بروتوكول للثلاثي الأبعاد متحد البؤر تحليل المظهرية من النجمية
Summary
Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.
Abstract
كما الخلايا الدبقية في الدماغ، الخلايا النجمية لها أدوار وظيفية متنوعة في الجهاز العصبي المركزي. في ظل وجود مؤثرات الضارة، النجمية تعديل خصائصها الوظيفية والهيكلية، وهي حالة تسمى دباق النجمي رد الفعل. هنا، يتم تقديم بروتوكول للتقييم الخصائص المورفولوجية من الخلايا النجمية. ويشمل هذا البروتوكول الكمي من 12 معلمات مختلفة أي مساحة وحجم الأنسجة من قبل (إقليم نجمية) نجمية المشمولة، ونجمية بأكملها بما في ذلك الفروع، وخلايا الجسم، والنواة، وكذلك الطول الإجمالي وعدد من الفروع، وشدة من مناعية مضان من الأجسام المضادة المستخدمة للكشف عن نجمية، وكثافة نجمية (رقم / 1000 ميكرون 2). لهذا الغرض تم إنشاء ثلاثية الأبعاد (3D) الصور المجهرية مبائر، وصورة 3D برامج التحليل مثل Volocity 6.3 كان يستخدم لقياس. أنسجة المخ الفئران المعرضة للاميلويد بيتا 1-40 </واستخدمت الفرعية> (Aβ 1-40) مع أو بدون تدخل علاجي لتقديم الأسلوب. ويمكن أيضا أن هذا البروتوكول استخدامها ل3D تحليل المورفومترية من الخلايا الأخرى في الجسم الحي من أي أو في ظروف المختبر.
Introduction
في صحي الجهاز العصبي المركزي (CNS)، النجمية تلعب دورا هاما في تنظيم تدفق الدم، واستقلاب الطاقة، وظيفة متشابك واللدونة، والأيونات خارج الخلية والعصبي التوازن 1-3. بالإضافة إلى ذلك، النجمية تستجيب للمؤثرات الضارة المختلفة وظروف غير طبيعية مثل الصدمات النفسية، والعدوى، ونقص التروية أو التنكس العصبي عن طريق رد الفعل دباق النجمي الذي يتميز تضخم وانتشارها وإعادة عرض وظيفي من الخلايا النجمية 4،5.
دباق النجمي رد الفعل يمكن أن مهندس الاستجابة الالتهابية وعملية الإصلاح في الأنسجة، وبالتالي، يمكن أن تؤثر على النتائج السريرية من التدخلات العلاجية. وفقا لذلك، وتلقى اهتماما من الخلايا النجمية الأعصاب خلال العقود الماضية كأهداف محتملة للتدخلات العلاجية لمجموعة متنوعة من الأمراض التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي.
الخلايا النجمية وعادة ما يكون شكل النجمية مع د جيدافروع efined التي تنتشر في جميع أنحاء سوما 6. في حالة المريضة في الدماغ، وفروع نجمية تصبح معقدة وتظهر نهايات منتفخة 7، على سبيل المثال في وجود بيتا اميلويد (Aβ).
تقدم هذه المقالة بروتوكول لتحليل الصور 3D من الخلايا النجمية التي حصل عليها المجهر متحد البؤر. تم قياس اثني عشر المعلمات كمية مختلفة لكل نجمية: المناطق السطحية ومجلدات من الأراضي نجمية (الأنسجة من قبل نجمية المغطاة)، الخلية بأكملها (بما في ذلك فروع)، خلايا الجسم، والنواة. ويبلغ طول وعدد من الفروع؛ كثافة مضان من الأجسام المضادة المستخدمة للكشف عن نجمية. وكثافة الخلايا النجمية (رقم / 1000 ميكرون 2). لهذا الغرض، وكنا أقسام الدماغ من الفئران التي عرضت لintrahippocampal حقن Aβ 1-40 مع أو بدون العلاج جينيستين باعتباره مادة مضادة للالتهابات. بروتوكول صفها يمكن استخدامها لالمورفومترية لalysis من أنواع مختلفة من الخلايا في المختبر أو في الجسم الحي في ظروف مختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في البروتوكول الحالي، نحن العاملين 3D قياس الأشكال متحد البؤر لتقييم 12 المعلمات المختلفة التي ارتبطت نجمية التشكل. لهذا الغرض، والأنسجة قرن آمون من الفئران مع Aβ 1-40 – استخدمت دباق النجمي التي يسببها، مع أو بدون المعالجة جينيستين كعامل مضاد للالتهابات. باستخدام ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Amyloid beta 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | Keep in -70 °C |
| Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | keep in -20 °C |
| polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein | DAKO | Z0334 | |
| alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies | DAKO | ||
| Liquid Permanent Chromogen | DAKO | K0640 | |
| Liquid permanent Red Substrate Buffer | DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | Polyethoxylated castor oil – Step 1.1 |
| LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
| Image Analysis 2000 | Tekno Optic | ||
| Streotaxic apparatus | Stoelting | ||
| Graph pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |
References
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).
- Pekny, M., Nilsson, M. Astrocyte activation and reactive gliosis. Glia. 50 (4), 427-434 (2005).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
- Anderova, M., et al. Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).
- Paxinos, G., Watson, C. . A stereotaxic atlas of the rat brain. , (1998).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. J Vis Exp. (65), e4079 (2012).
- Bagheri, M., et al. Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study. PloS One. 8 (10), e76526 (2013).
- Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. Three-dimensional confocal morphometry – a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices. J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).
- Kulkarni, P. M., et al. Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images. J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).
- Wagner, D. C., et al. Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury. Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).
