פרוטוקול לConfocal ניתוח morphometric תלת ממדי של האסטרוציטים
Summary
Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.
Abstract
כמו תאי גלייה במוח, יש לי האסטרוציטים תפקידים פונקציונליים מגוונים במערכת העצבים המרכזית. בנוכחות גירויים מזיקים, האסטרוציטים לשנות את המאפיינים הפונקציונליים ומבניים שלהם, מצב הנקרא astrogliosis תגובתי. כאן, פרוטוקול להערכה של תכונות מורפולוגיות של האסטרוציטים מוצג. פרוטוקול זה כולל כימות של 12 פרמטרים שונים כלומר את פני השטח והנפח של הרקמה מכוסה על ידי astrocyte (שטח astrocyte), כל astrocyte כולל סניפים, גוף תא, וגרעין, כמו גם אורך כולל ומספר הסניפים, העצמה של immunoreactivity הקרינה של נוגדנים המשמשים לזיהוי astrocyte, וצפיפות astrocyte (מספר / 1000 מיקרומטר 2). למטרה זו תמונות מיקרוסקופיות confocal (3D) תלת ממדים נוצרו, ותוכנת ניתוח תמונת 3D כגון Volocity 6.3 שימש למדידות. רקמת מוח חולדה נחשפה לביתא עמילואיד 1-40 </תת> (Aβ 1-40) עם או בלי התערבות טיפולית שימש להציג את השיטה. גם פרוטוקול זה יכול לשמש לניתוח morphometric 3D של תאים אחרים משני in vivo או בתנאי מבחנה.
Introduction
במערכת עצבים מרכזית בריאה (CNS), האסטרוציטים לשחק תפקיד חשוב בויסות זרימת דם, חילוף חומרים של אנרגיה, תפקוד הסינפטי וגמישות, ויון תאי ועצביים הומאוסטזיס 1-3. בנוסף, האסטרוציטים להגיב לגירויים מזיקים שונים ותנאים חריגים כגון טראומה, זיהום, איסכמיה או ניוון מוחיים באמצעות astrogliosis תגובתי אשר מאופיין על ידי יתר, הפצה ושיפוץ פונקציונלי של האסטרוציטים 4,5.
astrogliosis תגובתי יכול להנדס את התגובה הדלקתית ותהליך תיקון ברקמה, ולכן יכול להשפיע על התוצאות הקליניות של התערבויות טיפוליות. בהתאם לכך, האסטרוציטים קיבלו את תשומת לב ממדען המוח בעשורים האחרונים כיעדים פוטנציאליים להתערבויות טיפוליות עבור מגוון רחב של מחלות התוקפות את מערכת העצבים המרכזית.
בדרך כלל יש לי האסטרוציטים צורת stellate עם ד היטבסניפי efined שהתפשטו ברחבי סומה 6. במצב חולה במוח, סניפי astrocyte להיות מפותלים ולהראות קצוות נפוחים 7, למשל בנוכחות של בטא עמילואיד (Aβ).
מאמר זה מציג פרוטוקול לניתוח תמונות 3D של האסטרוציטים נרכשו על ידי מיקרוסקופיה confocal. שנים עשר פרמטרים כמותיים שונים עבור כל astrocyte נמדדו: השטח הפנים ואמצעי אחסון של שטח astrocyte (הרקמה מכוסה על ידי astrocyte), תא כולו (כולל סניפים), גוף תא, וגרעין; האורך הכולל ומספר הסניפים; עוצמת הקרינה של נוגדנים המשמשים לזיהוי astrocyte; והצפיפות של האסטרוציטים (מספר / 1000 מיקרומטר 2). לשם כך, השתמשנו חלקים במוח מחולדות שנחשפו לintrahippocampal הזרקה של Aβ 1-40 עם או בלי טיפול האיזופלוונים כחומר אנטי דלקתי. הפרוטוקול המתואר יכול לשמש לmorphometricalysis סוגי תאים שונים במבחנה או בvivo בתנאים שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול הנוכחי, אנו מועסקים morphometry confocal 3D להעריך 12 פרמטרים שונים שהיו קשורים עם מורפולוגיה astrocyte. לצורך כך, הרקמה בהיפוקמפוס של חולדות עם 1-40 Aβ – astrogliosis המושרה, עם או בלי טיפול מקדים האיזופלוונים כסוכן אנטי דלקתי היו בשימוש. על ידי שימוש בתמונות 3D ותוכנת mor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Amyloid beta 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | Keep in -70 °C |
| Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | keep in -20 °C |
| polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein | DAKO | Z0334 | |
| alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies | DAKO | ||
| Liquid Permanent Chromogen | DAKO | K0640 | |
| Liquid permanent Red Substrate Buffer | DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | Polyethoxylated castor oil – Step 1.1 |
| LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
| Image Analysis 2000 | Tekno Optic | ||
| Streotaxic apparatus | Stoelting | ||
| Graph pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |
References
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).
- Pekny, M., Nilsson, M. Astrocyte activation and reactive gliosis. Glia. 50 (4), 427-434 (2005).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
- Anderova, M., et al. Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).
- Paxinos, G., Watson, C. . A stereotaxic atlas of the rat brain. , (1998).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. J Vis Exp. (65), e4079 (2012).
- Bagheri, M., et al. Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study. PloS One. 8 (10), e76526 (2013).
- Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. Three-dimensional confocal morphometry – a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices. J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).
- Kulkarni, P. M., et al. Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images. J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).
- Wagner, D. C., et al. Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury. Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).
