Protocole pour tridimensionnelle confocale Analyse morphométrique des astrocytes
Summary
Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.
Abstract
Comme les cellules gliales dans le cerveau, les astrocytes ont divers rôles fonctionnels dans le système nerveux central. En présence de stimuli nocifs, les astrocytes modifier leurs propriétés fonctionnelles et structurales, une condition appelée astrogliose réactif. Ici, un protocole pour l'évaluation des propriétés morphologiques des astrocytes est présenté. Ce protocole inclut la quantification des 12 paramètres différents à savoir la zone de surface et le volume du tissu couvert par un astrocyte (territoire des astrocytes), l'ensemble des astrocytes notamment les branches, le corps de la cellule, et le noyau, ainsi que la longueur totale et le nombre de branches, l'intensité de fluorescence immunoréactivité des anticorps utilisés pour la détection des astrocytes, des astrocytes et de la densité (nombre / 1000 um 2). A cet effet en trois dimensions (3D) des images microscopiques confocales ont été créés, et des logiciels d'analyse d'images 3D comme Volocity 6.3 a été utilisé pour les mesures. Les tissus du cerveau de rat exposés à la bêta-amyloïde 1-40 </sub> (Aß 1-40), avec ou sans une intervention thérapeutique a été utilisé pour présenter la méthode. Ce protocole peut également être utilisé pour la 3D analyse morphométrique d'autres cellules provenant soit in vivo soit in vitro dans des conditions.
Introduction
En bonne santé du système nerveux central (SNC), les astrocytes jouent un rôle important dans la régulation de la circulation sanguine, le métabolisme énergétique, la fonction et la plasticité synaptique, et l'ion extracellulaire et neurotransmetteur homéostasie 1-3. En outre, les astrocytes répondent à différents stimuli nocifs et les conditions anormales telles qu'un traumatisme, une infection, une ischémie ou une neurodégénérescence via astrogliose réactif qui est caractérisée par une hypertrophie, la prolifération et le remodelage fonctionnel de 4,5 astrocytes.
Astrogliose réactif peut concevoir la réponse inflammatoire et processus de réparation dans le tissu et, par conséquent, peuvent influer sur l'issue clinique des interventions thérapeutiques. En conséquence, les astrocytes ont retenu l'attention de neuroscientifique au cours des dernières décennies que des cibles potentielles pour des interventions thérapeutiques pour une variété de maladies affectant le système nerveux central.
Les astrocytes ont normalement une forme stellaire avec bien defined branches qui se propagent à travers le soma 6. Dans un état pathologique dans le cerveau, les branches d'astrocytes deviennent compliquées et 7 montrent un gonflement des extrémités, par exemple en présence de bêta-amyloïde (Aß).
Cet article présente un protocole d'analyse d'images 3D d'astrocytes acquises par microscopie confocale. Douze paramètres quantitatifs différents pour chaque astrocytes ont été mesurés: les surfaces et les volumes du territoire des astrocytes (tissu couverte par une astrocytes), la cellule entière (y compris les succursales), corps de la cellule, et le noyau; la longueur totale et le nombre de branches; l'intensité de fluorescence des anticorps utilisés pour la détection des astrocytes; et la densité des astrocytes (nombre / 1000 um 2). A cet effet, nous avons utilisé des coupes de cerveau de rats exposés à une injection intrahippocampique de Aß 1-40 avec ou sans traitement de génistéine en tant que substance anti-inflammatoire. Le protocole décrit peut être utilisé pour une morphométriealyse de différents types de cellules in vitro ou in vivo dans des conditions différentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans le protocole actuel, nous avons utilisé la morphométrie confocale 3D pour évaluer 12 paramètres différents qui ont été associés à la morphologie des astrocytes. A cet effet, l'hippocampe de rats tissu avec Aß 1-40 – astrogliose induit, avec ou sans prétraitement de la génistéine en tant qu'agent anti-inflammatoire ont été utilisés. En utilisant des images 3D et des logiciels morphométrique, nous avons pu montrer l'effet de la génistéine sur astrogliose-à-dire la m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Amyloid beta 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | Keep in -70 °C |
| Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | keep in -20 °C |
| polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein | DAKO | Z0334 | |
| alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies | DAKO | ||
| Liquid Permanent Chromogen | DAKO | K0640 | |
| Liquid permanent Red Substrate Buffer | DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | Polyethoxylated castor oil – Step 1.1 |
| LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
| Image Analysis 2000 | Tekno Optic | ||
| Streotaxic apparatus | Stoelting | ||
| Graph pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |
References
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