Protocolo para tridimensional confocal morfométrica Análise de astrócitos
Summary
Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.
Abstract
Como as células gliais do cérebro, astrócitos têm diversos papéis funcionais no sistema nervoso central. Na presença de estímulos nocivos, astrócitos modificar suas propriedades funcionais e estruturais, uma condição chamada astrogliosis reativa. Aqui, um protocolo para a avaliação das propriedades morfológicas dos astrócitos é apresentado. Este protocolo inclui a quantificação de 12 parâmetros diferentes ou seja, a área de superfície e o volume do tecido coberto por um astrócito (território do astrócito), toda a astrócito incluindo ramos, corpo da célula, e o núcleo, bem como o comprimento total e o número de ramos, a intensidade de fluorescência imunorreactividade de anticorpos utilizados para a detecção de astrócitos, densidade e astrócitos (número / 1.000 mM 2). Para este efeito tridimensional (3D) imagens microscópicas confocais foram criadas, e software de análise de imagem 3D, tais como Volocity 6.3 foi usado para as medições. Tecido cerebral de ratos expostos a beta-amilóide 1-40 </sub> (Ap 1-40) com ou sem uma intervenção terapêutica foi usado para apresentar o método. Este protocolo pode igualmente ser utilizado para a análise morfométrica 3D de outras células a partir de quer in vivo ou em condições in vitro.
Introduction
Em saudável o sistema nervoso central (SNC), os astrócitos desempenham um papel importante na regulação do fluxo sanguíneo, o metabolismo energético, função sináptica e plasticidade, e ião extracelular e neurotransmissor homeostase 1-3. Além disso, os astrócitos respondem a diferentes estímulos nocivos e condições anormais, tais como trauma, infecção, ou isquemia neurodegeneração através astrogliose reactivo que é caracterizada por hipertrofia, proliferação e remodelação funcional dos astrócitos 4,5.
Astrogliosis reativa pode projetar a resposta inflamatória e processo de reparo no tecido e, portanto, pode afetar o resultado clínico de intervenções terapêuticas. Por conseguinte, os astrócitos têm recebido atenção de neuroscientist durante as últimas décadas, como alvos potenciais para intervenção terapêutica para uma variedade de doenças que afectam o SNC.
Os astrócitos têm normalmente uma forma estrelada com o bem-defined ramos que se espalham ao redor da soma 6. Em uma condição de doença no cérebro, ramos de astrócitos tornar complicado e mostram extremidades inchadas 7, por exemplo na presença de beta-amilóide (Ap).
Este artigo apresenta um protocolo para a análise de imagens em 3D de astrócitos adquiridos por meio de microscopia confocal. Doze parâmetros quantitativos diferentes para cada astrócitos foram medidas: as áreas de superfície e volumes do território astrócitos (o tecido coberto por uma astrócitos), célula inteira (incluindo filiais), corpo celular e núcleo; o comprimento total e número de agências; a intensidade de fluorescência dos anticorpos utilizados para a detecção de astrócitos; e a densidade de astrócitos (número / 1.000 mM 2). Para este fim, utilizou-se secções do cérebro de ratos expostos a injecção intra-hipocampal de Ap 1-40, com ou sem tratamento genisteína como uma substância anti-inflamatória. O protocolo descrito pode ser usado para uma morfométricaANÁLISE de diferentes tipos de células, in vitro ou in vivo em diferentes condições.
Protocol
Representative Results
Discussion
No protocolo atual, foram empregados morfometria confocal 3D para avaliar 12 parâmetros diferentes que foram associados com morfologia de astrócitos. Para este efeito, o tecido do hipocampo de ratos com Ap 1-40 – foram usadas astrogliose induzida, com ou sem pré-tratamento genisteína como agente anti-inflamatório. Usando imagens 3D e software de morfometria, fomos capazes de mostrar o efeito da genisteína em astrogliosis ou seja, a morfologia de astrócitos.
As alte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Amyloid beta 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | Keep in -70 °C |
| Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | keep in -20 °C |
| polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein | DAKO | Z0334 | |
| alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies | DAKO | ||
| Liquid Permanent Chromogen | DAKO | K0640 | |
| Liquid permanent Red Substrate Buffer | DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | Polyethoxylated castor oil – Step 1.1 |
| LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
| Image Analysis 2000 | Tekno Optic | ||
| Streotaxic apparatus | Stoelting | ||
| Graph pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |
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