Визуализация miniSOG меткой репарации ДНК белков в сочетании с электронной спектроскопии изображений (ESI)
Summary
Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.
Abstract
Пределы оптическим разрешением и вызов определения конкретных групп населения белка в просвечивающей электронной микроскопии было препятствий в клеточной биологии. Многие явления не может быть объяснено с помощью анализа ин витро, в упрощенных системах и необходимость дополнительной структурной информации на месте, в частности, в диапазоне от 1 нм до 0,1 мкм, для того, чтобы полностью понять. Здесь электронной спектроскопии изображений, техника микроскопия электрона передачи, который позволяет одновременное отображение распределения белков и нуклеиновых кислот, а тег выражение, miniSOG, объединяются, чтобы изучить структуру и организацию ДНК двухцепочечной ремонта перерыв очагов.
Introduction
Несмотря на значительные достижения в световой микроскопии за последние годы 1, сотовые биологи до сих пор страдают от разрыва в резолюции. Это ограничивает понимание структурно-функциональных отношений в основных клеточных процессах, которые связаны согласованное взаимодействие между макромолекулярных комплексов (например, в хроматина, репарации ДНК, транскрипции РНК и ДНК) репликации. Хотя электронные микроскопы передачи (ТЕА) S обеспечивает требуемое разрешение, он был сложным определить эти процессы структурно из-за невозможности обозначения специфических белков в то же время быть в состоянии определить биохимический состав визуализированных структур. В отсутствие внутренних мембран, чтобы помочь дифференцировать ядерные структуры, ядро было особенно сложным. Электронной спектроскопии томография (ESI) решает некоторые из этих ограничений, позволяя одновременно регистрировать и дифференцировку ДНК, РНК и протЭйн-основе ядерных структур 2-5.
Электронной спектроскопии изображений:
Для отображения элементарных распределений при высокой чувствительности и разрешения в электронном микроскопе, можно использовать изображения спектрометр, который выбирает электроны, которые были неупругорассеянных через взаимодействие с внутренними электронами оболочки элемента в образце 6. Из-за специфичной для элемента количества энергии теряется вследствие ионизации атомов в образце, эти электроны могут быть разделены и визуализированы с помощью спектрометра, который прикреплен к электронным микроскопом. Таким образом, анализ спектра электронов, взаимодействовали с образца показывает качественную и количественную информацию о химическом составе образца 7. Электроны, которые не теряют энергию при прохождении через образец можно найти в "пик нулевых потерь" потери энергии электроновспектра. Избыток этих электронов связано с массовой плотностью, и толщины образца и состоит из электронов, проходящих через образец, не сталкиваясь с образцом или потери энергии при прохождении через образец. Эта информация может быть полезна для количественного определения абсолютного числа атомов определенного элемента настоящее в образце 8.
Так биологические образцы состоят главным образом из легких элементов, которые плохо отклонить электроны в падающем пучке ТЕА окрашивание методов с использованием соли тяжелых металлов должны быть применены для того, чтобы генерировать контраст в образце. Отсутствие специфичности большинства этих контрастных агентов и неспособности визуализировать более одного пятна, где специфичность можно ограничивает величину обычной электронной микроскопии при исследовании ядра. ESI имеет значительные преимущества по сравнению с обычными ТЭМ, в частности, для изучения структур клеточного ядра.Можно использовать фосфора богатых природу ДНК- и РНК-содержащих макромолекулярных комплексов, чтобы отличить нуклеопротеидных комплексов из белковых комплексов и решить различные нуклеопротеидных комплексы на основе их плотности нуклеиновых кислот. Остальные биологический материал могут быть отображены на основе его избытке азота. Сопоставление только этих двух элементов и анализ их распределения и относительной численности в рамках различных анатомических структур дает нам много информации о ядре. Например, это легко определить хроматин и рибосом в карте, представляющих изобилие фосфора. Интерхроматиновых пространство, ядерные поровые комплексы, и ядерные тельца, с другой стороны, могут быть легко обнаружены в карте азота изображения.
Мини система синглет генератор кислорода (miniSOG)
В то время как ESI представляет собой мощную технику для изучения на месте структуры хроматина, потому что это займетс преимуществом характерных показателей в элементного состава между фосфором и азотом, элементный состав обычно не могут быть использованы для различения разных популяций белковых комплексов. Антител, меченных с мелкими частицами золота в нанометровом диапазоне были широко используется для отображения местоположения отдельных молекул. Поскольку частиц золота, как правило, прилагается к вторичным антителом, оно появится в окружности примерно 20 нм вокруг эпитопа, обнаруженного с первичным антителом. В пост-вложение образцов, антитела могут обнаруживать только эпитопы, которые подвергаются на поверхности секций. В то время как это можно доказать наличие антигена и связать его с определенной анатомической структуры клетки, в информацию, полученную является неполной, так как большинство из эпитопов затемняется смолы. Предварительно вложение методы, которые используют протоколы подобные тем, которые используются для флуоресцентной микроскопии, разрешить доступ к антигенам всейна всю глубину образца, но шаги проницаемости, которые необходимы, чтобы позволить антителу проникают в клетку, как правило, требуют удаления липидные мембраны и удаления компонентов, которые не могут быть решены путем альдегидов. Кроме того, предпочтительным альдегидом фиксатор для сохранения ультраструктуру, глутаральдегида, обычно уничтожает эпитопы и, следовательно, параформальдегид, как правило, требуется. Это менее эффективно белок-белкового сшивки. Другим недостатком антител, которые помечены наночастиц золота в том, что золото является очень электронно-плотного материала, что создает резкий контраст, который может затенить интересные конструктивные детали образца, который имеет слабую контрастность.
Появление зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве выраженной тега белка превратил использование флуоресцентной микроскопии, чтобы ответить на вопросы в клеточной биологии. Пометка белок с небольшим флуоресцентного домена позволяет отображение его распределения в естественных условиях </eм> без необходимости процедуры проницаемости, которые могут изменить структуру. Для того, чтобы перевести элегантный принцип использования белковых теги для отображения распределения белка в клетке электронной микроскопией, система была необходима, что способна производить сигнал близка к структуре интересов и создания контраста в ПЭМ. Полимеризованный диаминобензидин это пятно, которое часто используется в гистологии, чтобы обнаружить антитела обязательными. Этот краситель, как правило, наносят при помощи пероксидазы хрена (HRP), конъюгированный с вторичным антителом. Хотя реакция производит надежный результат, ПХ не каталитически активным в цитозоле клеток 9. Продукты реакции HRP может также диффундировать от места производства таким образом, чтобы их разрешение хуже, чем методом нанозолотом 10. Для того, чтобы обойти эти проблемы, флэш-система / ReAsH был разработан 11. Он состоит из рекомбинантных слитых белков, которые обладают tetracysteine мотив. Этот мотив позволяет связываниеbiarsenic флюорофор. При возбуждении, связанный со вспышкой или ReAsH способен генерировать активные формы кислорода весьма синглетный и, таким образом, photoconvert диаминобензидина (DAB) в полимер, который выпадает в осадок сразу на месте меченых белков. Полимер DAB могут быть окрашены осмия, который электронно плотной и, таким образом, может быть использован для отображения распределение рекомбинантного слитого белка в ПЭМ.
В 2011 году Shu др. 10 представлены системы miniSOG, который состоит из небольшого 106 аминокислот слитого тега, полученной из флавопротеида из Arabidopsis, который флуоресцентные и способны создать много радикалов синглетный кислород при возбуждении 448 нм синим светом. Эти синглетных кислородные радикалы могут быть использованы для фото-окисления диаминобензидино с образованием полимеров на и вблизи поверхности меченый белок, который значительно ближе, чем immunogold меченых антител 11. В то время как система Flash / ReAsH требует чего фторхром и диаминобензидин в клетки, прежде чем делать фотоконверсии, система требует только miniSOG диаминобензидина и свет, и в дополнение примерно так эффективны дважды полимеризации диаминобензидина. Здесь miniSOG используется в сочетании с ESI с целью картирования ультраструктуры репарации ДНК фокусов.
Репарации ДНК очаги (ФПИ)
Неотремонтированного ДНК двойные разрывы ДНК представляют собой серьезную угрозу для клетки, так как они могут привести к потере транслокаций и генетической информации. В свою очередь, это может привести к старения, рака и смерти клеток. Многие белки, участвующие в ДНК двойной ремонта прядь перерыв накапливаются в очагах, что собрать вокруг ДНК двойной нити сломать 12-14. Хотя их функция не известна, они представляют собой сайт в ядре, который содержит ДНК двойной разрыв нити и этот участок ДНК двухцепочечной ремонта разрыва.
Репарации ДНК ВОКя (ФПИ) были охарактеризованы с помощью флуоресцентной микроскопии, и они служат в качестве биомаркеров для повреждения ДНК 12,15. Они массивны по сравнению с размером двухцепочечной перерыва и считались относительно однородным до недавнего микроскопия сверхвысокого разрешения не показали некоторые признаки суб-компартментализацией молекул внутри каждого рынка 16. Для того, чтобы понять, как эти сайты организованы, необходимо визуализировать все исходные биологических структур относительно друг друга. Это не может быть достигнуто с помощью флуоресцентной микроскопии, но возможно через электронную микроскопию 17,18. Здесь описан способ, который сочетает спектроскопического изображений электронов с методом miniSOG, чтобы проиллюстрировать потенциал Этот комбинированный подход, чтобы исследовать ультраструктуру репарации двухцепочечной перерыва.
Protocol
Representative Results
Discussion
ESI может служить отличным инструментом для изучения различных состояний хроматина и рибонуклеопротеинов в ядре, потому что он способен специфически карту области, которые богаты фосфором. Это глубоко увеличивает количество деталей, которые могут быть получены с помощью электронного …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Roger Tsien for providing us with the miniSOG constructs. Dr. Xuejun Sun for help with the TEM. Lisa Lem, and Peter Shipple from the Cross Cancer Institute for supplying oxygen. Hilmar Strickfaden holds a postdoctoral fellowship by the Alberta Cancer foundation and was supported by the Bayrische Forschungsallianz. This work was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research and Alberta Cancer Foundation.
Materials
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Gridded 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-2-14-CGRD | not made for immersion objectives |
| LR White: acryl resin | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Osmium Tetroxide | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | might even work with older versions | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | might even work with older versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesium 137 radiation source "MARK 1" | (J.L. Shepherd & Associated) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Diatome | ||
| Trimming Knife ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydrate | emsdiasum | 12300 | Caution Toxic! |
| Glutaraldehyde EM Grade 8% | emsdiasum | 16020 | Caution Toxic! |
| Sodium phosphate dibasic | emsdiasum | 21180 | |
| Sodium phosphate monobasic | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldehyde | emsdiasum | 19202 | |
| Osmium tetroxide 4% solution | emsdiasum | 19150 | |
| Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Hydrochloric Acid | Fisherbrand | A142-212 | |
| Sodium Hydroxide Solution 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygen | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Potassium cyanide | Sigma | 207810 | Caution Toxic! |
| Ethanol | emsdiasum | 15058 | Caution Toxic! |
| Razor blade Single Edge Carbon Steel | emsdiasum | 71960 | Caution Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | lifetechnologies | 16000-044 | |
| G418 | lifetechnologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Transmission Electron Microscope 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Energy filter | Gatan |
References
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
- Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus. Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).
- Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture. Molecular biology of the cell. 10, 2051 (1999).
- Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging. Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).
- Leapman, R. D., Ornberg, R. L. Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology. Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).
- Simon, G. T. Electron spectroscopic imaging. Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).
- Egerton, R. . Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , (2011).
- Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps. Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).
- Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope. Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS biology. 9, e1001041 (2011).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).
- Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).
- Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).
- Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).
- Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci. Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).
- Kruhlak, M. J., et al. Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks. The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).
- Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines. Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).
- Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ. Methods in enzymology. , 375-456 (2004).
- Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair. Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).
- Mortusewicz, O., et al. Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites. J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).
- Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Frontiers in genetics. 4, 135 (2013).
- Lukas, C., et al. 53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress. Nature. 13, 243-253 (2011).
- Harrigan, J. A., et al. Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells. The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).
- Aronova, M. A., et al. Reprint of ‘Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST). J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).
- Fussner, E., et al. Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming. The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).
- Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin. Cell cycle. 10, 308-322 (2011).
