アストロサイトの三次元共焦点形態学的分析のためのプロトコル
Summary
Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.
Abstract
脳内のグリア細胞のように、星状細胞は、中枢神経系における多様な機能的な役割を持っています。有害な刺激の存在下では、アストロサイトは、それらの機能的および構造的特性、反応性アストログリオーシスと呼ばれる状態を変更します。ここでは、星状細胞の形態学的特性の評価のためのプロトコルが提供されます。このプロトコルは、星状細胞（アストロサイト領土）で覆われた組織の表面積と体積、支店、細胞体、および核を含む全体のアストロサイトと同様に、枝の長さの合計と数、強度、すなわち12の異なるパラメータの定量化を含み星状細胞の検出のために使用した抗体の蛍光免疫反応性、及びアストロサイトの密度（個/1000μmで2）の。 Volocity 6.3測定のために使用されたように、この目的のために、三次元（3D）の共焦点顕微鏡画像を作成し、3D画像解析ソフトウェアかかるました。アミロイドベータ1-40に露出ラット脳組織</サブ>（Aβ1-40）治療的介入は、方法を提示するために使用されたの有無にかかわらず。このプロトコルは、 インビボまたはインビトロの条件のいずれかでの他のセルの3次元形態計測分析のために使用することができます。
Introduction
健康な中枢神経系（CNS）において、星状細胞は、血流の調節、エネルギー代謝、シナプス機能と可塑性、および細胞外イオン及び神経伝達物質の恒常性1-3の重要な役割を果たしています。また、アストロサイトは肥大、増殖およびアストロサイト4,5の機能改造することを特徴とする反応性アストログリオーシスを介した別の有害な刺激や、外傷、感染症、虚血または神経変性などの異常な状態に応答します。
反応性アストログリオーシスは、組織に炎症反応と修復プロセスを設計することができ、したがって、治療的介入の臨床転帰に影響を与えることができます。したがって、アストロサイトは、CNSに影響する種々の疾患のための治療的介入のための潜在的なターゲットとして最後の十年の間に神経科学者から注目を集めています。
アストロサイトは、通常、よくdで星状の形状を有しますソーマ6の周囲に広がる枝をefined。脳内の病的状態では、アストロサイトの枝が複雑になり、アミロイドベータ（Aβ）の存在下で、例えば、腫れ終了7を示しています 。
この記事では、共焦点顕微鏡で取得したアストロサイトの3次元画像を解析するためのプロトコルを提示します。各アストロサイトのための12の異なる定量的パラメータを測定した：アストロサイトの領土（アストロサイトで覆われた組織）の表面積と体積を、セル全体、細胞体、および核（支店を含みます）;枝の長さの合計と数。星状細胞の検出のために使用した抗体の蛍光強度。そして、アストロサイトの密度（数/千μm2で）。この目的のために、我々は、抗炎症物質としてゲニステイン処理の有無にかかわらず、Aβ1-40の海馬内注入に暴露されたラットからの脳切片を用いました。記載されているプロトコルは、形態学的ANのために使用することができますインビトロまたはインビボでの異なる条件で異なる細胞型のalysis。
Protocol
Representative Results
Discussion
現在のプロトコルでは、アストロサイトの形態と関連していた12異なるパラメータを評価するための3次元共焦点形態計測を用いました。この目的のために、Aβ1-40とラットの海馬組織–とまたは抗炎症剤としてのゲニステイン前処理なし誘発性アストログリオーシスは、使用されました。 3D画像と形態計測ソフトウェアを使用することにより、我々は、アストロサイトの形態…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Amyloid beta 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | Keep in -70 °C |
| Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | keep in -20 °C |
| polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein | DAKO | Z0334 | |
| alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies | DAKO | ||
| Liquid Permanent Chromogen | DAKO | K0640 | |
| Liquid permanent Red Substrate Buffer | DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | Polyethoxylated castor oil – Step 1.1 |
| LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
| Image Analysis 2000 | Tekno Optic | ||
| Streotaxic apparatus | Stoelting | ||
| Graph pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |
References
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