Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)
Summary
Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.
Abstract
I limiti della risoluzione ottica e la sfida di identificare popolazioni di proteine specifiche in microscopia elettronica a trasmissione sono stati gli ostacoli in biologia cellulare. Molti fenomeni non possono essere spiegati mediante analisi in vitro in sistemi semplificati e necessitano di ulteriori informazioni strutturali in situ, in particolare nel campo tra 1 nm e 0,1 micron, per essere pienamente compreso. Qui, electron spettroscopica di imaging, una tecnica di microscopia elettronica di trasmissione che permette la mappatura simultanea della distribuzione delle proteine e acidi nucleici, e un tag espressione, miniSOG, vengono combinati per studiare la struttura e l'organizzazione di DNA a doppio filamento break riparazione foci.
Introduction
Nonostante i progressi significativi nella microscopia ottica negli ultimi anni 1, cell-biologi soffrono ancora di una lacuna nella risoluzione. Questo limita comprensione delle relazioni struttura-funzione nei processi cellulari fondamentali che coinvolgono l'interazione coordinata tra complessi macromolecolari (ad esempio, nel rimodellamento della cromatina, la riparazione del DNA, RNA trascrizione e replicazione del DNA). Sebbene microscopi elettronici a trasmissione (TEM) s fornire la risoluzione richiesta, è stato difficile da definire questi processi strutturalmente a causa della incapacità di etichettare specifiche proteine pur essendo in grado di determinare la composizione biochimica delle strutture visualizzate. In assenza di membrane interne per aiutare a differenziare le strutture nucleari, il nucleo è stato particolarmente impegnativo. Electron spettroscopica di imaging (ESI) risolve alcune di queste limitazioni, consentendo la determinazione e differenziazione di DNA, RNA, e protein-based strutture nucleari 2-5.
Elettrone di imaging spettroscopico:
Per mappare distribuzioni elementari ad alta sensibilità e risoluzione al microscopio elettronico, si può usare uno spettrometro ad immagine che seleziona elettroni che sono stati anelasticamente dispersi attraverso le interazioni con elettroni guscio interno di un elemento nel campione 6. Poiché specifici dell'elemento quantità di energia vengono persi come conseguenza della ionizzazione degli atomi nel campione, questi elettroni possono essere separati e visualizzati usando uno spettrometro che è collegato al microscopio elettronico. Pertanto, l'analisi dello spettro degli elettroni che hanno interagito con il campione rivela informazioni qualitative e quantitative sulla composizione elementare del campione 7. Gli elettroni che non perdono energia quando passa attraverso il campione si trovano nella "picco perdita zero" della perdita di energia degli elettronispettro. L'abbondanza di questi elettroni è correlato alla massa, densità e spessore del campione e comprende elettroni che passano attraverso il campione senza urtare il campione o perdere energia durante il passaggio attraverso il campione. Queste informazioni possono essere utili per la quantificazione assoluta dei numeri di atomi di un elemento specifico presente nel campione 8.
Poiché campioni biologici consistono principalmente di elementi leggeri che mal deviano gli elettroni nel fascio incidente del TEM, metodi di colorazione utilizzando metallo pesante sali devono essere applicate in modo da generare contrasto nel campione. La mancanza di specificità della maggior parte di questi agenti di contrasto e l'incapacità di visualizzare più di una macchia in cui la specificità è possibile ha limitato il valore di microscopia elettronica convenzionale nello studio del nucleo. ESI ha vantaggi significativi rispetto TEM convenzionali, in particolare per lo studio delle strutture del nucleo cellulare.È possibile sfruttare la natura ricca fosforo di DNA e complessi macromolecolari-RNA contenente distinguere complessi nucleoproteici da complessi proteici e risolvere diversi complessi nucleoproteici basate sulla loro densità di acidi nucleici. Il materiale biologico residuo può essere ripreso in base alla sua abbondanza di azoto. Mappatura solo questi due elementi e analisi della loro distribuzione e abbondanza relativa all'interno di diverse strutture anatomiche ci fornisce un sacco di informazioni sul nucleo. Ad esempio, è facile identificare cromatina e ribosomi nella mappa rappresentano fosforo abbondanza. Lo spazio interchromatin, complessi del poro nucleare, e corpi nucleari, invece, possono essere facilmente individuati nell'immagine azoto mappa.
Mini sistema di generatore di ossigeno singoletto (miniSOG)
Mentre ESI rappresenta una potente tecnica per studiare in situ struttura della cromatina, perché ci vuoles vantaggio dei rapporti caratteristici di composizione elementare tra il fosforo e l'azoto, la composizione elementare non può essere normalmente utilizzati per discriminare tra le diverse popolazioni di complessi proteici. Anticorpi marcati con piccole particelle d'oro nella gamma nanometri sono stati ampiamente utilizzati per mappare la posizione delle singole molecole. Poiché la particella oro viene normalmente collegato a un anticorpo secondario, apparirà entro una circonferenza di circa 20 nm circa l'epitopo rilevato dal anticorpo primario. In campioni successivi-embedding, anticorpi possono rilevare solo epitopi che sono esposte alla superficie delle sezioni. Mentre è possibile dimostrare la presenza di un antigene e si riferiscono ad una certa struttura anatomica della cellula, le informazioni che si ottiene è incompleta, poiché la maggior parte degli epitopi sono oscurati da resina. Tecniche, che utilizzano protocolli simili a quelli utilizzati per la microscopia a fluorescenza Pre-embedding, consentire l'accesso agli antigeni tuttol'intera profondità del campione ma i passi permeabilizzazione necessari per consentire l'anticorpo di penetrare cella tipicamente richiede la rimozione di membrane lipidiche e rimuovere i componenti che non possono essere risolti con aldeidi. Inoltre, il fissativo aldeide preferito per la conservazione ultrastruttura, glutaraldeide, comunemente distrugge epitopi e, di conseguenza, è in genere necessario paraformaldeide. Questo è meno efficace a proteina-proteina reticolazione. Un altro svantaggio di anticorpi che sono etichettati con una nanoparticella di oro è che l'oro è un materiale molto elettron-denso che crea un forte contrasto che possono oscurare interessanti dettagli strutturali del campione, che ha più debole contrasto.
L'emergere della proteina verde fluorescente (GFP) come un tag di proteina espressa ha trasformato l'uso di microscopia a fluorescenza per rispondere alle domande di biologia cellulare. Tagging una proteina con un piccolo dominio fluorescente permette mappatura della sua distribuzione in vivo </em> senza la necessità di procedure di permeabilizzazione che possono alterare la struttura. Per tradurre il principio elegante di usare i tag proteine per mappare distribuzioni cellulari delle proteine di microscopia elettronica, un sistema era necessario che sia in grado di produrre un segnale in prossimità della struttura di interesse e generare contrasto nella TEM. Diaminobenzidina polimerizzato è una macchia che viene spesso utilizzato in istologia per rilevare legame degli anticorpi. Questa macchia è di solito depositato con perossidasi (HRP) coniugata con un anticorpo secondario. Sebbene la reazione produce un risultato affidabile, HRP non è cataliticamente attivo nel citosol delle cellule 9. I prodotti di reazione di HRP possono anche diffondono lontano dal sito di generazione in modo che la loro risoluzione è peggiore rispetto al metodo nanogold 10. Per bypassare questi problemi, il sistema / Reash Flash è stato sviluppato 11. È costituita da proteine di fusione ricombinanti che possiedono un motivo tetracysteine. Questo motivo permette vincolanteun fluoroforo biarsenic. Quando eccitato, il flash associato o Reash è in grado di generare l'ossigeno singoletto altamente reattivo e quindi photoconvert diaminobenzidina (DAB) in un polimero che precipita immediatamente al sito delle proteine tag. Il polimero DAB può essere colorato con tetrossido di osmio, che è denso di elettroni e quindi può essere utilizzato per mappare la distribuzione della proteina di fusione ricombinante nel TEM.
Nel 2011, Shu et al. 10 presentato il sistema miniSOG, che consiste in un piccolo 106 amino acidi tag fusione derivato da una flavoproteina di Arabidopsis che è fluorescente e in grado di creare molti radicali ossigeno singoletto eccitato con 448 quando nm luce blu. Tali radicali dell'ossigeno singoletto possono essere utilizzati per foto-diaminobenzidina ossidare per formare polimeri sopra e vicino alla superficie della proteina marcata, che è notevolmente più vicino di anticorpi marcati immunogold 11. Mentre il sistema di flash / Reash richiede portare il fluorocromo e la diaminobenzidina nelle cellule prima di fare il fotoconversione, il sistema richiede solo miniSOG diaminobenzidina e luce e in aggiunta è circa due volte più efficace a polimerizzazione diaminobenzidina. Qui, miniSOG è impiegato in combinazione con ESI per mappare l'ultrastruttura di riparazione del DNA focolai.
Riparazione del DNA focolai (DRF)
DNA non riparato doppie rotture dei filamenti rappresentano una grave minaccia alla cella in quanto possono portare a traslocazioni e la perdita di informazioni genetiche. A sua volta, questo può portare a senescenza, il cancro, e la morte cellulare. Molte proteine che sono coinvolte nella riparazione del DNA a doppia interruzione filo accumulano nei focolai che assemblare intorno a un DNA a doppio filamento pausa 12-14. Anche se la loro funzione non è nota, rappresentano il sito nel nucleo che contiene il DNA a doppio filamento pausa ed è il sito di DNA a doppio filamento break riparazione.
Riparazione del DNA foci (DRF) sono stati caratterizzati da microscopio a fluorescenza e servono come biomarcatori per danno al DNA 12,15. Sono massiccio rispetto alle dimensioni della pausa doppio filamento e sono stati considerati relativamente omogenea fino recenti studi di microscopia super-risoluzione rivelato alcune prove di sub-compartimentalizzazione delle molecole all'interno di ogni fuoco 16. Per comprendere come sono organizzati questi siti, è necessario visualizzare tutte le strutture biologiche sottostanti rispetto all'altro. Ciò non può essere ottenuto mediante microscopia a fluorescenza, ma è possibile attraverso microscopia elettronica 17,18. Qui, viene descritto un metodo che combina elettroni spettroscopica con il metodo miniSOG per illustrare il potenziale di questo approccio combinato di esplorare l'ultrastruttura di DNA a doppio filamento break riparazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
ESI può servire come un ottimo strumento per l'esame diversi stati di cromatina e ribonucleoproteine nel nucleo, perché è in grado di mappare in particolare le aree che sono ricchi di fosforo. Essa aumenta profondamente la quantità di dettagli che può essere ottenuta con un microscopio elettronico e non dipende opposti metodi non specifici. Uno svantaggio di ESI è che richiede sezioni sottili di TEM convenzionale alla stessa tensione di accelerazione. Questo può essere superato lavorando con sezioni ser…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Roger Tsien for providing us with the miniSOG constructs. Dr. Xuejun Sun for help with the TEM. Lisa Lem, and Peter Shipple from the Cross Cancer Institute for supplying oxygen. Hilmar Strickfaden holds a postdoctoral fellowship by the Alberta Cancer foundation and was supported by the Bayrische Forschungsallianz. This work was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research and Alberta Cancer Foundation.
Materials
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Gridded 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-2-14-CGRD | not made for immersion objectives |
| LR White: acryl resin | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Osmium Tetroxide | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | might even work with older versions | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | might even work with older versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesium 137 radiation source "MARK 1" | (J.L. Shepherd & Associated) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Diatome | ||
| Trimming Knife ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydrate | emsdiasum | 12300 | Caution Toxic! |
| Glutaraldehyde EM Grade 8% | emsdiasum | 16020 | Caution Toxic! |
| Sodium phosphate dibasic | emsdiasum | 21180 | |
| Sodium phosphate monobasic | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldehyde | emsdiasum | 19202 | |
| Osmium tetroxide 4% solution | emsdiasum | 19150 | |
| Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Hydrochloric Acid | Fisherbrand | A142-212 | |
| Sodium Hydroxide Solution 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygen | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Potassium cyanide | Sigma | 207810 | Caution Toxic! |
| Ethanol | emsdiasum | 15058 | Caution Toxic! |
| Razor blade Single Edge Carbon Steel | emsdiasum | 71960 | Caution Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | lifetechnologies | 16000-044 | |
| G418 | lifetechnologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Transmission Electron Microscope 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Energy filter | Gatan |
References
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