReAsH Lage, den hochreaktiven Singulett-Sauerstoffs und somit photoconvert Diaminobenzidin (DAB) in einem Polymer, das unmittelbar am Ort der markierten Proteine Ausscheidungen zu erzeugen. Der DAB-Polymer kann mit Osmiumtetroxid, die Elektronendichte ist, und kann somit verwendet werden, um die Verteilung des rekombinanten Fusionsproteins in der TEM abzubilden gefärbt werden.
Im Jahr 2011 Shu et al. 10 präsentiert den miniSOG System, das aus einem kleinen 106 Aminosäuren Fusion-Tag aus einem Flavoprotein von Arabidopsis, die Leuchtstoff und in der Lage, viele Singulett-Sauerstoff-Radikale, wenn sie mit 448 nm blaues Licht angeregt zu erstellen ist abgeleitet aus. Jene Singulettsauerstoff Reste können photo oxidize Diaminobenzidin verwendet werden, um Polymere an und nahe der Oberfläche der markierte Protein, das wesentlich näher als Immunogold markierten Antikörpern 11 bilden. Während der Blitz / ReAsH System erfordert womit sich die FluorChrom und das Diaminobenzidin in die Zellen, bevor Sie die Photokonversion, die miniSOG System benötigt nur Diaminobenzidin und leicht und außerdem ist etwa so effektiv zweimal bei Polymerisation von Diaminobenzidin. Hier wird miniSOG in Kombination mit ESI, um die Ultrastruktur von DNA-Reparatur-Foci Karte eingesetzt.
DNA-Reparatur-Foci (DRF)
Nicht reparierten DNA-Doppelstrangbrüche stellen eine ernsthafte Bedrohung für die Zelle, da sie für die Umsiedlung und den Verlust der genetischen Information zu führen. Wiederum kann dies Seneszenz, Krebs und Zelltod führen. Viele Proteine, die an DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur beteiligt sind, sammeln sich Schwerpunkte, die um einen DNA-Doppelstrang zusammenzubauen brechen 12-14. Obwohl ihre Funktion nicht bekannt ist, stellen sie die Website in den Zellkern, die die DNA-Doppelstrangbruch enthält, und ist der Ort von DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur.
DNA-Reparatur foci (DRF) wurden durch Fluoreszenzmikroskopie charakterisiert worden, und sie als Biomarker für DNA-Schäden 12,15 dienen. Sie sind massiv in Bezug auf die Größe des Doppelstrangbruch und wurden als relativ homogen bis in die jüngste superauflösende Mikroskopie Studien zeigten einige Anzeichen von Unter Abschottung der Moleküle innerhalb jedes konzentrieren 16. Um zu verstehen, wie diese Seiten organisiert sind, ist es notwendig, alle der zugrunde liegenden biologischen Strukturen relativ zueinander zu visualisieren. Dies kann nicht durch Fluoreszenz-Mikroskopie erreicht werden, ist jedoch durch Elektronenmikroskopie 17,18 möglich. Hier wird ein Verfahren beschrieben, das Elektronen-spektroskopischen Bildgebung kombiniert mit der miniSOG Methode, um das Potenzial dieses kombinierten Ansatzes zu illustrieren, um die Ultrastruktur von DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur zu erkunden.
Protocol
Representative Results
Discussion
ESI kann als ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Prüfung verschiedener Zustände des Chromatins und Ribonukleoproteine im Kern, weil es in der Lage, speziell map Bereiche, die reich an Phosphor sind, ist zu dienen. Erhöht es grundlegend die Menge an Details, die mittels eines Elektronenmikroskops erhalten werden kann, und ist nicht abhängig von unspezifischen Kontrastverfahren. Ein Nachteil ist, dass es ESI dünneren Abschnitten als herkömmliche TEM gleichzeitig Beschleunigungsspannung erfordert. Dies kann d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Roger Tsien for providing us with the miniSOG constructs. Dr. Xuejun Sun for help with the TEM. Lisa Lem, and Peter Shipple from the Cross Cancer Institute for supplying oxygen. Hilmar Strickfaden holds a postdoctoral fellowship by the Alberta Cancer foundation and was supported by the Bayrische Forschungsallianz. This work was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research and Alberta Cancer Foundation.
Materials
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Gridded 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-2-14-CGRD | not made for immersion objectives |
| LR White: acryl resin | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Osmium Tetroxide | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | might even work with older versions | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | might even work with older versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesium 137 radiation source "MARK 1" | (J.L. Shepherd & Associated) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Diatome | ||
| Trimming Knife ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydrate | emsdiasum | 12300 | Caution Toxic! |
| Glutaraldehyde EM Grade 8% | emsdiasum | 16020 | Caution Toxic! |
| Sodium phosphate dibasic | emsdiasum | 21180 | |
| Sodium phosphate monobasic | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldehyde | emsdiasum | 19202 | |
| Osmium tetroxide 4% solution | emsdiasum | 19150 | |
| Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Hydrochloric Acid | Fisherbrand | A142-212 | |
| Sodium Hydroxide Solution 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygen | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Potassium cyanide | Sigma | 207810 | Caution Toxic! |
| Ethanol | emsdiasum | 15058 | Caution Toxic! |
| Razor blade Single Edge Carbon Steel | emsdiasum | 71960 | Caution Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | lifetechnologies | 16000-044 | |
| G418 | lifetechnologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Transmission Electron Microscope 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Energy filter | Gatan |
References
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