Protocol voor drie-dimensionale confocale Morfometrische Analyse van Astrocytes
Summary
Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.
Abstract
Zoals gliacellen in de hersenen, astrocyten hebben uiteenlopende functionele rol in het centrale zenuwstelsel. In aanwezigheid van schadelijke stimuli, astrocyten wijzigen hun functionele en structurele eigenschappen, een aandoening die reactief astrogliosis. Hier wordt een protocol voor de beoordeling van de morfologische eigenschappen van de astrocyten gepresenteerd. Dit protocol omvat de kwantificering van 12 verschillende parameters namelijk de oppervlakte en het volume van het weefsel onder een astrocyt (astrocyten gebied), de volledige astrocyten zoals takken, cellichaam en kern, en totale lengte en het aantal vertakkingen, de intensiteit van fluorescentie immunoreactiviteit van antilichamen die voor detectie astrocyten en astrocyten dichtheid (aantal / 1000 um 2). Hiertoe driedimensionale (3D) confocale microscopische beelden werden gemaakt en 3D beeldanalyse software zoals Volocity 6,3 werd gebruikt voor metingen. Rat hersenweefsel blootgesteld aan amyloïd-bèta 1-40 </sub> (Aß 1-40) met of zonder een therapeutische interventie gebruikt om de werkwijze te presenteren. Dit protocol kan ook gebruikt worden voor 3D morfometrische analyse van andere cellen uit in vivo of in vitro omstandigheden.
Introduction
Bij gezonde centraal zenuwstelsel (CNS), astrocyten spelen een belangrijke rol bij de regulatie van de bloedstroom, energiemetabolisme, synaptische functie en plasticiteit en extracellulair ion homeostase en neurotransmitter 1-3. Bovendien astrocyten reageren op verschillende schadelijke stimuli en abnormale aandoeningen zoals trauma, infectie, ischemie of neurodegeneratie via reactieve astrogliosis die wordt gekenmerkt door hypertrofie, proliferatie en functionele vernieuwing van astrocyten 4,5.
Reactieve astrogliosis kan de ontstekingsreactie en reparatieproces in het weefsel engineering en daarom kan het klinische verloop van therapeutische interventies beïnvloeden. Dienovereenkomstig astrocyten zijn aandacht neuroloog die tijdens de laatste decennia als potentiële targets voor therapeutische interventies voor een verscheidenheid van ziekten van het CZS.
Astrocyten hebben doorgaans een stervormige vorm met goed-defined takken die verspreid over de soma 6. In een zieke toestand in de hersenen, astrocyten takken worden ingewikkelde en tonen gezwollen einden 7, bijvoorbeeld in aanwezigheid van amyloïde beta (Ap).
Dit artikel presenteert een protocol voor het analyseren van 3D-beelden van astrocyten overgenomen door confocale microscopie. Twaalf verschillende kwantitatieve parameters voor elk astrocyten werden gemeten: de oppervlakten en volumes van de astrocyten grondgebied (het weefsel onder een astrocyten), hele cel (met inbegrip van filialen), cel lichaam, en de kern; de totale lengte en het aantal vestigingen; de fluorescentie-intensiteit van antilichamen voor detectie astrocyten; en de dichtheid van de astrocyten (aantal / 1000 um 2). Hiervoor gebruikten we hersencoupes van ratten blootgesteld aan injectie van Ap 1-40 intrahippocampale met of zonder behandeling genisteïne als een anti-inflammatoire stof. De beschreven protocol kan worden gebruikt voor een morfometrischeANALYSE van verschillende celtypes in vitro of in vivo in verschillende omstandigheden.
Protocol
Representative Results
Discussion
In het huidige protocol, gebruikten we 3D confocale morfometrie evalueren 12 verschillende parameters die werden geassocieerd met astrocyt morfologie. Daartoe hippocampus weefsel van ratten Ap 1-40 – geïnduceerd astrogliose, met of zonder voorbehandeling genisteïne als een anti-inflammatoir middel gebruikt. Via 3D afbeeldingen en morfometrische software, konden we het effect van genisteïne op astrogliosis dus de morfologie van de astrocyten te tonen.
Veranderingen in d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Amyloid beta 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | Keep in -70 °C |
| Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | keep in -20 °C |
| polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein | DAKO | Z0334 | |
| alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies | DAKO | ||
| Liquid Permanent Chromogen | DAKO | K0640 | |
| Liquid permanent Red Substrate Buffer | DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | Polyethoxylated castor oil – Step 1.1 |
| LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
| Image Analysis 2000 | Tekno Optic | ||
| Streotaxic apparatus | Stoelting | ||
| Graph pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |
References
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).
- Pekny, M., Nilsson, M. Astrocyte activation and reactive gliosis. Glia. 50 (4), 427-434 (2005).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
- Anderova, M., et al. Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).
- Paxinos, G., Watson, C. . A stereotaxic atlas of the rat brain. , (1998).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. J Vis Exp. (65), e4079 (2012).
- Bagheri, M., et al. Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study. PloS One. 8 (10), e76526 (2013).
- Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. Three-dimensional confocal morphometry – a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices. J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).
- Kulkarni, P. M., et al. Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images. J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).
- Wagner, D. C., et al. Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury. Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).
