Visualisation des miniSOG protéines marquées de réparation d'ADN en combinaison avec Electron imagerie spectroscopique (ESI)

Summary

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Abstract

Les limites de résolution optique et le défi de l'identification des populations de protéines spécifiques dans microscopie électronique en transmission ont été des obstacles en biologie cellulaire. Plusieurs phénomènes peuvent pas être expliqués par une analyse in vitro dans des systèmes simplifiés et ont besoin d'une information structurelle supplémentaire in situ, en particulier dans la plage comprise entre 1 nm et 0,1 pm, de manière à être entièrement compris. Ici, l'imagerie spectroscopique électronique, une technique de microscopie électronique en transmission qui permet la cartographie simultanée de la distribution des protéines et des acides nucléiques, et une étiquette d'expression, miniSOG, sont combinés pour étudier la structure et l'organisation de l'ADN double brin réparation des cassures foyers.

Introduction

Malgré les avancées significatives dans la microscopie optique au cours des dernières années ^1, biologistes cellulaires souffrent encore d'une lacune dans la résolution. Cela limite la compréhension des relations structure-fonction dans les processus cellulaires fondamentaux qui impliquent l'interaction coordonnée entre les complexes macromoléculaires (par exemple, dans le remodelage de la chromatine, la réparation d'ADN, la transcription d'ARN et la replication d'ADN). Bien que des microscopes électroniques à transmission (MET) s fournir la résolution requise, il a été difficile de définir ces processus structurellement en raison de l'incapacité à marquer les protéines spécifiques tout en étant capable de déterminer la composition biochimique des structures visualisées. En l'absence de membranes internes pour aider à différencier les structures nucléaires, le noyau a été particulièrement difficile. Electron imagerie spectroscopique (ESI) permet de résoudre certaines de ces limitations en permettant la détection simultanée et la différenciation de l'ADN, de l'ARN, et protein-base structures nucléaires ^2-5.

Electron imagerie spectroscopique:

Afin de cartographier la distribution des éléments à haute sensibilité et une résolution dans le microscope électronique, on peut utiliser un spectromètre d'imagerie qui sélectionne les électrons qui ont été inélastique par des interactions avec les électrons de coque intérieure d'un élément dans l'échantillon ^6. En raison des quantités spécifiques d'énergie éléments sont perdues à la suite de l'ionisation d'atomes dans l'échantillon, ces électrons peuvent être séparées et visualisées en utilisant un spectromètre qui est attaché à la microscopie électronique. Ainsi, l'analyse du spectre des électrons qui ont interagi avec l'échantillon révèle des informations qualitatives et quantitatives sur la composition élémentaire de l'échantillon ^7. Les électrons qui ne perdent pas d'énergie lors du passage à travers l'échantillon se trouvent dans le "pic sans perte» de la perte d'énergie d'électronsspectre. L'abondance de ces électrons est lié à la masse, la densité et l'épaisseur de l'éprouvette et est constitué d'électrons qui passent à travers l'échantillon sans entrer en collision avec l'échantillon ou la perte d'énergie lors du passage à travers l'échantillon. Cette information peut être utile pour la quantification absolue des nombres d'atomes d'un élément spécifique présent dans l'échantillon ^8.

Depuis échantillons biologiques sont essentiellement des éléments légers qui dévient mal les électrons dans le faisceau incident de TEM, les méthodes de coloration utilisant sels de métaux lourds doivent être appliquées afin de générer contraste dans l'échantillon. Le manque de spécificité de la plupart de ces agents de contraste et de l'incapacité de visualiser plus d'une tache où la spécificité est possible a limité la valeur de la microscopie électronique conventionnelle dans l'étude du noyau. ESI possède des avantages significatifs sur TEM classique, en particulier pour l'étude des structures du noyau de la cellule.Il est possible d'exploiter la nature riche en phosphore de l'ADN et de complexes macromoléculaires contenant de l'ARN à distinguer des complexes de nucléoprotéine de complexes de protéines et de résoudre les différents complexes de nucléoprotéine en fonction de leur densité d'acides nucléiques. Le matériau biologique restant peut être imagée sur la base de l'abondance de l'azote. Cartographie seulement ces deux éléments et l'analyse de leur distribution et l'abondance relative au sein de différentes structures anatomiques nous fournit beaucoup d'informations sur le noyau. Par exemple, il est facile d'identifier la chromatine et les ribosomes dans la carte représentant l'abondance de phosphore. L'espace de interchromatiniens, des complexes de pore nucléaire, corps nucléaires et, d'autre part, peuvent être facilement détectés dans l'image de mappage d'azote.

Système générateur d'oxygène singulet Mini (miniSOG)

Bien ESI représente une technique puissante pour étudier la structure de la chromatine in situ car il prendres avantage des rapports caractéristiques entre dans la composition élémentaire de l'azote et du phosphore, la composition élémentaire ne peut normalement pas être utilisé pour établir une discrimination entre les différentes populations de complexes protéiques. Les anticorps marqués avec de petites particules d'or dans la plage du nanomètre ont été largement utilisés pour cartographier l'emplacement des molécules individuelles. Depuis la particule d'or est généralement fixé à un anticorps secondaire, il apparaîtra dans une circonférence d'environ 20 nm autour de l'épitope détecté par l'anticorps primaire. Dans les échantillons de post-enrobage, les anticorps peuvent uniquement détecter les epitopes qui sont exposés à la surface des sections. Bien qu'il soit possible de prouver la présence d'un antigène et le relier à une certaine structure anatomique de la cellule, l'information qui est obtenue est incomplète, car la plupart des epitopes sont obscurcies par de la résine. Techniques, qui utilisent des protocoles similaires à ceux utilisés pour la microscopie par fluorescence pré-enrobage, pour permettre l'accès à travers les antigènestoute la profondeur de l'échantillon, mais les étapes de perméabilisation qui sont nécessaires pour permettre à l'anticorps de pénétrer dans la cellule nécessite généralement l'enlèvement de membranes lipidiques et éliminer les composants qui ne peuvent être résolus par des aldéhydes. De plus, le fixateur d'aldéhyde préféré pour la préservation du ultrastructure, le glutaraldéhyde, des epitopes communément détruit et, par conséquent, le paraformaldéhyde est généralement nécessaire. Ceci est moins efficace pour la reticulation protéine-protéine. Un autre inconvénient des anticorps qui sont marqués avec une nanoparticule d'or est que l'or est un matériau dense aux électrons qui crée un très fort contraste qui peuvent masquer des détails de structure intéressants de l'échantillon, qui présente contraste plus faible.

L'émergence de la protéine fluorescente verte (GFP) comme une étiquette de protéine exprimée a transformé l'utilisation de la microscopie à fluorescence pour répondre aux questions en biologie cellulaire. Tagging une protéine avec un petit domaine fluorescente permet la cartographie de sa distribution in vivo </em> sans la nécessité de procédures de perméabilisation qui peuvent altérer la structure. Pour traduire le principe de l'utilisation de mots-clés élégant de protéines pour cartographier les distributions de protéines dans une cellule pour la microscopie électronique, a besoin d'un système qui est capable de produire un signal à proximité de la structure d'intérêt et générer contraste dans le TEM. Diaminobenzidine polymérisé est un colorant qui est souvent utilisé en histologie pour détecter la liaison d'anticorps. Cette tache est habituellement déposé en utilisant la peroxydase de raifort (HRP) conjuguée à un anticorps secondaire. Bien que la réaction produit un résultat fiable, la HRP est catalytiquement actif non dans le cytosol des cellules ^9. Les produits de réaction de HRP peut aussi diffuser hors du site de génération de sorte que leur résolution est pire que la méthode de Nanogold ^10. Afin de contourner ces problèmes, le système / ReAsH flash a été développée ^11. Il se compose de protéines de fusion recombinantes qui possèdent un motif tétracystéine. Ce motif permet de liaisonbiarsenic un fluorophore. Quand il est excité, le flash est lié ou ReAsH capable de générer de l'oxygène singulet hautement réactif et donc photoconvert diaminobenzidine (DAB) dans un polymère qui précipite immédiatement sur le site des protéines marquées. Le polymère de DAB peut être coloré avec du tétroxyde d'osmium, qui est électrons dense et donc peut être utilisé pour cartographier la distribution de la protéine de fusion recombinante dans le TEM.

En 2011, Shu et al. ¹⁰ ont présenté le système miniSOG, qui se compose d'un petit 106 amino tag acides de fusion dérivé d'un flavoprotéine d'Arabidopsis qui est fluorescente et capable de créer de nombreux radicaux oxygène singulet lorsqu'il est excité à 448 lumière bleue nm. Ces radicaux singulet d'oxygène peuvent être utilisés pour oxyder photo-diaminobenzidine pour former des polymères sur la surface et près de la protéine marquée, ce qui est considérablement plus étroite que les anticorps marqués ¹¹ immunologique. Bien que le système FLASH / ReAsH nécessite portant le fluorole chrome et le diaminobenzidine dans les cellules avant de faire la photoconversion, le système ne nécessite que miniSOG diaminobenzidine et de la lumière et en plus est environ deux fois plus efficace à la polymérisation diaminobenzidine. Ici, miniSOG est utilisé en combinaison avec ESI afin de cartographier l'ultrastructure de réparation de l'ADN foyers.

Réparation de l'ADN foyers (DRF)

ADN non réparé des cassures double brin constituent une grave menace à la cellule, car ils peuvent conduire à des translocations et la perte de l'information génétique. À son tour, cela peut conduire à la sénescence, le cancer et la mort cellulaire. Beaucoup de protéines qui sont impliquées dans l'ADN réparation des cassures double brin accumulent dans les foyers que assembler autour d'un double brin d'ADN briser ^12-14. Bien que leur fonction ne soit pas connu, ils représentent le site dans le noyau qui contient le double rupture de brin d'ADN et est le site de l'ADN double brin réparation des cassures.

Réparation de l'ADN foci (DRF) ont été caractérisés par microscopie à fluorescence et ils servir de biomarqueurs pour dommages à l'ADN ^12,15. Ils sont énormes par rapport à la taille de la cassure double brin et ont été considérés comme relativement homogène jusqu'à ce que des études récentes de microscopie de super-résolution ont révélé des preuves de sous-cloisonnement des molécules au sein de chaque concentrent ^16. Afin de comprendre comment ces sites sont organisées, il est nécessaire de visualiser toutes les structures biologiques sous-jacents rapport à l'autre. Cela ne peut être obtenu par microscopie à fluorescence, mais est possible grâce à la microscopie électronique ^17,18. Ici, on décrit un procédé qui combine électronique imagerie spectroscopique avec la méthode miniSOG pour illustrer le potentiel de cette approche combinée pour explorer l'ultrastructure de double brin de réparation des cassures de l'ADN.

Protocol

1. Génération de miniSOG lignées cellulaires Cultiver U2OS (de l'ostéosarcome humain) des cellules dans une boîte de 35 mm contenant 2 ml de bas glucose milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), qui est complété avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 atmosphère. Transfecter les cellules quand elles sont confluentes à 80% par lipofection avec la qualité de transfection purifié (A269 / rapport 280 de 1,8 à 2,0) d…

Representative Results

ESI En comparant les images du noyau ESI (figure 1) avec les images de TEM classiques (par exemple, la figure 1.7) révèle une augmentation spectaculaire des structures anatomiques qui peuvent être facilement distingués. Les crêtes de la chromatine apparaissent en jaune et il est assez facile d'identifier les chromocentres dans les cellules de souris. Nucléoles peut être facilement distinguée de …

Discussion

ESI peut servir comme un excellent outil pour examiner les différents états de la chromatine et ribonucléoprotéines dans le noyau, car il est capable de cartographier précisément les zones qui sont riches en phosphore. Il augmente profondément la quantité de détails qui peut être obtenue par un microscope électronique et ne dépend pas de méthodes non spécifiques contrastées. Un inconvénient de ESI est qu'il nécessite des sections plus minces que TEM conventionnelle à la même tension d'accélé…

Materials

35 mm glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Gridded 35 mm glass bottom dishes	MatTek	P35G-2-14-CGRD	not made for immersion objectives
LR White: acryl resin	emsdiasum	14381
LR White accelerator	emsdiasum	14385
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets	Sigma	D5905
Slim Bar Grids 300 Mesh	SPI	1161123
Tungsten-Point Lab Pen	emsdiasum	41148
Osmium Tetroxide	emsdiasum	19100
Carbon Coater 208carbon	Cressington
Ultra microtome Leica EM UC6	Leica
Photoshop CS5	Adobe		might even work with older versions
Digital Micrograph V.2.30	Gatan		might even work with older versions
Hoechst 33342	Sigma	H-1399
Effectene	Quiagen
MiniSOG-Constructs	Tsien-Lab		tsienlab@yahoo.com
MDC1 miniSOG mCherry
53BP1 miniSOG mCherry
Rad52 miniSOG mCherry
cesium 137 radiation source "MARK 1"	(J.L. Shepherd & Associated)
ImageJ/FiJi	open source		http://fiji.sc/Fiji
2 ml Eppendorf tubes	Fisherbrand	05-408-146
Diamond Knife ultra 35°	Diatome
Trimming Knife ultratrim	Diatome
Sodium cacodylate trihydrate	emsdiasum	12300	Caution Toxic!
Glutaraldehyde EM Grade 8%	emsdiasum	16020	Caution Toxic!
Sodium phosphate dibasic	emsdiasum	21180
Sodium phosphate monobasic	emsdiasum	21190
Paraformaldehyde	emsdiasum	19202
Osmium tetroxide 4% solution	emsdiasum	19150
Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M	Zeiss
Hydrochloric Acid	Fisherbrand	A142-212
Sodium Hydroxide Solution 10M	Fluka	72068
Oxygen	Medigas
3-Amino-1,2,4-triazole	Sigma	A8056
Potassium cyanide	Sigma	207810	Caution Toxic!
Ethanol	emsdiasum	15058	Caution Toxic!
Razor blade Single Edge Carbon Steel	emsdiasum	71960	Caution Sharp!
DMEM	Sigma	D 5546
FBS	lifetechnologies	16000-044
G418	lifetechnologies	11811-023
DMSO	Sigma	D2650
Transmission Electron Microscope 200 kV	JEOL	2100
GIF Tridiem 863 Energy filter	Gatan