הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)
Summary
Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.
Abstract
הגבולות לרזולוציה אופטית והאתגר של זיהוי אוכלוסיות חלבון ספציפיות במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים היו מכשולים בביולוגיה של תא. לא ניתן להסביר תופעות רבות על ידי ניתוח במבחנה במערכות פשוטות וזקוקים למידע מבני נוסף באתר, במיוחד בטווח שבין 1 ננומטר ו 0.1 מיקרומטר, כדי להבין באופן מלא. כאן, הדמיה ספקטרוסקופיות אלקטרון, טכניקה מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים שמאפשרת מיפוי בו זמנית של ההפצה של חלבונים וחומצות גרעין, ותג ביטוי, miniSOG, משולבת כדי לחקור את המבנה וארגון של מוקדי תיקון הפסקה כפולים גדיל DNA.
Introduction
למרות ההתקדמות המשמעותית במיקרוסקופ אור בשנים האחרונות 1, תא-ביולוגים עדיין סובלים מפער ברזולוציה. זה מגביל את ההבנה של מערכות היחסים מבנה-תפקוד בתהליכים תאיים בסיסיים שכוללים את יחסי גומלין בין מתואמים מתחמי macromolecular (למשל, בשיפוץ הכרומטין, תיקון DNA, שעתוק RNA ושכפול ה- DNA). למרות שמיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים (TEM) זה לספק את הרזולוציה הנדרשת, זה כבר מאתגר להגדיר תהליכים מבני בגלל חוסר היכולת אלה לתייג חלבונים ספציפיים בעת גם להיות מסוגל לקבוע את ההרכב הביוכימי של המבנים דמיינו. בהעדר הקרום הפנימי כדי לעזור להבדיל מבנים גרעיניים, הגרעין היה מאתגר במיוחד. הדמיה ספקטרוסקופיות אלקטרונים (ESI) פותרת חלק ממגבלות אלה על ידי המאפשרים זיהוי ובידול בו זמניים של DNA, RNA, וprotעין מבוססת מבנים גרעיניים 2-5.
הדמיה ספקטרוסקופיות אלקטרונים:
כדי למפות הפצות יסודות ברגישות גבוהה ורזולוציה במיקרוסקופ האלקטרונים, אחד יכול להשתמש בספקטרומטר הדמיה שבוחר אלקטרונים שכבר פזורים inelastically דרך אינטראקציות עם אלקטרונים מעטפת פנימיים של אלמנט בדגימה 6. בגלל כמויות אלמנט ספציפי של אנרגיה הולכות לאיבוד כתוצאה מיינון של האטומים בדגימה, ניתן להפריד אלקטרונים אלה ומדמיינים באמצעות ספקטרומטר המחובר למיקרוסקופ האלקטרונים. לפיכך, ניתוח של הספקטרום של האלקטרונים שתקשרו עם הדגימה חושף מידע איכותי וכמותי על הרכב היסודות של המדגם 7. אלקטרונים שלא לאבד אנרגיה כאשר עוברים דרך הדגימה נמצאים ב" שיא אפס האובדן "של אובדן אנרגיית האלקטרוןספקטרום. השפע של אלקטרונים אלה קשור למסה, הצפיפות והעובי של הדגימה ומורכבת מאלקטרונים שעוברים דרך הדגימה ללא התנגשות עם הדגימה או לאבד אנרגיה במהלך מעבר בדגימה. מידע זה יכול להיות שימושי לכימות מוחלט של המספרים של אטומים של יסוד מסוים בהווה הדגימה 8.
מאז דגימות ביולוגיות מורכבות בעיקר של אלמנטי אור שגרוע להסיט את האלקטרונים באלומת האירוע של TEM, שיטות צביעה באמצעות מתכת כבדה מלחים צריכים להיות מיושמים על מנת ליצור ניגוד במדגם. חוסר הספציפי של רוב הסוכנים המנוגדים הללו וחוסר היכולת לחזות כתם אחד או יותר שבו סגוליות הוא אפשרי הגביל את הערך של מיקרוסקופ אלקטרונים הקונבנציונלי במחקר של הגרעין. יש ESI יתרונות משמעותיים על פני TEM הקונבנציונלי, במיוחד לחקר מבנים של גרעין התא.אפשר לנצל את טבע זרחן העשיר של דנ"א ומתחמי macromolecular המכיל RNA להבחין מתחמי nucleoprotein מקומפלקסי חלבונים ולפתור מתחמי nucleoprotein שונים המבוססים על צפיפותם של חומצות גרעין. ניתן הדמיה החומר ביולוגי שנותר מבוסס על השפע של חנקן. מיפוי רק שני אלמנטים אלה וניתוח של ההפצה שלהם ושפע יחסי בתוך מבנים אנטומיים שונים מספק לנו הרבה מידע על הגרעין. לדוגמא, קל לזהות הכרומטין והריבוזומים במפה מייצגים שפע זרחן. חלל interchromatin, מתחמים נקבוביות גרעיניים, וגופים גרעיניים, לעומת זאת, ניתן לאתר בקלות בתמונה מפת החנקן.
מערכת מחולל חמצן גופיית מיני (miniSOG)
בעוד ESI מייצג טכניקה חזקה ללמוד במבנה הכרומטין אתר כי זה ייקחיתרון של של היחסים האופייניים ברכב יסודות בין זרחן וחנקן, הרכב היסודות לא יכול בדרך כלל לשמש להפלות בין אוכלוסיות השונות של קומפלקסי חלבונים. נוגדנים שכותרתו עם חלקיקי זהב קטנים בטווח ננומטר היו בשימוש נרחב כדי למפות את המיקום של מולקולות בודדות. מאז חלקיקי הזהב הוא בדרך כלל מצורף לנוגדנים משני, היא תופיע בהיקף של כ 20 ננומטר סביב epitope זוהה על ידי הנוגדן הראשוני. בדגימות שלאחר ההטבעה, נוגדנים יכולים רק לזהות את אפיטופים שנחשפים על פני השטח של החלקים. למרות שניתן להוכיח את קיומו של אנטיגן ומתייחס זה למבנה האנטומי מסוים של התא, המידע שמתקבל אינם שלם, שכן רוב epitopes הם מוסתרים על ידי שרף. טרום הטבעת טכניקות, המשתמשות בפרוטוקולים דומים לאלה המשמשים למיקרוסקופ פלואורסצנטי, לאפשר גישה לאנטיגנים בכלכל העומק של המדגם אבל צעדי permeabilization הנדרשים על מנת לאפשר את הנוגדן לחדור לתא בדרך כלל דורש הסרת קרומי שומנים ולהסיר רכיבים שלא ניתן לתקן על ידי אלדהידים. יתר על כן, מקבע אלדהיד העדיף לשימור ultrastructure, glutaraldehyde, בדרך כלל הורס epitopes וכתוצאה מכך, נדרש בדרך כלל paraformaldehyde. זה פחות יעיל בcrosslinking חלבונים. חסרון נוסף של נוגדנים שכותרתו עם ננו-חלקיקי זהב הוא שזהב הוא חומר אלקטרון-צפוף מאוד שיוצר ניגוד חזק שיכול לטשטש פרטים מבניים מעניינים של המדגם, שבה יש ניגוד חלש.
ההופעה של חלבון הניאון הירוק (GFP) כתג חלבון הביע הפכה את השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לענות על שאלות בביולוגיה של תא. תיוג חלבון עם תחום ניאון קטן מאפשר מיפוי של ההפצה שלה בvivo </eמ '> ללא צורך בהליכי permeabilization שיכול לשנות את המבנה. כדי לתרגם את העיקרון האלגנטי של שימוש בתגי חלבון למפות הפצות חלבון בתא למיקרוסקופי אלקטרונים, הייתה צורך במערכת שהיא מסוגלת לייצר קרובה אות למבנה של עניין וליצור ניגוד בTEM. diaminobenzidine polymerized הוא כתם המשמש לעתים קרובות בהיסטולוגיה כדי לזהות נוגדנים מחייבים. כתם זה הוא בדרך כלל שהופקד באמצעות peroxidase חזרת (HRP) מצומדת לנוגדנים משני. למרות התגובה מייצרת תוצאה אמינה, HRP הוא לא catalytically פעיל בcytosol של תאים 9. תוצרי התגובה של HRP יכול גם לפזר מהאתר של ייצור, כך שהרזולוציה שלהם היא יותר גרועה מאשר בשיטת nanogold 10. כדי לעקוף בעיות אלה, המערכת / ReAsH הבזק פותחה 11. הוא מורכב מחלבוני היתוך רקומביננטי שיש מוטיב tetracysteine. מוטיב זה מאפשר קשירה שלfluorophore biarsenic. כאשר נרגש, פלאש הכבול או ReAsH הוא מסוגל לייצר חמצן תגובתי הגופייה וdiaminobenzidine כך photoconvert (DAB) לפולימר שמשקע באופן מיידי באתר של החלבונים המתויגים. פולימר DAB יכול להיות מוכתם עם tetroxide אוסמיום, אשר הוא אלקטרון צפוף ובכך יכול לשמש כדי למפות את ההפצה של חלבון היתוך רקומביננטי בTEM.
בשינה 2011, שו et al. 10 הציגו את מערכת miniSOG, אשר מורכבת תג היתוך חומצות אמינו קטן 106 נגזר מflavoprotein של ארבידופסיס שהוא ניאון ומסוגל ליצור רדיקלים רבים גופייה כאשר נרגשים עם אור כחול 448 ננומטר. אלה רדיקלים גופייה יכולים לשמש לdiaminobenzidine צילום חמצן כדי ליצור פולימרים ובסמכו לפני השטח של החלבון מתויג, שהוא במידה ניכרת קרוב יותר מנוגדנים שכותרת immunogold 11. בעוד מערכת Flash / ReAsH דורשת להביא fluoroכרום וdiaminobenzidine לתוך התאים לפני שאני עושה photoconversion, מערכת miniSOG דורשת רק diaminobenzidine ואור ובנוסף היא פי שניים יעיל בpolymerizing diaminobenzidine. כאן, miniSOG מועסק בשילוב עם ESI כדי למפות את ultrastructure של מוקדי תיקון DNA.
מוקדי תיקון DNA (DRF)
הפסקות גדיל הדנ"א כפולות מתוקן מהוות איום רציני לתא שכן הם יכולים להוביל לטרנסלוקציות ואובדן של מידע גנטי. בתורו, זה יכול להוביל להזדקנות, סרטן, ומוות של תאים. חלבונים רבים שעוסקים בתיקון הפסקת גדיל הדנ"א כפול מצטברים במוקדים שסביב להרכיב גדיל הדנ"א כפול לשבור 12-14. למרות שתפקידם אינו ידוע, הם מייצגים את האתר בגרעין המכיל את הפסקת גדיל הדנ"א הכפולה, והוא האתר של תיקון הפסקת גדיל הדנ"א כפול.
foc תיקון DNAאני (DRF) מתאפיינים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי והם משמשים כסמנים ביולוגיים לנזק לדנ"א 12,15. הם מסיביים יחסית לגודל של הפסקת גדיל פעמיים ונחשבו הומוגנית יחסית עד מחקרי מיקרוסקופ ברזולוציה הסופר האחרונים חשפו כמה עדויות של תת-מידור של מולקולות בתוך כל להתמקד 16. על מנת להבין כיצד אתרים אלו מאורגנים, יש צורך לדמיין את כל המבנים ביולוגיים הבסיסיים ביחס לזה. זה לא יכול להיות מושגת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי אבל אפשרי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים 17,18. הנה, שיטה מתוארת המשלבת הדמיה ספקטרוסקופיות אלקטרון עם שיטת miniSOG כדי להמחיש את הפוטנציאל של גישה משולבת זו כדי לחקור את ultrastructure של תיקון הפסקה כפול גדיל DNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
ESI יכול לשמש ככלי מצוין לבחינת מצבים שונים של הכרומטין וribonucleoproteins בגרעין, כי הוא מסוגל למפות במיוחד אזורים עשירים בזרחן. זה עמוק מרחיב את כמות הפרטים שניתן להשיג על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים ואינה תלוי בשיטות מנוגדות ספציפיות. אחד חסרונות של ESI הוא שהיא דורשת חלקים רזי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Roger Tsien for providing us with the miniSOG constructs. Dr. Xuejun Sun for help with the TEM. Lisa Lem, and Peter Shipple from the Cross Cancer Institute for supplying oxygen. Hilmar Strickfaden holds a postdoctoral fellowship by the Alberta Cancer foundation and was supported by the Bayrische Forschungsallianz. This work was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research and Alberta Cancer Foundation.
Materials
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Gridded 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35G-2-14-CGRD | not made for immersion objectives |
| LR White: acryl resin | emsdiasum | 14381 | |
| LR White accelerator | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets | Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Tungsten-Point Lab Pen | emsdiasum | 41148 | |
| Osmium Tetroxide | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208carbon | Cressington | ||
| Ultra microtome Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | might even work with older versions | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | might even work with older versions | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| cesium 137 radiation source "MARK 1" | (J.L. Shepherd & Associated) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Diamond Knife ultra 35° | Diatome | ||
| Trimming Knife ultratrim | Diatome | ||
| Sodium cacodylate trihydrate | emsdiasum | 12300 | Caution Toxic! |
| Glutaraldehyde EM Grade 8% | emsdiasum | 16020 | Caution Toxic! |
| Sodium phosphate dibasic | emsdiasum | 21180 | |
| Sodium phosphate monobasic | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldehyde | emsdiasum | 19202 | |
| Osmium tetroxide 4% solution | emsdiasum | 19150 | |
| Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Hydrochloric Acid | Fisherbrand | A142-212 | |
| Sodium Hydroxide Solution 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxygen | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazole | Sigma | A8056 | |
| Potassium cyanide | Sigma | 207810 | Caution Toxic! |
| Ethanol | emsdiasum | 15058 | Caution Toxic! |
| Razor blade Single Edge Carbon Steel | emsdiasum | 71960 | Caution Sharp! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | lifetechnologies | 16000-044 | |
| G418 | lifetechnologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Transmission Electron Microscope 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Energy filter | Gatan |
References
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
- Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus. Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).
- Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture. Molecular biology of the cell. 10, 2051 (1999).
- Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging. Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).
- Leapman, R. D., Ornberg, R. L. Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology. Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).
- Simon, G. T. Electron spectroscopic imaging. Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).
- Egerton, R. . Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , (2011).
- Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps. Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).
- Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope. Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).
- Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLoS biology. 9, e1001041 (2011).
- Gaietta, G., et al. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).
- Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).
- Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).
- Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).
- Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci. Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).
- Kruhlak, M. J., et al. Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks. The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).
- Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines. Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).
- Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ. Methods in enzymology. , 375-456 (2004).
- Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair. Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).
- Mortusewicz, O., et al. Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites. J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).
- Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Frontiers in genetics. 4, 135 (2013).
- Lukas, C., et al. 53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress. Nature. 13, 243-253 (2011).
- Harrigan, J. A., et al. Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells. The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).
- Aronova, M. A., et al. Reprint of ‘Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST). J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).
- Fussner, E., et al. Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming. The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).
- Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin. Cell cycle. 10, 308-322 (2011).
