Elektron Spektroskopik Görüntüleme Kombinasyonunun miniSOG Etiketli DNA Onarım Proteinler Görselleştirme (ESI)
Summary
Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.
Abstract
Optik çözünürlük ve transmisyon elektron mikroskobu spesifik protein popülasyonlarını tanımlama meydan sınırları hücre biyolojisinde engeller olmuştur. Birçok fenomen basit sistemler, in vitro analizi ile açıklanabilir ve tam anlaşılması için, bilhassa 1 nm ve 0,1 um aralığında, yerinde ek yapısal bilgi mi edilemez. Burada, elektron spektroskopi görüntüleme, protein ve nükleik asitlerin dağılımının eşzamanlı eşleme sağlayan bir transmisyon elektron mikroskobu tekniği ve bir ekspresyon etiketi miniSOG DNA çift iplik kırılım onarımı odaklarının yapısını ve organizasyonunu incelemek için bir araya getirilmektedir.
Introduction
Son yıllarda üzerinde 1 ışık mikroskobu önemli gelişmelere rağmen, hücre biyologlar hala çözünürlükte bir boşluk muzdarip. Bu makromoleküler kompleksleri arasında koordineli etkileşimi içeren temel hücresel süreçleri yapı-fonksiyon ilişkilerinin anlaşılmasını sınırlar (örneğin, kromatin yeniden, DNA onarımı, RNA transkripsiyonu ve DNA replikasyonu olarak). Transmisyon elektron mikroskopları (TEM) gerekli çözünürlüğü sağlamak s olsa da, görsel yapıların biyokimyasal kompozisyonu belirlemek mümkün olurken spesifik proteinlerin etiket yapısal yetersizlik nedeniyle bu süreçleri tanımlamak için zorlu olmuştur. Nükleer yapıları ayırt etmeye yardımcı iç membran yokluğunda, çekirdek özellikle zor olmuştur. Elektron spektroskopik görüntüleme (ESI), DNA, RNA ve prot eş zamanlı algılama ve farklılaşmasını izin vererek bu sınırlamaların bazılarını çözerNükleer yapılar 2-5 ein tabanlı.
Elektron spektroskopik görüntüleme:
Elektron mikroskobu yüksek hassasiyet ve çözünürlükte element dağılımları haritası için bir esnek olmayan numune 6 bir elemanın iç kabuk elektronları ile etkileşimleri dağılmış olan elektronların seçer bir görüntüleme spektrometresi kullanabilirsiniz. Enerji elemanı spesifik miktarlarda numune atom iyonizasyonu bir sonucu olarak kaybolur, çünkü bu elektron ayrıldı ve elektron mikroskobu bağlı bir spektrometre kullanılarak görüntülenebilir. Böylece numune ile etkileşimde elektronların spektrumunun analizi örneği 7 element kompozisyonu hakkında nitel ve nicel bilgiler ortaya koymaktadır. Numune geçerken enerji kaybetmek yok elektronlar elektron enerji kaybı "sıfır kayıp zirve" bulunurtayfı. Bu elektronların bolluğu numune kütlesi, yoğunluğu ve kalınlığı ile ilgilidir ve numune ile çarpışan veya numunenin geçişi sırasında enerji kaybı olmadan numune geçmesine elektron oluşur. Bu bilgiler, örnek 8, belirli bir eleman mevcut atomların sayıları mutlak ölçümü için yararlı olabilir.
Biyolojik örnekler heavy metal kullanarak çoğunlukla kötü TEM olay ışın elektronları saptırmak hafif elementlerin, boyama metotları oluşur beri tuzları numunedeki kontrast üretmek için uygulanmak zorundadır. Bu farklı maddeler ve yetersizlik en özgüllüğü mümkündür birden fazla leke görselleştirmek için özgüllüğü olmaması çekirdeğinin çalışmada bilinen elektron mikroskobu değeri sınırlıdır. ESI özellikle hücre çekirdeğinin yapıların çalışma, geleneksel TEM göre önemli avantajlara sahiptir.Bu protein komplekslerinden nükleoprotein kompleksleri ayırmak için ve nükleik asitlerin yoğunluklarına dayalı olarak farklı nükleoprotein kompleksleri çözmek için nitelikteki DNA- ve RNA-içeren makromoleküler kompleksler fosfor açısından zengin doğasını yararlanmak mümkündür. Kalan biyolojik madde azot bolluğu dayalı görüntülü olabilir. Farklı anatomik yapıların içindeki dağılımı ve göreceli bolluk Haritalama sadece bu iki element ve analiz çekirdeğinin hakkında bilgi bir sürü bize sağlar. Örneğin, kromatine ve fosfor bolluğu temsil harita ribozomlar tespit etmek kolaydır. Interkromatin alanı, çekirdek gözenek kompleks ve nükleer organları, diğer yandan kolayca azot harita görüntü tespit edilebilir.
Mini singlet oksijen jeneratörü sistemi (miniSOG)
ESI güçlü bir teknik temsil ederken o alır çünkü yerinde kromatin yapısı okumak içinfosfor ve azot ile elementel kompozisyon karakteristik oranların s avantajı, element bir bileşim, normal protein kompleksleri farklı popülasyonlar arasında ayrım yapmak için kullanılamaz. Nanometre aralığındaki küçük altın parçacıkları ile etiketlenmiş antikorlar yaygın tek tek moleküller yerini haritalandırmak için kullanılmıştır. Altın partikül genellikle İkincil antikora bağlı olduğu için, bu primer antikor ile tespit epitopa çapında yaklaşık 20 nm'lik bir çevresi içinde görünür. Sonrası gömme örneklerde, antikorlar tek bölümlerin yüzeyinde ortaya epitopu algılar. Bu, elde edilen bilgileri bir antijenin varlığı ispat ve hücrenin belirli bir anatomik yapıya ilişkilendirilmesi mümkün olsa da epitop en reçine ile örtülü olduğundan, tam değildir. Boyunca antijenlere erişime izin, floresan mikroskop için kullanılanlara benzer protokollerini kullanan teknikleri, Ön-gömmenumunenin tamamı derinliği ancak genellikle lipid membranların çıkarılmasını gerektirebilir ve aldehitler ile sabit olamaz bileşenleri kaldırmak antikor hücresine nüfuz sağlamak için gerekli olan permeabilizasyon adımlar. Ayrıca, ultrastrüktür korunması, glutaraldehit için tercih edilen aldehit sabitleştirici, yaygın dolayısıyla paraformaldehit tipik gereklidir epitopları tahrip ve. Bu protein-protein çapraz bağlama az etkilidir. Altın bir nanopartikül ile etiketlenmiş antikorların başka bir dezavantajı, altın zayıf kontrast örnek, ilginç yapısal detayları belirsiz olabilir güçlü bir kontrast oluşturan bir çok elektron-yoğun malzeme olmasıdır.
Bir ifade edilen protein etiketi gibi yeşil flüoresan protein (GFP) ortaya çıkması hücre biyolojisinde soruları cevaplamak için floresan mikroskopi kullanımını dönüştürdü. Küçük bir flüoresan alana sahip bir protein etiketleme in vivo dağılım eşleme sağlar </em> yapısını değiştirebilir permeabilizasyon prosedürlere gerek kalmadan. Mikroskopi elektron bir hücrede protein dağılımlarını eşleştirmek için protein etiketleri kullanarak zarif prensibini çevirmek için, bir sistem ilgi yapısına sinyal yakın üretmek ve TEM kontrast oluşturmak mümkün olduğunu gerekiyordu. Polimerize diaminobenzidinin genellikle bağlayıcı antikor tespit etmek histoloji kullanılan bir leke olduğunu. Bu leke genellikle ikinci antikoruna konjüge edilmiş yaban turpu peroksidazı (HRP) ile bırakılır. Reaksiyon, güvenilir bir sonuç üretir, ancak HRP hücrelerinin 9 sitozolünde katalitik olarak aktif değildir. Kendi çözünürlük NanoGold yöntemi 10 daha kötü olduğunu, HRP, reaksiyon ürünleri de kuşak mevkiden uzağa yayılabilir. Bu sorunları aşmak için, flash / ReAsH sistemi 11 geliştirilmiştir. Bir Tetracysteine motifine sahip olan yeniden birleştirici füzyon proteinlerinin oluşur. Bu motif bağlanmasını sağlarBir biarsenic fluorofor. Heyecan, ilişkili veya FLASH ya da ReAsH etiketli proteinlerin yerinde hemen çökeltilerin a polimere singlet oksijeni ve böylece photoconvert diaminobenzidin (DAB) üretebilir. DAB polimeri, elektron yoğun ve dolayısıyla TEM rekombinant füzyon proteininin dağılımının haritasının için kullanılabilir osmium tetroksit ile boyanmış olabilir.
2011 yılında, Shu ve ark. 10 floresan ve 448 nm mavi ışık ile uyarıldığı zaman birçok singlet oksijen radikallerini oluşturmak mümkün Arabidopsis bir flavoprotein türetilen küçük 106 amino asit füzyon etiketinin oluşan miniSOG sistemini sundu. Bu tekli oksijen radikalleri ve immünolojik etiketlenmiş antikorlar 11 önemli ölçüde daha yakın olan etiketli protein, yüzeyine yakın polimerleri oluşturmak için foto-oksidaz diaminobenzidin için kullanılabilir. Flaş / ReAsH sistem floro getiren gerektirirkenkrom ve Fotoçevrim yapmadan önce hücre içine diaminobenzidinin, miniSOG sistem sadece diaminobenzidin ve ışık gerektiren ve buna ek olarak diaminobenzidin polimerize yaklaşık iki kat etkilidir. Burada, miniSOG DNA tamir odaklarının ultra yapısını eşlemek amacıyla ESI ile bir arada kullanılmaktadır.
DNA tamir odakları (DRF)
Onlar translokasyonlarda ve genetik bilginin kaybına yol açabilir çünkü unrepaired DNA çift iplikli sonları hücreye ciddi bir tehdit oluşturmaktadır. Buna karşılık, bu yaşlanma, kanser ve hücre ölümüne yol açabilir. DNA çift iplikli sonu onarım katılan pek çok protein 12-14 kırmak DNA çift sarmalı etrafında bir araya odaklar birikir. Bunların işlevi kesin olarak bilinmemekle birlikte, bu DNA çift iplik sonu içeren ve DNA çift iplik kırılım onarımı edilir çekirdeğinde sitesini göstermektedir.
DNA tamir foci (DRF) floresan mikroskobu ile karakterize edilmiştir ve DNA hasarı 12,15 için biyomarkerların olarak hizmet vermektedir. Onlar çift iplikli mola büyüklüğüne masif göreli ve son süper çözünürlük mikroskop çalışmaları her 16 odak içinde moleküllerin alt bölümlendirme bazı kanıtlar ortaya dek görece homojen olarak kabul edildi. Bu siteler organize anlamak için, birbirine yatan biyolojik yapıların tüm göreceli görselleştirmek için gereklidir. Bu floresan mikroskobu ile elde ancak elektron mikroskobu 17,18 ile mümkün olamaz. Burada bir yöntem DNA çift sarmallı mola onarım ultrastrüktür keşfetmek için bu kombine yaklaşımın potansiyelini göstermek için miniSOG yöntemi ile elektron spektroskopik görüntüleme birleştiren açıklanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
ESI özellikle fosfor bakımından zengin olan alanlar harita yapabiliyor çünkü çekirdeğinde kromatin ve ribonükleoproteinlerin farklı durumları incelemek için mükemmel bir araç olarak hizmet verebilir. Bu derinden bir elektron mikroskobu ile elde edilen ve spesifik olmayan zıt yöntemleri bağımlı değildir olabilir ayrıntı miktarını artırır. ESI bir dezavantajı aynı hızlanan gerilimde geleneksel TEM daha ince kesitler gerektirir. Bu seri bölümleri ile çalışan veya tomografik yöntemlerle <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Roger Tsien for providing us with the miniSOG constructs. Dr. Xuejun Sun for help with the TEM. Lisa Lem, and Peter Shipple from the Cross Cancer Institute for supplying oxygen. Hilmar Strickfaden holds a postdoctoral fellowship by the Alberta Cancer foundation and was supported by the Bayrische Forschungsallianz. This work was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research and Alberta Cancer Foundation.
Materials
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Gridded 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-2-14-CGRD | not made for immersion objectives |
| LR White: acryl resin | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Osmium Tetroxide | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | might even work with older versions | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | might even work with older versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesium 137 radiation source "MARK 1" | (J.L. Shepherd & Associated) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Diatome | ||
| Trimming Knife ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydrate | emsdiasum | 12300 | Caution Toxic! |
| Glutaraldehyde EM Grade 8% | emsdiasum | 16020 | Caution Toxic! |
| Sodium phosphate dibasic | emsdiasum | 21180 | |
| Sodium phosphate monobasic | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldehyde | emsdiasum | 19202 | |
| Osmium tetroxide 4% solution | emsdiasum | 19150 | |
| Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Hydrochloric Acid | Fisherbrand | A142-212 | |
| Sodium Hydroxide Solution 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygen | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Potassium cyanide | Sigma | 207810 | Caution Toxic! |
| Ethanol | emsdiasum | 15058 | Caution Toxic! |
| Razor blade Single Edge Carbon Steel | emsdiasum | 71960 | Caution Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | lifetechnologies | 16000-044 | |
| G418 | lifetechnologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Transmission Electron Microscope 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Energy filter | Gatan |
References
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
- Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus. Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).
- Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture. Molecular biology of the cell. 10, 2051 (1999).
- Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging. Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).
- Leapman, R. D., Ornberg, R. L. Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology. Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).
- Simon, G. T. Electron spectroscopic imaging. Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).
- Egerton, R. . Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , (2011).
- Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps. Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).
- Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope. Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS biology. 9, e1001041 (2011).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).
- Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).
- Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).
- Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).
- Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci. Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).
- Kruhlak, M. J., et al. Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks. The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).
- Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines. Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).
- Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ. Methods in enzymology. , 375-456 (2004).
- Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair. Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).
- Mortusewicz, O., et al. Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites. J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).
- Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Frontiers in genetics. 4, 135 (2013).
- Lukas, C., et al. 53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress. Nature. 13, 243-253 (2011).
- Harrigan, J. A., et al. Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells. The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).
- Aronova, M. A., et al. Reprint of ‘Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST). J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).
- Fussner, E., et al. Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming. The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).
- Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin. Cell cycle. 10, 308-322 (2011).
